时间分辨荧光免疫分析法与放射免疫分析法检测甲胎蛋白的效能比较.doc

时间分辨荧光免疫分析法与放射免疫分析法检测甲胎蛋白的效能比较作者：杨凤爱,林荣军,茹辽金,王征,邝敏健单位：(1.广东省阳江市人民医院检验科，广东阳江 529500;2.广州达瑞抗体工程技术有限公司，广东广州 510663)【摘要】 目的 比较时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)与放射免疫分析(RIA)两种方法检测甲胎蛋白(AFP)的效能。方法 对TRFIA与RIA两种方法测定AFP进行线性检测、精密度实验、临床对比实验及相关性分析。结果 TRFIA法检测AFP的线性范围为11210 g/L，比RIA的1900 g/L宽;检测精密度：TRFIA分析内CV%为3.8%4.3%，分析间CV%为4.9%5.8%;RIA分析内CV%为5.8%8.6%，分析间CV%为6.4%9.5%;两种方法呈显著正相关(r=0.986，P0.01)。结论 TRFIA法优于RIA法。 【关键词】 时间分辨荧光免疫分析;放射免疫分析;甲胎蛋白甲胎蛋白(alphafetoprotein, AFP)是肝细胞肝癌( hepatocellular carcinoma,HCC)诊断和判断预后首选的血清肿瘤标记物。定量检测AFP的方法主要包括酶标法(EIA)、放射免疫法(RIA)、化学发光免疫分析法(CLIA)和时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA)，目前我国常规多采用RIA法。RIA 法虽然有较高的灵敏度和准确性等优点, 但其试剂存在放射性污染，且标记物半衰期短，试剂不易保存，且检测重现性差。上个世纪80年代兴起的TRFIA法具有灵敏度高、稳定性好且无放射性污染等优点，被认为是目前最有发展前景的超微量分析方法之一1。本文是比较TRFIA法和RIA法检测AFP的效能。1 材料与方法1.1 仪器与试剂TRFIA所用检测仪器为DEFIA1235全自动时间分辨荧光免疫分析仪(美国芬兰Perkin Elmer公司产品)，AFPTRFIA试剂由达瑞抗体工程技术有限公司技术部提供，为广州达瑞抗体公司自行研制产品;RIA所用仪器为SN697全自动双探头放射免疫r计数器(上海原子核研究所日环仪器一厂产品)，AFPRIA试剂为天津九鼎医学生物工程有限公司提供(产品批号：RC40801)。操作均按各自试剂盒说明书严格进行。1.2 方法两法检测AFP均采用双抗体夹心法，TRFIA法标记物为稀土元素Eu3+，RIA法标记物为放射性元素125I。TRFIA法：AFP标准品或样品25L/孔200L分析缓冲液室温振动孵育1h洗涤液洗板3次1：75倍稀释的铕标抗体200L振动孵育1h洗涤液洗板6次增强液200L/孔振摇5min测定荧光值，自动换算AFP值(TRFIA法的正常参考范围为012U/mL,超过12U/mL判为阳性)。RIA法：100L样品+125IAFP+100L抗血清混匀，37温育3h，测总T(每分钟脉冲数)，与此平行同做NSB管(非特异性管)、SO管(最大吸收管)、标准管，各管加分离剂1000L，混匀，室温孵育15min，3500r/min离心15min，弃上清，r计数仪测定各管衰变率(RIA法正常参考范围为020g/L,超过20g/L判为阳性)。1.3 入选标本本院保健科体检排除各种恶性疾病者30人(男18例，女12例，平均年龄43岁)为正常对照组;住院确诊为肝癌者30人(男21例，女9例，平均年龄56岁)为肝癌组;住院确诊为肝硬化者30人(其中男23例，女7例，平均年龄58岁)为肝硬化组。后两组均经影像学检查、手术及病理切片检查或肝活检确诊。均于早晨空腹抽血3mL经4000r/min离心10min(肝癌组患者均于手术前抽血)，取血清一部分用于RIA检测(在本科室完成)，另一部分于EP管中密封置-20冷冻保存(集中于广州市达瑞抗体工程技术有限公司技术部进行TRFIA法检测)。1.4 统计学处理用SigmaPlot 10.0统计软件进行数据统计分析，采用单因素方差分析及q检验、卡方检验及相关、回归分析。2 结果2.1 剂量反应曲线的线性TRFIA法：将AFP参考标准品(达瑞抗体公司提供)稀释成不同的浓度进行测定(两步法)。以各参考标准品浓度的对数为横坐标，以荧光值1103计数的对数为纵坐标，做AFPTRFIA标准曲线，并由Auto DELFIA 1235自带的LogLog函数处理。标准曲线线性范围为11210 g/L，当质量浓度值大于2000 g/L时，所测荧光值不再按线性升高，即Hook出现。而RIA法：用试剂盒内参考标准品稀释成不同浓度进行线性测定试验，结果显示在1900 g/L范围内呈现良好线性关系。2.2 精密度比较(1)TRFIA法：对两个水平质控品(QC、QC，期望质量浓度分别为65、160 g/L)分别重复测定20次，计算分析内CV%值;1次/d，连续测定20d，计算分析间CV%值。(2)RIA法：对高、低值两个水平质控品(L：QRC40711;H：QRC40711)分别重复测定20次，计算分析内CV%值;1次/d，连续测定20d，计算分析间CV%值。结果见表1，说明：两法CV%均在10以内，但TRFIA的CV%比RIA法小。表1 两法分析内、分析间精密度测试结果2.3 相关与回归分析TRFIA与RIA分别测定90例样本的AFP，测定结果如表2。测定值经SigmaPlot 10.0统计软件分析，以TRFIA为Y,RIA为X，其直线回归方程为Y=0.887X-1.172，相关系数r=0.986，P0.01，两方法呈显著正相关(图1)。图1 TRFIA法与RIA法测定AFP的回归分析2.4 两法对3组人群检测AFP结果的比较(详见表2)表2 TRFIA与RIA对正常组、肝硬化组、肝癌组AFP测定的结果与肝癌组比较，*P0.05。3 讨论甲胎蛋白是一种相对分子质量约68 000的癌胚糖蛋白，血清AFP检测对肝细胞癌有特异诊断价值2，其诊断价值仅次于病理检查，可在临床症状出现前811个月做出诊断，是目前最好的早期诊断指标之一,已广泛应用于肝细胞癌的普查、诊断、判断治疗效果和预测复发等。RIA是我国目前检测AFP常规采用的方法，具有较高的灵敏度和准确性，其临床应用价值已得到大家的认可。然而125I作为标记物也为RIA带来了一些不可避免的缺陷：(1)RIA试剂的生产和应用必须采用相应的射线防护措施，试剂使用后的废物必须经过特殊的处理。(2)由于放射性同位素的自身衰变作用，决定了RIA试剂的有效期较短。(3)125I的衰变速度决定了RIA有限的可检测性。上个世纪80年代兴起的TRFIA的基本原理是以具有独特荧光特性的镧系元素及其螯合物为示踪物,代替荧光物质、酶、同位素、化学发光物质，标记抗体、抗原、激素、多肽、蛋白质、核酸探针及生物细胞，待反应体系(如：抗原抗体反应、核酸探针杂交、生物素亲和素反应以及靶细胞对效应细胞的杀伤反应等)发生后，用时间分辨荧光免疫分析检测仪测定最后产物中的荧光强度，根据产物荧光强度和相对荧光强度的比值，判断反应体系中分析物的浓度，从而达到定量分析的目的。本文结果显示：TRFIA法检测AFP的线性范围较RIA法的宽，是由于TRFIA法利用了镧系元素独特的荧光特点和检测中采用的波长分辨和时间延迟技术。另外，TRFIA采用的固相技术、高纯度的抗体包被技术以及DELFIA系统采用的增强液等因素，也是TRFIA法灵敏度高的有力保证。TRFIA法分析内和分析间CV%较RIA的小，可能是由于TRFIA法采用镧系元素Eu3+作标记物，其标记物制备简便、示踪物稳定、试剂储存时间长、操作流程短易于自动化;而RIA采用125I作标记物，整个实验操作流程长，不能自动化，易受人为因素影响。再者其标记物存在自身衰变作用，决定了RIA试剂的有效期较短和RIA有限的可检测性，致使试剂重现性差。TRFIA与RIA检测AFP具有良好的相关性，说明两种方法测定AFP在检测效能上意义相当，都能满足临床要求。TRFIA法具有灵敏度高、操作简便、标记物稳定易贮存、标准曲线范围宽、可重复测量、不受样品自然荧光干扰及无放射性污染等优点35，用于检测AFP在灵敏度、线性范围和精密度等方面优于RIA法，是一种具有很好发展前景的超微量非放射性核素标记免疫分析方法。【参考文献】 1 李振甲,陈泮藻,高平,等.时间分辨荧光分析技术与应用M.北京:科学出版社,1996:139.2 商健彪,李彦豪,刘方颖,等.肝细胞性肝癌 18FFDG PET显像与血清甲胎蛋白的相关性研究J.第一军医大学学报,2004，24(6):697699.3 Thomas S,JeanCharles P,Xavier C,et al.Serum cytokine profiles in relap sing polychondritis suggest monocyte /macrophage activationJ.Arthritis & Rheuma