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流感病毒及SARS病毒感染及其致病性研究Influenza SARS CoVVirusInfectionandItsPathogenesis 流感病毒 3 临床有哪些特异性抗流感病毒的药物 它们的作用机理是什么 1 如何扩增流感病毒 有哪些实验室检测手段 2 什么是流感病毒的vRNA mRNA cRNA 4 为什么流感病毒在细胞培养中传代后会丧失感染性 如何克服 流感病毒流行历史与现状 希波拉底 古希腊医生 被誉为医学之父 记载的流感疫情最早始于公元前412年 1933年英国人威尔逊 史密斯 WilsonSmith 第一次分离出人流感病毒 流感病毒每隔一定的时间就会在世界不同地区发生 自1997 至今 在亚洲及全世界暴发H5N1血清亚型的高致病禽流感 Influenzapandemicinhistory H1N1 The Spanish fluthatkilled50millionpeopleworldwidefrom1918to1919 scientistsidentifieditsproteinslongafterthepandemicwasover H2N2 The Asian fluthatcausedapandemicfrom1957to1958H3N2 The HongKong flu whichcausedtheworld smostrecentpandemicin1968 1918 1919年世紀西班牙流感病毒死亡人数估计2000 5000万人 AnEmergencyHospitalforInfluenzaPatients 流感病毒简介 InfluenzaVirus有包膜的单链负义RNA病毒正黏病毒科直径80 120nm 呈球形或丝状分A B C 甲 乙 丙 三型 流感病毒的分类 根据NP抗原性 将流感病毒分为A B C 甲 乙 丙 三型 三型病毒具有相似的生化和生物学特征 A型流感病毒常以流行形式出现 能引起世界性流感大流行 它在动物中广泛分布 并也能在动物中引起流感流行和造成大量动物死亡 B型流感病毒常常引起局部爆发 不引起世界性流感大流行 至今尚未找到它存在于人之外其它动物中的确凿证据 C型流感病毒主要以散在形式出现 主要侵袭婴幼儿 一般不引起流行 猪也是它天然宿主之一 InfluenzaVirusinfectioninMDCKcells狗肾细胞 WhatIsInfluenzaVirusLike NP核蛋白PA聚合酶8RNAsPB1聚合酶PB2聚合酶 M1基质蛋白M2基质蛋白 HA血凝素NA神经氨酸酶 NS1非结构蛋白NS2非结构蛋白 内层 中层 外层 不存在病毒粒子中 流感病毒的结构 由三层构成内层为病毒核衣壳 含核蛋白 NP P蛋白和RNA NP是可溶性抗原 具有型特异性 抗原性稳定 P蛋白 PB1 PB2 PA 是病毒RNA聚合酶亚单位 流感病毒的结构 中层为基质蛋白 它构成了病毒的外壳骨架 实际上骨架中除了基质蛋白 M1 之外还有膜蛋白 M2 基质蛋白与病毒最外层的包膜紧密结合起到保护病毒核心和维系病毒空间结构的作用 M1抗原性稳定 也具有型特异性 流感病毒的结构 外层为病毒包膜 是包裹在基质蛋白之外的一层磷脂双分子层膜 其上具有两种不同糖蛋白构成的辐射状突起 即血凝素 hemagglutinin HA 和神经氨酸酶 neuraminidase NA 流感病毒的结构 血凝素 HA 呈柱状 能与人 鸟 猪豚鼠等动物红细胞表面的受体相结合引起凝血 故而被称作血凝素 是病毒吸咐于敏感细胞表面的工具 NA 右下 则能水解蛋白 水解细胞表面受体特异性糖蛋白唾液酸受体 是病毒复制完成后脱离细胞表面的工具 流感病毒的抗原性变异 在亚型内部经常发生小变异 量变 称为抗原漂移 antigenicdrift 大的抗原变异出现的亚型 质变 即称抗原转变 antigenicshift 其为H和 或 N都发生了大的变异 由此而产生新的亚型 可引起世界性大流行 HA和NA均有变异特性 故只有株特异的抗原性 其抗体具有保护作用 流感病毒的抗原性变异就是指HA和NA抗原结构的改变 主要是HA 流感病毒的抗原性变异 HA 15种亚型变异 NA 9种亚型变异 如 H1N1 H3N2 H5N1A型流感病毒的抗原变异较快 2 3年可发生一次 B型流感病毒的抗原变异很慢 未划分成亚型转变 C型流感病毒尚未发现抗原变异 流感病毒的基因组 8个独立的RNA片段 A型 B型 或7个独立的RNA片段 C型 核酸总长度为约13 6kb所有RNA片段5 末端的13个核苷酸及3 末端的12个核苷酸高度保守 且5 端与3 端反向互补结构 共编码10种蛋白质 其中8种 PB1 PB2 PA HA NA NP M1 M2 为结构蛋白 2种 NS1 NS2 为非结构蛋白 流感病毒的基因组 流感病毒的基因组 RNA1 3编码PB2 PB1和PA蛋白 RNA4编码HA蛋白 RNA5编码NP蛋白 RNA6编码NA蛋白 RNA7编码M1 M2蛋白 RNA8编码NS1 NS2蛋白 InfluenzaAviralgenome NS1 NS2检测目标 流感病毒的感染及复制过程 吸附侵入脱壳表达 复制及装配成熟及释放 流感病毒的感染及复制过程 流感病毒的吸附 HA 血凝素 HA 呈柱状 血凝素蛋白经过宿主细胞的蛋白酶水解后分为重链HA1和轻链HA2两部分 HA1可以与宿主细胞膜上的唾液酸受体相结合 HA2则可以协助病毒包膜与宿主细胞膜相互融合 血凝素在病毒导入宿主细胞的过程中扮演了重要角色 血凝素具有免疫原性 抗血凝素抗体可以中和流感病毒 流感病毒的侵入 病毒吸附至宿主细胞表面后 其包膜可通过与宿主细胞质膜融合形成内吞体 并通过受体介导的胞吞作用进入细胞内 流感病毒的脱壳 M2 离子通道 流感病毒通过受体介导的内吞作用进入细胞 形成内吞体 Endosome 此时 M2被激活并打开离子通道 H 进入病毒使PH降低 酸化引起HA构象变化 介导病毒囊膜与内吞体膜融合 同时 病毒颗粒内也发生酸化 导致病毒核衣壳与基质蛋白M1之间解离 vRNPs释放 抗流感病毒药物M2抑制剂金刚烷胺 流感病毒的表达 复制及装配 病毒蛋白的合成 NP P蛋白和NS1在感染后数小时即生成 其它蛋白如HA NA M1 M2和NS2合成较晚 病毒蛋白合成时间的控制可能受到病毒mRNA向核外运输的调节 并可能与病毒蛋白NS1的功能有关 流感病毒的成熟及释放 病毒成熟前 各种病毒成份已结合在细胞表面 最后通过出芽的方式 使局部的细胞膜向外隆起 包围住结合在细胞膜上的核衣壳 成为新合成的有感染力的病毒 神经氨酸酶 NA 是一个呈蘑菇状的四聚体糖蛋白 具有水解唾液酸的活性 当成熟的流感病毒经出芽的方式脱离宿主细胞之后 病毒表面的血凝素会经由唾液酸与宿主细胞膜保持联系 需要由神经氨酸酶将唾液酸水解 切断病毒与宿主细胞的最后联系 因此神经氨酸酶也成为流感治疗药物的一个作用靶点 流感病毒的成熟及释放 NA 抗流感病毒药物NA抑制剂达菲 有关流感病毒的释放问题 1 子代病毒包膜上的的HA分子是否会与宿主细胞表面的唾液酸分子结合 从而病毒无法释放 2 子代病毒是否会因囊膜上既有HA分子又有唾液酸分子而彼此吸附形成聚集 病毒包膜上的NA分子可水解去处细胞膜表面的唾液酸残基 促使完整的病毒颗粒从细胞释放 反向遗传技术 12plasmidssystem 反向遗传技术 8plasmidssystem SymptomsofInfluenza fever usuallyhigh headacheextremetirednessdrycoughsorethroat runnyorstuffynosemuscleachesStomachsymptoms suchasnausea vomiting anddiarrhea alsocanoccurbutaremorecommoninchildrenthanadults 病理 人体通过呼吸吸入病毒颗粒病毒通过HA进入呼吸系统的表皮细胞由于病毒导致细胞死亡 产生了炎症反应 咳嗽进一步加速了病毒的传播由于dsRNA的出现触发了干扰素的生成 更多流感的症状 打喷嚏 热病 冷颤 肌肉酸疼 头疼 疲劳 产生因为流感对呼吸系统的伤害 更多严重的疾病 如肺炎 并发 3DAYSpi 7DAYSpi Normalmucosa 逃逸免疫系统杀伤的机制 产生NS1蛋白 抑制PKR激活 NS1蛋白与双链RNA结合 防止双链RNA激活PKR 流感病毒的双链RNA可诱导细胞产生干扰素 INF INF结合至细胞相应受体 使细胞产生大量蛋白激酶即PKR PKR可磷酸化真核细胞翻译起始所必需的eIF2 蛋白 从而关闭细胞蛋白合成 使病毒无法合成蛋白而死亡 包膜上抗原蛋白突变 逃避体液免疫 HowIstheFluSpread Fluvirusesspreadmainlyfrompersontopersonthroughcoughingorsneezingofpeoplewithinfluenza Sometimespeoplemaybecomeinfectedbytouchingsomethingwithfluvirusesonitandthentouchingtheirmouthornose 流感病毒的传播 患者一个激烈的咳嗽反射能将含有病毒的微液滴以每小时约100英里的速度排出 且每个微液滴中含有上百万个病毒颗粒 而启动一个个体的感染仅仅需要几个或几十个病毒颗粒 这就导致了流感病毒可快速高效地传播 流感的预防措施 自我保护保持良好的个人及环境卫生 勤洗手 使用肥皂或洗手液并用流动水洗手 不用污浊的毛巾擦手 双手接触呼吸道分泌物后 如打喷嚏后 应立即洗手 打喷嚏或咳嗽时应用手帕或纸巾掩住口鼻 避免飞沫污染他人 流感患者在家或外出时佩戴口罩 以免传染他人 均衡饮食 适量运动 充足休息 避免过度疲劳 每天开窗通风数次 冬天要避免穿堂风 保持室内空气新鲜 在流感高发期 尽量不到人多拥挤 空气污浊的场所 不得已必须去时 最好戴口罩 流感的预防措施 疫苗接种流感疫苗接种是世界公认的预防流感的有效方法 实践证明 免疫预防是减少流感危害的一种重要措施和手段 对高危人群 易感人群接种流感疫苗是预防流感的有效方法 Theinactivatedvaccine灭活疫苗 Shortlivedprotective UsuallygiveninthefallsothatprotectionishighinDecember January OnlycertainformulationsofthevaccineareFDAcertifiedforyoungchildren Thelive attenuatedinfluenzavirus LAIV vaccine减毒活疫苗 每年一次 Onlyapprovedforhealthyindividuals Givennasallyandshouldprovidemucosal humoralandcell mediatedimmunity Itneedstobegiveneveryyear ontraindicatedforthoseallergictoeggs Contraindicatedforchildrenandadolescentsonanytherapycontainingaspirin 流感病毒扩增与检测 扩增 接种9日龄鸡胚 收获尿囊液 MDCK细胞 依赖胰蛋白酶 检测 1 血球凝集试验 鸡红细胞 快 豚鼠 人红细胞 慢 2 ELISA 需要流感病毒抗体 3 RT PCR检测病毒的RNA4 Real TimePCR确定病毒RNA的数量 关于禽流感 AIV 香港1997年H5N1禽流感病毒感染人引起18人发病 至今 已有数百人感染H5N1引起死亡的报道 ReservoirHosts HumansHorses birds andpigs AvianfluH5N1hasbecomecommoninAsianpoultry Officialsbelieveopen airpoultrymarketsleadtothespreadofthedisease 高密度开放式运输和存放导致AIV快速传播 InfectingOtherSpecies In2004 avianfluH5N1infectedandkilledtigers leopardsandcats Thepotentialdangerismuchmoresevere FearandPanicHasInducedbytheBirdFlu DoestheAzraelReturn 流感病毒感染与炎症基因连锁反应 流感病毒 dsRNA NS1 105病人105健康人 炎症反应 病毒感染与炎症反应临床症状疼痛和发烧全身炎症反应局部炎症反应慢性炎症与癌症密切相关 研究背景介绍 人体有两种类型COX COX 1 COX 2COX 1 组成性表达COX 2 沉默 感染诱导表达2 COX 2 参与炎症反应 疼痛和发烧 3 阿司匹林可以抑制COX 2表达起到抗炎效果 全球使用最广泛的抗炎药物阿司匹林消耗17 500吨 年 环加氧酶Cyclooxygenase 研究背景介绍 炎症基因 环加氧酶 2Cyclooxygenase 2 COX 2 花生四烯酸ArachidonicAcid前列腺素Prostaglandins L 研究背景介绍 SirJohnVane诺贝尔奖 ChronicInflammation lung COX 2 involvedininflammation炎症 NormalBloodVessel TissueInflammation 炎症反应的双面性正面作用 正常炎症反应可清除病毒感染 促进组织修复 对人体有益 但过度炎症反应对人体有害 负面作用 扰乱正常生理参数 感染死亡率增加 COX 2 鼠对流感病毒感染病症减轻 死亡率降低 但是肺组织中的病毒量明显上升 病毒有可能与机体和平共处 诱导型NO合成酶iNOS involvedininflammation NO是人体重要的信号分子 DiscoveryofsignallingmoleculerNO 三种类型的NO合成酶 流感病毒感染与炎症基因连锁反应 流感病毒 dsRNA NS1 105病人 炎症反应 Summary PLoSONE2008 e1985 EurJImmunol2009 流感病毒Q1 1 如何扩增流感病毒 有哪些实验室检测手段 扩增 接种9日龄鸡胚 收获尿囊液 MDCK细胞 依赖胰蛋白酶 检测 1 血球凝集试验 鸡红细胞 快 豚鼠 人红细胞 慢 2 ELISA 需要流感病毒抗体 3 RT PCR检测病毒的RNA4 Real TimePCR确定病毒RNA的数量 流感病毒Q2 2 什么是流感病毒的vRNA mRNA cRNA vRNA mRNA cRNA 流感病毒Q3 3 临床有哪些特异性抗流感病毒的药物 它们的作用机理是什么 离子通道M2抑制剂 金刚烷胺 amantadine 金刚乙胺 rimantadine 为神经氨酸酶NA抑制剂 神经氨酸酶抑制剂 奥司他韦 oseltamivir 达菲 病毒唑 核苷类似物 针对所有 RNA病毒 流感病毒 4 为什么流感病毒在细胞培养中传代后会丧失感染性 如何克服 HA0 HA1 HA2胰蛋白酶 SARS CoV 重症急性呼吸综合症冠状病毒SARSCoronavirus SARSCoV SARS2002年底在佛山首次报道 SARS Coronavirus 早期称非典型性肺炎 非典 后期称SevereAcuteRespiratorySyndrome英文简称是 SARS 引起疾病的病原体是冠状病毒的一个变种 新型冠状病毒 科学家将其命名为 SARS CoV 在无生命物体表面可存活24h 在人类排泄物中存活4天 潜伏期1 12天 平均4 5天 果子狸是SARS病毒的主要载体 SARS病毒对一些普通消毒剂就很敏感 能在5min内将其杀死 如10 甲醛 10 次氯酸钠 75 乙醇和2 苯酚混合液 56 以上高温可在30min内将其杀死 SARS病毒对抗菌药物不敏感 多形性 单正链RNA 不分节段 螺旋对称人呼吸道冠状病毒包膜表面有突起 呈花瓣状 排列为一圈 人冠状病毒据中和试验至少可分三个血清型可引起普通感冒和咽喉炎 某些血清型可致成人腹泻或胃肠炎疾病多为自限性 主要经飞沫传播目前尚无疫苗预防 也无特效药物治疗 冠状病毒Coronavirus SARS病毒的形态 病毒形态示意图 SARS病毒的形态 病毒形态电镜图 SARS病毒的形态 病毒群落示意图 SARSGenome SARS症状 中国的SARS流行 SARS病毒 Phylogeneticanalysisofgenome AY394850 of