正交试验优化ELISA检测中TMB_HRP显色体系的研究.doc

较一致与张卉等 研究结粜荆似；撤道的敏度（一）对鉴定娃症柚株病朦细菌自样性】，与砌培养甚上的蒴落是足够的”，两种抗体救度均为：日。“等相同满病害幢测的需求，但由于本试验采坩白勺是多克降抗傩 的敏度和特异性与抗悼的纯度相，要捉岛抗体的纯度可使用单克隆抗体“提高拴测的灵敏崖刺特异性机原同旅 u65356X目敏自镕镕“u33258X“ 一u65287X ：哦 u8546X忡“。：镕一：（： 。， 女：“，目自自镕）“】女（）：一，自自 女自，）：日目自研自￥（）圳女，自日自斑自】（）：u65321X女目自目自【， ）： 自崭目目自￥【】月女学，（）： 日，“片￥性自。自目）镕，目u65357X￥毛，十月“十日，“，目镕u65298X镕自u8240X自女u65290X￥，（）：。】u65290X镕镕u65290X自女“u8734X ￥自瑚】：岫 u65343X盯u65321X。”曲啦阻日 岫“”（“洲）：【自￥女u9733X：“”“￥【】（）自）女女： ￥自日目自”。”“女 ）正交试验优化检测中显色体系的研究桑延霞，周天鸿，琼莫，邱戋兰，蒋德旗，王从峰，冉艳红，李弘剑（口南大学牛命科学与技术学院，东广州）摘要目的建口 也体系优化法优化色u32479X錾敬方法前先采】单目隶骑研究色体幕巾的缓冲溶液浓度、，帆浓度锄问u8545X蟛响，此基 。，进行 紊水平白勺u65318X盘试骑：结￥：，体系的最佳怍条件缓冲涟 澉 ，u65321X？浓崖 （），匣应温度为一脯时目，结论优化的什应条件，“槽址啦臆的站求所建立的体系的优化方万方数据年（）法也适用于其它显色系统的优化。，关键词：；正交试验；生物技术，中图分类号：文献标识码：（， 、 ， ，。 （ ， 。曲 ）：， ，舱 皓： ， 艘 ， ， 。（） ， ： ， ：；试验中的显色过程是决定试验成败的关键，在显色体系中，和的浓度，显色缓冲溶液方法显色液的配制的及显色的温度和时间是影响显色的重要因素。或浓度过低，不能使反应充分进行；而或：浓度过高，则容易导致非特异性显色或抑制酶的活性。此外，显色缓冲溶液的值对的溶解度及的活性也有一定的影响，因此提高溶解度，控制：浓度和值，精确称取溶于中配成，的储备液，置于保存。显色时。在醋酸钠一柠檬酸缓冲溶液中（，醋酸钠，柠檬酸， 。（）甘油）加入储备液和心，配制成显色液，现用现配间接法是显色的关键，同时反应时间和反应温度也是不可忽略的因素。由于涉及商业机密，显色液的配方极少公开，有关间接的方法步骤见参考文献。正交试验。一显色参数的报道也非常有限，不能满足实际需要。因此，本文通过单因素试验，初步探讨了显色体系中主要因素对显色反应的影响，并在此基础上，应用正交试验对各因素的反应参数进行了系统的优化，优选出最佳反应条件。这一方法也适用于其它的显色体统的优化。材料与方法材料实验材料短肽修饰后的胰高血糖素样肽一（）为抗原。抗原、抗的多克隆抗体及阴性血清均由作者实验室制备；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔购自公司试剂购自公司；氯化钾、氯化钠、磷酸氢二钾、十二水合磷酸二氢钠、碳酸钠、碳酸氢钠、硫酸、双氧水、吐温均为市售分析纯。收稿日期：一；修回日期：一作者简介：桑延霞（一），女，博士生，研究方向：幕因工程药物。发表论文篇：。周天鸿，男，教授，博士生导师从事医学分子遗传学和人巨细胞病毒研究，发表论文多篇。通讯作者：李弘剑（一）。女，教授，博士生导师，从事基因工程药物及人巨细胞病毒研究，发表论文余篇，：咖。万方数据以浓度、：浓度、值和反应时间和温度为考察因素。根据单因素试验的结果，选取个水平，做因素水平的正交试验聆】，每个试验做个平行，正交试验因素水平设计见表，表中、分别代表浓度、 浓度、，、反应时间和反应温度。裹正交试验因素与水平 ，剃结果与分析单因素试验浓度对显色的影响配制浓度分别为、，的显色液，配制过程中发现，浓度超过，时，出现肉眼可见沉淀。试验结果见图。当的浓度达到，时，吸光度最大。即，的可以满足一般条件下的检测的要求；当浓度超过时，吸光度开始下降，推测可能与过饱和析出生成沉淀，或生物技术年（）者非特异性的显色使本底值升高有关。（）圈对显色的影响 浓度对显色的影响配制用浓度为，：（）浓度为（），为的显色液。使显色反应分别在、，、的温度环境下进行，结果见图，反应温度在一范围内，值最大且比较稳定，当温度超过时，吸光度显著减小，可能高温条件导致酶变性，结构发生变化，从而影响了其生物活性。配制浓度为 ，：（）浓度分别为、（）的显色液，进行显色反应。结果见图，随：浓度的增大，值先是增强随后减弱。当 （）浓度为（）时，吸光度最大，当浓度高于时，随：浓度的增加，吸光度显著降低。这是因为高浓度的：使活性中心的铁离子由二价变为三价。从而使酶失去了催化功能，为确保：浓度在相对于酶过量的前提下不影响酶的活性，：的浓度应控制在一定范围内，结果表明。显色反应中：的最佳浓度为（）。（）豳对显色的影响 畔 对显色的影响配制浓度为，（）浓度为（），分别为、的显色液进行显色，结果如图，当为时显色效果较佳，当值大于或小于时值显著减小，这是因为的等电点为，中性环境下，酶的溶解度降低，分子发生聚合，空间结构发生改变，使酶丧失活性；在小于时的酸性条件下，活性中心的电子传递不能正常进行，导致酶的活性降低【。温度对显色的影响万方数据图对显色的影响 （）田温度对显色的影响 ，反应时间对显色的影响采用中配制的显色液，使显色反应在的环境下分别进行、，结果见图。当反应进行后已有绝大部分的底物参加了反应，当反应进行到后，底物全部反应完毕，此时吸光度最大；当反应时间超过后，随着时间的延长，由于空气的氧化作用使本底吸光度升高，导致显色结果的下降。为了减小空气氧化的影响显色应控制在一内。正交试验结果影响检测的因素很多，本试验选取了对显色影响较大的几个因素：和：浓度、显色温度和显色时间进行正交试验，因素水平的选取参考单因素试验的结果。由表正交试验的直观分析结果可知，个因素对显色影响的主次顺序为反应时间反应温度。由于因素的极差最小，因此将因素作为误差项，对另外个因素进行方差分析。由表可见，在本试验考察范围内，和浓度及是影响显色系统的年（）生物技术主要因素，水平间的差异具有统计学意义；而反应时间和温度均为次要因素，各水平之间差异无统计学意义。由各因素所选用的几个水平来看，显色体系的最佳反应条件为，即显色液中的浓度为，（）的浓度为（），为。反应时间为。反应温度为一。，圈反应时间对显色的影响 衰正交试验结果 讨论难溶于无机相，为了增强的溶解度，本试验在显色液中添加了甘油，显著改善了在缓冲液中的溶解性。比传统配方中的溶解度提高了倍【。稳定性也较差。仅能稳定存在几周，因此显色液需现用现配。万方数据裹正交试验的方差分析 ” 注：（，）；矗（。）。系统的显色受、浓度及、反应时间和反应温度多个因素的影响。李俚u21644X李红梅分别就上述的部分因素进行了研究。但二者仅采用了单因素试验，忽视了各因素之问的交互作用致使结果存在一定差异。与二者不同。本研究在单因索试验的基础上，选取了合理的因素水平，利用正交试验实现了多因素多水平的不同组合，充分考虑了各因素之间的交互作用。与常规的单因素试验相比，单因素试验联合正交试验优化显色体系的方法更科学、更准确。本文通过单因素试验及正交试验探讨了显色系统中影响显色的主要因素确定了这些因素影响显色反应的主次顺序为反应时间反应温度。并制订了优化这些因素的方法，利用该方法优化了显色系统的最佳反应条件为：醋酸钠一柠檬酸显色缓冲溶液的为。的浓度为，（）的浓度为（），反应时间为，反应温度为。该方法也可以用于其它显色系统的优化。考文：】， 一 稍 ： 嵋 。，（）：李云雁胡传荣试验设计与数据处理】北京：化学工业出版社。： ，岫铀眦岫 嘲住 咖岫】 瑚删瞳。（）：】洪伟，张朝晖。芦国营辣根过氧化物酶的结构与作用机制】生命的化学。（）：一撕】 。 。 。一 哪 菇删】。（）：俞彩霞赵静，王保民，等麓代硫酸钠在四甲基联苯胺贮液保存中的应用】中国农业大学学报，（）：一】李俚。张连彦，高明春，等间接酶联免疫吸附试验显色系统主要影响因素的探讨】中国善药杂志，（）：李红梅陈佳徐雯，等测定中显色体系的优化及其稳定性研究生物技术通报，（）：正交试验优化ELISA检测中TMB/HRP显色体系的研究作者：作者单位：刊名：英文刊名：年，卷(期)：参考文献(8条)桑延霞，周天鸿，陈英，邱美兰，蒋德旗，王从峰，冉艳红，李弘剑，SANG Yan-xia，ZHOU Tian-hong，CHENG Ying，QIU Mei-lan，JIANG De-qi，WANG Cong-feng，RAN Yan-hong，LI Hong-jian暨南大学生命科学与技术学院,广东广州,510632生物技术BIOTECHNOLOGY2011,21(2)1.李红梅;陈佳;徐雯 ELISA测定中TMB显色体系的优化及其稳定性研究 2010(02)2.李俚;张连彦;高明春 间接酶联免疫吸附试验显色系统主要影响因素的探讨 2008(06)3.俞彩霞;赵静;王保民 硫代硫酸钠在四甲基联苯胺贮液保存中的应用 2006(02)4.Bos ES;Van der Doelen AA;van Rooy N 3,3,5,5-Tetramethylbenzidine as an Ames test negativechromogen for horse-radish peroxidase in enzymeimmunoassay 1981(3-4)5.洪伟;张朝晖;芦国营 辣根过氧化物酶的结构与作用机制 2005(01)6.Henriksen A;Smith AT;Gajhede M The Structures of the Horseradish Peroxidase C-Ferulic Acid Complexand the Ternary Complex with Cyanide Suggest How Peroxidases Oxidize Small Phenolic Substrates1999(49)7.李云雁;胡传荣 试验设计与数据处理 20