实验 电泳分离蛋白质实验.doc

实验 电泳分离蛋白质实验1、实验目的（1） 学习SDS-PAGE分离检测蛋白质的原理；（2） 掌握SDS-PAGE不连续凝胶电泳分离检测蛋白质的操作方法。2、实验原理 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和交联试剂N，N-甲叉双丙烯酰胺在有引发剂和增速剂的情况下聚合而成的一种三维立体网状结构的凝胶物质，是目前生化和分子生物学实验中常用的电泳支持介质。聚合反应时常用的催化剂或者引发剂有过硫酸铵、过硫酸钾及核黄素等物质。N，N，N，N-四甲基乙二胺（TEMED）、3-二甲胺丙腈等物质可作为聚合过程的增速剂。以聚丙烯酰胺凝胶为支持介质的电泳是依据蛋白质的分子量和带电性的差异而使不同分子量的蛋白质得到分离。通过不同的电泳方法，即可探求蛋白质分子的各种特性，如分子量、等电点、电荷分布、免疫行为、生化特性等。SDS（十二烷基硫酸钠）是一种阴离子去污剂，在电泳实验中作为变性剂和助溶剂，它能断裂蛋白质分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白质的二级和三级结构。在电泳样品和凝胶中加入SDS和还原剂后，蛋白质分子被解聚成多肽链。强还原剂如-巯基乙醇则能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。 解聚后的氨基酸侧链与SDS充分结合成带负电荷的蛋白质-SDS复合物，由于SDS带有大量的负电荷，当其与蛋白质结合时，所带的负电荷大大超过了天然蛋白质原有的负电荷，因而掩盖了不同种类蛋白质分子间原有电荷的差异，使蛋白质分子均带有相同密度的负电荷。蛋白质-SDS复合物在水溶液中的形状像一个长椭圆棒。不同的蛋白质的SDS复合物的短轴长度基本上是相同的，约为1.8nm。但长轴的长度则与亚基分子量的大小成正比。因此这种复合物在SDS-聚丙烯酰胺凝胶系统中的电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而主要取决于椭圆棒的长轴的长度，即蛋白质或亚基分子量的大小。 由于SDS电泳分离蛋白质分子时，电泳迁移率只取决与分子解聚后SDS-蛋白质复合物的大小，即蛋白质分子量的大小，因此凝胶浓度的选择尤为重要。交联度为2.6%的条件下，在10%的凝胶中，蛋白质的分子量在25KD到200KD之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系。在15%的凝胶中，蛋白质的分子量在10KD至50KD之时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系。因此，可以根据所测的分子量的范围选择合适的凝胶浓度以及相应的已知分子量的标准蛋白。3、实验试剂及仪器（1）实验试剂丙烯酰胺（Acr），N，N-甲叉双丙烯酰胺（Bis），N，N，N，N-四甲基乙二胺（TEMED），十二烷基硫酸钠（SDS），甘氨酸，过硫酸铵（AP）（以上试剂均为电泳纯），-巯基乙醇，Tris，丙三醇，三氯乙酸，冰醋酸，甲醇，考马斯亮蓝，盐酸（HCl），溴酚蓝，冰醋酸，标准分子量蛋白，未知分子量蛋白样品。（2）实验仪器垂直板电泳槽一套，直流稳压电源（500伏、100毫安），抽气装置，凝胶成像系统，1mL、10200L移液枪各一支，滤纸，胶皮手套，细长针头 （15cm）。4、电泳工作液的配制（1） 10%SDS溶液，250mL取25g电泳级SDS，用双蒸水溶解后定容至250ml，室温下可长期保存。（2）丙烯酰胺单体贮液，50mL精确称取14.55g丙烯酰胺，0.45gN，N-甲叉双丙烯酰胺，首先用40mL双蒸水溶解搅拌，直到溶液变成透明，再用双蒸水稀释定容到50mL，过滤，丙烯酰胺和双丙烯酰胺在贮存过程中缓慢转变为丙烯酸和双丙烯酸，这一脱氨基反应是光催化或碱催化的，故应核实溶液的pH值不超过7.0。置棕色瓶中在4可保存一个月。注意：丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性并容易吸附于皮肤，配制时一定要做好防护措施。（3） 分离胶缓冲液贮液(1.5mol/L Tris-HCl，pH8.8)，50mL称取9.08gTris溶解在40mL双蒸水中，加2mL10%SDS，用4 mol/L HCl调pH至8.8,再用双蒸水定容至50mL，4保存。（4） 浓缩胶缓冲液贮液(1 mol/L Tris-HCl，pH6.8)，50mL称取6.06gTris碱溶解在40mL双蒸水中，加2mL10%SDS，再用双蒸水定容至50mL，4保存。（5） 10%过硫酸铵溶液，1mL称取0.1g过硫酸铵（AP），加1mL双蒸水溶解。使用前配制。（6）电极缓冲液，1000mL精确称取3g Tris碱，14.4g甘氨酸和1g SDS 加双蒸水溶解，用4 mol/L HCl调pH至8.3左右，定容到1000mL。也可以制成10的储存液，在室温下长期保存。（7） 2倍样品缓冲液，10mL2.0mL0.5 mol/L Tris-HCl（pH6.8）；2.0mL甘油（丙三醇）；4.0mL 10%SDS；0.5mL0.1%溴酚兰；1.0mL-巯基乙醇；0.5mL双蒸水。 （8） 浓缩胶（T=5%）单体贮液0.65mL；浓缩胶缓冲液贮液1.25mL；10%SDS0.11mL；双蒸水2.95mL；TEMED10L；10%过硫酸铵40L。（9） 分离胶（T=12%）单体贮液4mL；分离胶缓冲液贮液2.5mL；10%SDS0.22mL；双蒸水3.2mL；TEMED20L；10%过硫酸铵60L。（10）考马斯亮蓝染色液的配制 固定液，1000mL称取125g三氯乙酸，用500mL双蒸水溶解，再加300mL甲醇，最后用双蒸水定容至1000mL，室温保存。 考马斯亮蓝染色液，1000mL称取1.0g考马斯亮蓝R-250，用双蒸水800mL溶解，再加入100mL冰醋酸，100mL甲醇，定容后用滤纸过滤，除去溶液中的不溶物。 考马斯亮蓝脱色液，1000mL将100mL冰醋酸，100mL甲醇和800mL蒸馏水混合即可。 5、实验操作 （1）凝胶的灌制 玻璃板先用清洁剂洗干净，然后清水冲洗几遍，再用双蒸水冲洗几遍，置于烘干箱内烘干，凉凉后根据厂家说明书安装。 确定所需凝胶溶液体积，配制一定体积的分离胶溶液。一旦加入TEMED，丙烯酰胺会马上开始聚合，故应立即快速旋动混合物并进入下步操作。 用1mL移液枪迅速在两玻璃板的间隙中灌注丙烯酰胺溶液，留出灌注浓缩胶所需空间(梳子的齿长再加0.5cm)。再在胶液面上小心注入一层水（约23mm高），以阻止空气进入凝胶溶液。 分离胶聚合完全后（约30分钟），倾出覆盖水层，再用滤纸吸净残留水。 制备浓缩胶。制备一定体积及一定浓度的丙烯酰胺溶液，操作同步骤。 聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶，立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子。小心避免混入气泡，再加入浓缩胶溶液以充满梳子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室温下。（2）样品处理将待测的未知分子量蛋白样品用双蒸水配置溶液（2mg/mL），加入等体积的2倍样品缓冲液，于沸水浴加热5分钟后，置于-20保存，使用前置于室温融化后，沸水浴加热35分钟后上样。低分子量蛋白标准蛋白质也同样处理。（3）电泳过程 浓缩胶聚合完全后（30分钟），小心倾斜移出梳子。把凝胶固定于电泳装置上，上下槽各加入Tris-甘氨酸电极缓冲液。必须设法排出凝胶底部两玻璃板之间的气泡。 按给定顺序加样，加样量通常为2045L（1.0mm厚的胶）。 将电泳装置与电源相接，凝胶上所加电流为10mA。当染料前沿进入分离胶后，把电流提高到20mA，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部上方约1cm，然后关闭电源。 从电泳装置上卸下玻璃板，用刮勺撬开玻璃板。紧靠最左边一孔（第一槽）凝胶下部切去一角以标注凝胶的方位。 （4）染色和脱色 经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质样品在电泳完毕，用固定液固定12小时，用考马斯亮蓝R-250染色24小时。换脱色液脱色，需310小时，其间更换多次脱色液至背景清楚。 此方法检测灵敏度为0.21.0 g。脱色后，可将凝胶浸于水中，长期封装在塑料袋内而不降低染色强度。为永久性记录，可对凝胶进行拍照，或将凝胶干燥成胶片。