抑癌基因P16甲基化在子宫颈癌早期诊断中的初步探讨.doc

抑癌基因P16甲基化在子宫颈癌早期诊断中的初步探讨作者：任力群,刘萍,王云霞,罗丽娅单位：深圳市福田区妇幼保健院，广东 深圳 518000【摘要】目的:通过观察抑癌基因P16异常甲基化在子宫颈癌中的阳性率，探讨抑癌基因P16异常甲基化在子宫颈癌早期诊断中的临床意义。方法:分离提取71例慢性宫颈炎患者，76例CIN患者， 36例宫颈癌患者标本中的DNA，采用巢式甲基化特异性PCR方法检测P16基因的甲基化状态。结果:在7例宫颈癌患者标本检测到了P16异常甲基化，阳性率为19.4%；在4例CIN癌患者标本中检测到了P16异常甲基化，阳性率为5.3%；健康对照者标本中P16基因无异常甲基化。结论:抑癌基因P16异常甲基化随宫颈瘤样病变的加重而阳性率增高，P16异常甲基化是宫颈发生的过程中的早期事件，对于宫颈癌的早期诊断具有重要意义。 【关键词】 宫颈癌 P16 甲基化特异性PCRDiscussion of the Value of Inhibiting Gene Methylic P16 in Early Diagnosis of Cervical CancerREN Liqun1,LIU Ping2,WANG Yunxia2,LUO Liya2(Maternal and Child Health Hospital in Futian District of Shenzhen,Shenzhen,Guangdong 518026,China) Abstract: Objective Through observing the positive rate of inhibiting gene mythylic P16 in cervical cancer,to discuss the clinical significance of inhibiting gene mythylic P16 in early diggnosis of cervical cancer. Methods Separate and distill DNA of the samples of 71 chronic cervicitis patients,76 CIN patients and 36 cervical cancer patients,to detect the cymene status of P16 gene with methylic differential nestPCR test. Results There are 8 cervical cancer patients and 4 CIN Patients,their samples are detected with abnomal methylic P16,the positive rates are 22.2% and 5.3% respectively;there are no cases detected with abnomal methylic P16 in health people. Conclusion Inhibiting gene abnomal methylic P16 become higher with cervical neoplasia,it is a early event in the process of cervical cancer.So it has important clinical significance in early diagnosis of cervical cancer. Key words: Cervical cancer;P16;Methylic differential PCRP16基因作为抑癌基因已受到广泛关注，已有文献报道P16与原发性子宫颈癌发生、发展的关系，但尚存在一些不同观点。宫颈癌是妇科常见的恶性肿瘤之一,它的发生是一多因素、多步骤的过程, 近年来的研究显示肿瘤相关基因启动子区的异常甲基化是导致抑癌基因表达失活的一个重要途径,这种过甲基化是肿瘤发生过程中的早期事件,是一种新的肿瘤分子标志物1，2。本研究通过观察抑癌基因P16启动子区的甲基化在不同级别的子宫颈宫颈瘤样病变、子宫颈癌中的阳性率，探讨P16异常甲基化在子宫颈癌早期诊断中的临床意义。11 材料与方法1.1 研究对象 研究对象的选取：取2005年7月至2007年4月在湖北省肿瘤医院及我院治疗的宫颈鳞癌患者治疗前宫颈脱落细胞及活检标本或手术切除的肿瘤标本。其中宫颈癌36例(术前未行任何治疗) ,CIN标本76 例，慢性宫颈炎患者71例为对照组。患者年龄32岁74岁,中位年龄50 岁。宫颈癌FIGO 分期期7 例,期14例, 期15 例。1.2 方法1.2.1 标本处理 P16基因检测取活检标本或手术切除的肿瘤标本，分离肿瘤组织及癌旁非肿瘤组织，按Roche公司高纯度PCR模板备用试剂盒说明分别提取基因组DNA。CIN患者及慢性宫颈炎患者同时平行测定。1.2.2 P16基因启动子区甲基化检测 采用巢式甲基化特异性PCR检测P16基因启动子区甲基化状态，检测方法3简述如下。 标本DNA的亚硫酸氢盐修饰 将CpG序列中未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶则不发生变化。修饰过程：取含DNA溶液50 μl，加入4 mol/L的NaOH至终浓度为0.2 mol/L，37变性10 min。加入30 μl新配制的10 mmol/L的氢醌及520 μl ，pH 5.0的3 mol/L的NaHSO3，表面覆盖矿物油，避光置于50水浴16 h。然后利用Wizard DNA纯化试剂盒(美国Promega公司)纯化修饰后的DNA。于室温下加入4 mol/L的NaOH至终浓度为0.3 mol/L，放置5 min20 min脱硫。最后加入1/10体积的3 mol/L乙酸纳及冰乙醇沉淀DNA，室温下干燥，加适量TE（pH 8.0）溶解，-20保存。 巢式甲基化特异性PCR检测（德国Biometra公司PCR仪） 反应总体积50 μl，经NaHSO3修饰的模板DNA约50 ng，各引物300 ng，dNTP为1.25 mmol/L，1PCR缓冲液（16.6 mmol/L硫酸铵，67 mmol/L TrisHCl, pH 8.8，6.7 mmol/L MgCl2，10 mmol/L 2巯基乙醇）。第一轮PCR使用外侧引物，反应条件为95热启动10 min，加入1.0 U TaqDNA聚合酶(美国Promega公司)，然后于95、60、72各30 s循环40次，最后于72延伸10 min。将第一轮PCR产物适当稀释（50倍），取10 μl进行第二轮PCR反应，退火温度增加到65，反应时间减少为15 s，其他条件与第一轮相同。扩增完成后取10 μl PCR产物，用2.5%的琼脂糖凝胶进行电泳，溴化乙锭染色，用凝胶成像分析仪（VILBER LOURMAT,france）进行拍照分析。1.3 统计学处理 所有数据经CS 2000医学统计软件处理，采用χ2检验对甲基化频率进行比较。2 结果P16基因子启动子区甲基化检测结果。本研究采用巢式甲基化特异性PCR检测宫颈癌患者标本中P16基因子的甲基化状态。首先用P16F外侧引物扩增出一个280 bp的P16基因启动子区片段，此外侧引物序列所对应的未修饰DNA模板中含有胞嘧啶（经亚硫酸氢盐修饰后变为胸腺嘧啶），但不含有CpG位点，因此此外侧引物既可以扩增甲基化的DNA模板，又可扩增非甲基化的DNA模板，结果全部DNA标本中均可扩增出相应片段。然后分别用P16M和P16U特异性引物进行第二次扩增，对于阳性（甲基化）标本，用甲基化和非甲基化引物扩增，都有特异性扩增产物；对于阴性（非甲基化）标本，只有非甲基化引物的扩增产物。电泳结果见图1。图1 P16基因甲基化检测结果（略）表1 各组标本P16基因甲基化检测阳性率比较（略）注:a：宫颈癌组与慢性宫颈炎组比较（P<0.001）;b:CIN组慢性组与慢性宫颈炎组比较（P<0.01）。3 讨论宫颈癌是妇科常见的恶性肿瘤之一, 对于宫颈癌的早期诊断的研究已进入分子水平，近年来的研究发现，肿瘤抑制基因（TSG）启动子区的过甲基化是导致其表达失活的一个重要原因，这种异常甲基化是肿瘤形成过程中的一个早期、频发事件，与肿瘤的发生、发展及预后关系密切。肿瘤相关基因启动子区的甲基化状态是一个高灵敏度的肿瘤分子标志物。多项研究表明TSG的失活是导致实体肿瘤发生的最重要的分子生物学基础。既往认为TSG失活有两种途径:一是基因突变；二是染色体物质丢失。目前有很多研究者提出抑癌基因甲基化是肿瘤抑制基因失活的第三种机制,且在某些情况下可能是惟一的机制4。抑癌基因P16为近年发现的与宫颈癌密切相关的抑癌基因5，6，国外报道P16基因在宫颈癌中的下降或缺失占29%87%不等，在宫颈癌中P16基因甲基化频率在15%28%,表明P16基因甲基化在宫颈癌的发生过程中可能起着重要作用。Virmani79等为了探讨异常甲基化在宫颈癌发生中的作用而进行了研究，结果表明抑癌基因P16异常甲基化大于20%，异常甲基化的发生独立于其他因素如：乳头瘤病毒感染、吸烟史或激素应用等。本研究同时检测了36例宫颈癌患者、76例CIN患者及71例慢性宫颈炎组标本抑癌基因P16甲基化状态，探讨抑癌基因P16甲基化在宫颈癌早期诊断中应用，结果显示宫颈癌组的抑癌基因P16甲基化百分率（19.4%），显著高于CIN组及慢性宫颈炎组对照组（P<0.01）。且随宫颈瘤样病变的加重（由CIN）而抑癌基因P16异常甲基化阳性率逐步增高，P16异常甲基化与宫颈癌的临床分期及病理分级均有明显关系，在晚期及恶性程度较高的组织中，其活性明显增强，因此抑癌基因P16异常甲基化检测有利于评估肿瘤的愈后。本研究结论可应用于到妇女宫颈癌的筛查，通过抑癌基因P16异常甲基化状态检测早期探知宫颈癌的发生，对宫颈癌早期诊断具有重大意义。【参考文献】1 Maruyama R,Toyooka S,Toyooka KO,et al.Aberrant promotermethylation profile of bladder cancer and its relationship to clinicopathological featuresJ.CancerRes,2001,61:86598663.2 Robertson KD,Jones PA.DNA methylation:past, present and future directionsJ.Carcinogenesis,2000,21（3）:461467.3 姚群峰，康新江，宁勇，等.巢式甲基化特异性聚合酶链反应在p16基因启动子过甲基化检测中的应用J.中华检验医学杂志，2004，27（2）：8992.4 Liu Y,Ganesan TS.Tumour suppressor genes in sporadic epithelial ovarian cancerJ.Review.Reproduction，2002,123:341353.5 原继荣，李钰，胡双玖，等.宫颈癌P16基因甲基化及表达的研究J.遗传，2005，27（1）：3943.6 宋世军，许瑞环.子宫颈癌组织P16基因突变及其蛋白表达的研究J.北华大学学报，2004，5（6）：4243.7 Virmani A k Muller C,Rathi AAberrant methylayion during cervical carcinogenesisJ.Clin Cancer Res，2001,7(3):584589.8 Dong S M,Kim H S Rha S H.Promoter hypermethylation of multip