（生物医学工程专业论文）单个量子点的荧光光谱成像和散射成像.pdf

单个量子点的荧光光谱成像和散射成像 a bs t r a c t a san e wc l a s so ff l u o r e s c e n c ep r o b e s q u a n t u md o t sh a v em a n ye x c e l l e n to p t i c a l p r o p e r t i e s c o m p a r e w i t ht r a d i t i o n a if l u o r e s c e n c ed y e s a n dp l a ym o r ea n dm o r e i m p o r t a n tr o l e si nt h ef i e l d so fm o l e c u l a rb i o l o g y c e l lb i o l o g ya n dm e d i c i n e e ta 1 t h e s et h e s i sg i v ea no v e r v i e wo nq u a n t u md o t s a b o u tt h e i ro p t i c a lp r o p e r t i e s p r e p a r a t i o n m o d i f i c a t i o na n da p p l i c a t i o n si ns i n g l em o l e c u l ed e t e c t i o n m a j o rs t u d yo f t h ee x p e r i m e n t a li sm a i n l yc a r r i e do u tt h ef o l l o w i n gt w oa r e a s m u l t i c o l o rq u a n t u md o t i m a g i n ga tt h es a m et i m ea n ds c a t t e r i n gi m a g i n go fs i n g l eq u a n t u m d o t 1s i n g l e c h a n n e li m a g i n go ft w o c o l o rq u a n t u md o t ak i n do fe x c i t a t i o nl i g h tc a n s t i m u l a t eav a r i e t yo fq u a n t u md o tl u m i n e s c e n c e i fb i o m o l e c u l a rt a gd i f f e r e n tq d s i n t e r a c t i o n so fb i o l o g i c a lm o l e c u l e sw i t h i nl i v i n gc e l l sc a nb ed e t e c t e d w e c a l l r e a l t i m eo b s e r v eas p e c i f i cr e c e p t o ri n t e r a c t i o n a st h es i n g l e c h a n n e lr e n d e rb l a c k a n dw h i t ep i x e l s e a c hp i x e lr e p r e s e n t sag r a yv a l u e s i n g l e c h a n n e l c a no n l y d i s t i n g u i s hal i g h t e m i t t i n gq u a n t u m d o t s a tp r e s e n t d e t e c t i o no fm u l t i c o l o rq u a n t u m d o t si sg o tb ym u l t i c h a n n e ld e t e c t o r b u tt h em u l t i c h a n n e ll i g h tt r a n s m i s s i o nr a t ew i l l a f f e c tt h eq u a n t u md o t so b s e r v a t i o n s i nt h i sp a p e r w ed i s t i n g u i s ht w om a r k e r sb y m e a s u r i n gd i s t a n c eb e t w e e nz e r ol e v e la n do n el e v e lw i t ht r a n s m i s s i o ng r a t i n g t h i s s i n g l e c h a n n e li m a g i n gw i l lh e l pt os t u d y i n gt h ei n t e r a c t i o nb e t w e e n m o l e c u l e s 2s c a t t e r i n gi m a g i n go fs i n g l eq u a n t u md o t r e s e a r c ho fq u a n t u md o ti sc a r r i e d o u tu n d e rt h ef l u o r e s c e n tm i c r o s c o p e t h i sp a p e ra c h i e v es i n g l eq u a n t u md o ti m a g i n g b yd a r k f i e l ds c a t t e r i n g s c a t t e r i n gi m a g i n gw i l lh e l pt o f u r t h e rs t u d yt h eo p t i c a l p h y s i c a lp r o p e r t i e so fq u a n t u md o t s a n dp r o v i d ea na l t e r n a t i v ed e t e c t i o nm e t h o do n s i m i l a rs i z eo rd i f f i c u l tt od e t e c t i n gf l u o r e s c e n tn a n o p a r t i c l e s a tt h es a m et i m et h e e x p e r i m e n tc o n f i r m st h a tq u a n t u md o t so c c u r rp h o t o b l e a c h i n gb yc o m b i n i n gd a r k f i e l d m o d ea n df l u o r e s c e n c em o d e k e yw o r d s q u a n t u md o t s f l u o r e s c e n c es p e c t r a li m a g i n g d a r k f i e l dm i c r o s c o p e s c a t t e r i n gi m a g i n g p h o t o b l e a c h i n g i i i 硕l 学位论文 第1 章绪论 量子点 q u a n t u md o t s q d s 是由i ib v i a 如c d s e 等 或i i i a v a 如i n p g a a s 等 族元素组成的稳定的 溶于水的 尺寸在1 1 0 0n l t l 之间的纳米晶粒 2 0 世纪7 0 年代末 量子点 q u a n t u m d o t s q d s 由于其独特的光学特性 引起了 科学工作者们的广泛关注 那时 对量子点的研究主要集中在光电方面 例如微 电子领域和光电子领域 至1 1 2 0 世纪8 0 年代 生物学家开始对量子点产生了浓厚兴 趣 由于它的荧光量子产率很低 因而工作仍集中在研究量子点的基本特性方面 后来 人们开始对量子点在生物学中的应用逐渐进行了尝试 到了2 0 世纪9 0 年代 由于量子点合成技术的进步 已经可以获得较高质量的产品 荧光量子产率也有 很大的提高 这使得量子点作为荧光探针应用于生物医学领域的前景逐渐展现出 来 自1 9 9 8 年a l i v i s a t o r s 和n i e 的研究小组分别发表了将量子点用作生物标记的开 创性论文之后 量子点用于生物医学标记受到了广泛的关注 并一跃成为非常前 沿的研究领域 卜引 近几年量子点优良的光谱特性和光化学稳定性使它在生物化学 分子生物学 细胞生物学 基因学 蛋白质组学 医学诊断 药物筛选 生物大分子相互作用 等研究中的应用价值引起科学工作者的极大关注 3 j 生物医学研究领域 荧光分析法是一种重要的分析检测方法 常用有机荧光 染料标记细胞和生物分子 4 1 但是传统的荧光染料的发射光谱很宽 荧光谱峰有时 还有很长的拖尾 造成谱峰之间的重叠 限制了可同时应用的荧光探针数目 有 机染料易光漂白和光解 光解产物对生物分子往往有杀伤作用 此外 每种有机 荧光染料与生物分子的连接都需要特定的方法 量子点却能克服这些缺陷 成为合适的替代物 量子点粒径很小 电子和空 穴被量子限域 连续能带变成具有分子特性的分立能级结构 因此光学行为与一 些大分子比如多环的芳香烃很相似 可以发射荧光 相对于传统有机荧光染料 大小均匀的半导体量子点发射光谱窄且具有尺寸可调的特性 单个波长就可以激 发不同的量子点 荧光量子产率高 稳定性好 具有很好的生物相容性等优点 美国量子点公司的研究小组 5 l 比较了q d s 与a l e x a 染料的荧光强度和光稳定 性 a l e x a 染料在已知的有机染料中的荧光强度和光稳定是最高的 6 j 实验证明 q d s 的荧光强度极大的高于a l e x a 染料 q d s 6 0 8 荧光强度为a l e x a 5 6 8 的4 倍 而q d s 比a l e x a 染料更具有光稳定性 在高强度激发光的照射下 标记于同一细 胞的q d s 6 0 8 很稳定 而a l e x a 很快被漂白 单个量子点的荧光光谱成像和散射成像 1 1 量子点的量子效应 颗粒的尺寸达到纳米级别时 将引起尺寸效应 量子限域效应 表面效应 出现与宏观体系和微观体系不同的特性 这将对生命科学和信息技术以及基础研 究方面产生深刻影响 1 量子尺寸效应 控制量子点的形状 结构和尺寸 可以方便的调节其能隙宽度以及激子的能 量蓝移等电子状态 随着量子点尺寸的减小 量子点的光吸收谱出现蓝移现象 尺寸越小 光谱蓝移现象越明显 这就是量子尺寸效应 量子点体积控制光吸收和发射的特征 晶体颗粒越小 其比表面积越大 分 布于表面的原子相对越多 而表面光激发的电子受到钝化表面的束缚作用就越大 表面束缚能越高 吸收光能越高 即量子尺寸效应 从而使其吸收带蓝移 荧光 发射峰相应蓝移 反之红移 量子限域效应 量子点的电子局限在纳米空间 电子输运受到限制 电子平均自由程缩短 电子的局域性和相干性增强 引起量子限域效应 对于量子点 当粒径与w a n n i e r 激子b o h r 半径a b 相当或更小时 处于强限域区 易形成激子 产生激子吸收带 随粒径减小 激子带吸收系数增加 出现激子强吸收 由于量子限域效应 激子 的最低能量向高能方向移动即蓝移 表面效应 随着量子点粒径减小 大部分原子位于量子点表面 量子点的比表面积随粒 径减小而增大 引 纳米颗粒大的比表面积小 表面原子数增多 导致表面原子的配 位不足 不饱和键和悬键增多 这使表面原子具有高的活性 极不稳定 很容易 与其他原子结合 这种表面效应引起纳米粒子大的表面能和高活性 表面原子的 活性不但引起纳米粒子表面原子输运和构型的变化 同时引起表面原子自旋构象 和电子能谱的变化 表面缺陷导致陷阱电子或空穴 反过来影响量子点的发光性 质 引起非线性光学效应 由于表面效应和尺寸效应使纳米金属颗粒的光反射系 数显著下降 9 1 通常低于1 所以纳米金属颗粒一般呈黑色 粒径越小 颜色越 深 呈现出宽频带强吸收谱 1 1 2 量子点的制备 应用于生物学就意味着量子点必须具有水溶性 早期量子点的合成都是在有 机相中进行 制备得到的量子点水溶性差 在生物应用中受到限制 突破性的工 作是n i e 等 2 1 研究小组完成的 1 9 9 8 年 他们宣布解决了在有机相中生成的q d s 的 疏水性问题 他们将巯基乙酸连至l j c d s z n s 的z n s 夕b 壳上 游离在外的羧基使q d s 硕士学位论文 具有良好的水溶性 并且为生物分子 例如蛋白 肽 核酸 的共价偶联提供了 连接位点 此外 巯基乙酸层还有利于降低带负电荷的蛋白吸附到粒子本身 他 们用修饰过的q d s 标记了一种单抗 证实标记不影响单抗与多克隆抗体的反应 光 稳定性 水溶性及与生物分子连接等问题的解决 为半导体纳米晶体在生物学的 应用打开了大门 国内的研究人员在量子点的性质及应用上也做了一定研究 林章碧l lo j 等人以 水相合成的q d s c d t e 标记胰蛋白酶 观察到连接蛋白上的q d s 的吸收和发射光 谱均发生蓝移 值得一提的是 张皓 1 1 l 等人在水相中合成了单壳层c d t e 半导体 纳米粒子 以往的q d s 都是在有机溶剂中制备的 不适合于在水溶液中进行生物反 应 并且高温高压条件下合成 条件比较苛刻 步骤也比较复杂 而c d t e 纳米粒 子是以巯基丙酸为稳定剂 常温和常压条件下在水溶液中合成 量子产率为 1 0 3 8 同时包覆在粒子外层的游离羧基为进一步连接生物分子提供了位点l l2 1 1 3 量子点的吸收和发射 1 3 1 量子点的发光原理 当半导体量子点的颗粒尺寸与其激子的波尔半径相近时 随着尺寸的减小 其载流子 电子 空穴 的运动将受限 导致动能的增加 原来连续的能带结构 变成准分立的类分子能级 如图1 1 所示 由于量子尺寸效应的影响 半导体量子点的发光原理如图1 1 所示 当一束光 照射到量子点上 吸收光子后 其价带上的电子跃迁到导带 导带上的电子还可 以再跃迁回价带而发射光子 也可以落入量子点的电子陷阱中 当电子落入较深 的电子陷阱中时 绝大部分分电子以非辐射的形式而猝灭 只有极少数的电子以 光子的形式跃迁回价带或吸收一定能量后又跃迁回导带 因此当半导体材料的电 子陷阱较深时 它的发光效率会明显降低 引 半导体量子点受光激发后能够产生空 穴 电子对 电子和空穴复合的途径主要有u 列 电子和空穴直接复合 产生激子态发光 由于量子尺寸效应的作用 所产 生的发射光的波长随着颗粒尺寸的减小而蓝移 通过表面缺陷态间接复合发光 在纳米颗粒的表面存在着许多悬挂键 从 而形成了许多表面缺陷态 当半导体量子点材料受光的激发后 光生载流 子以极快的速度受限于表面缺陷态而产生表面态发光 量子点的表面越完 整 表面对载流子的捕获能力就越弱 从而使得表面态的发光就越弱 通过杂质能级复合发光 以上3 种情况的发光是相互竞争的 如果量子点的表面存在着许多缺陷 对 电子和空穴的捕获能力很强 电子和空穴一旦产生就捕获 使得它们直接复合的 单个量子点的荧光光谱成像和散射成像 几率很小 从而使得激子态的发光很弱 甚至观察不到 而只有表面缺陷态的发 光 为了消除由于表面缺陷引起的缺陷发光而得到激子态的发光 常常设法制备 表面完整的量子点或者通过对量子点的表面进行修饰来减少其表面缺陷 从而使 得电子和空穴能有效的直接复合发光 律柑半导体 导管 傍蕾 图1 1 光致发光原理图 图中实线代表辐射跃迁 虚线代表非辐射跃迁 图1 2 不同粒径c d s e 半导体量子点的发射光谱 a 吸收光谱 b 从a 到e 粒径增加 l l 副 1 3 2 量子点的发光特性 由于受量子尺寸效应和介电限域效应的影响 半导体量子点显示出独特的发 光特性 主要表现为 半导体量子点的发光性质可以通过改变量子点的尺寸加以调控 通过改变 半导体量子点的尺寸和它的化学组成可以使其荧光发射波长覆盖整个可见光区 发光的波长取决于半导体量子点的尺寸 尺寸越小发射的波长越短 半导体量子点具有较大的斯托克斯位移和较窄而且对称的荧光谱峰 这样 硕七学位论文 可以同时使用不同光谱特征的量子点 而发射光谱不出现交叠或只有很小程度的 重叠 使标记生物分子的荧光光谱的区分 识别变得更容易 半导体量子点具有较高的发光效率 在半导体量子点的表面包覆一层无机 材料 可以对核心进行保护和提高发光效率 p e n g 等人 1 4 l 报道了在c d s e 量子点 表面包覆一层c d s 可以使量子点产率达到5 0 大大提高了光稳定性 唐爱伟 l 5 j 研究小组在水相中制备了c d s e 和核 壳型c d s e c d s 半导体量子点 其荧光光谱和 吸收光谱如1 2 图所示 在c d s 量子点的表面上包覆一层宽带隙的c d s 壳层可以 大幅度提高发光效率和发光稳定性 而且包覆c d s 壳层后的c d s e 量子点的吸收 光谱和发射光谱均发生红移 这可能时由于部分激子渗入壳层造成的 他们通过 改变颗粒尺寸得到了不同发射波长和吸收波长的c d s e c d s 半导体量子点 其发射 光谱和吸收光谱如1 3 图所示 从图中可以看出随着粒径增加吸收光谱和发射光谱 的位置都有红移现象发生 这主要是由于量子尺寸效应所致 1 3 3 量子点的共振散射光谱 水相合成的量子点具有成本低 污染小 易批量生产等优势 不仅能直接用 于生物标记 而且通过对量子点的表面进行功能修饰 可应用于重金属离子的检 测 因而水相合成倍受关注 因此 建立一种快速 简便表征c d s e 量子点的方法 具有很高的应用价值 目前常采用x 射线光电子能谱 x p s 透射电子显微镜 t e m 隧道显微镜 s t m x 射线衍射仪 x r d 红外吸收光谱 f t i r 荧光光谱 等来表征c d s e 量子点的光谱特性 形貌 晶型和结构 共振散射光谱分析具有灵 敏度高和简便等特点 c d s e 量子点是一种粒径较小的纳米微粒 它存在固液界面 固有散射存在 通过对3 8 4 0 和4 6 n m 三种粒径的量子点浓度与共振散射峰强度的关系分析得 出 共振散射峰强度与量子点的浓度存在较好的线性关系 实验方法为 将一定浓度的量子点溶液置于荧光分光光度计上 同步扫描激 发波长九 x 和发射波长k m 九 x k m 得到c d s e 纳米颗粒的共振散射光谱 单个量了点的荧光光谱成像和散射成像 a 黝4 6 0 08 0 0 飘 i i e i 恻曲佃w a v e l 嘲 l c m 图1 33 8 n m c d s e 浓度与共振散射光谱强度图 1 5 j a a l1 2 5 r t m o l l b 2 2 5 m o l l c 4 5 t t m o l l d 9 0 肛m o l l e 18 0 t t m o l l f 3 6 0 t t m o l l b a 2 2 5 1 z m o l l b 4 5 t t m o l l c 9 0 p m o l l d 13 5 m o l l e 18 0 t t m o l l f 3 6 0 1 x m o l l g 5 4 0 p m o l l h 18 0 0 t t m o l l 1 4 量子点在生物医学中的应用 每当一种或一类重要的新型荧光探针的发现和研制成功都会大大促进生物科 学的发展 虽然量子点在生物学中的应用才刚刚起步 但是已经取得了有意义的 进展 最近几年 量子点在生物化学 分子生物学 细胞生物学 基因组学 蛋 白质组学 药物筛选 生物大分子相互作用等研究中已显示出极大的发展潜力和 广阔的应用前景 1 6 2 们 1 4 1 量子点进行蛋白质大规模组合标记 众所周知 人类基因组研究已经进入了功能基因组和蛋白质组学研究阶段 可以说蛋白质组学研究是继基因组学研究之后的生命科学发展的新阶段 为此需 要寻找有效 快捷的蛋白质检测分析技术 利用q d s 的多重性和多强度性质能够 对生物分子群进行大量平行编码标记 例如 用单波长 色 和l o 种不同强度的q d s 可产生9 种特征编码 如果取6 色1 0 强度组合将产生百万种编码标记 虽然由于光 谱重叠等原因实际上的编码数量低于理论值 但可用的编码数量足以满足人们对 蛋白质 核酸等生物分子群的标记 短短几年的研究显示该项技术有着极其广阔的前途 客观地估计 量子点技 术产生的影响在几年之后将超过d n a 芯片 与p c r 齐名 将成为蛋白质组学研究 蛋白质间相互作用的核心技术 使蛋白质组学研究以及细胞生物学 新药筛选和 病理诊断等领域在数年之内取得大幅度突破性进展 尤其是发展生物分子群的标 记方法 标记和识别种类繁多的生物分子需要大量平行的编码标记 在大规模标 记的构想的驱使下 许多科研小组都进行了尝试 b每署邑蘑姜 硕士学位论文 如f u l t o n 等用两种荧光染料编码约1 0 0 个微球 用于多分析物的多重生物化验 2 1 1 w a l t 研究组以荧光编码微球随机编排了纤维光学微阵列 2 1 2 2 但他们所用的 标记物都是有机染料或者镧系复合物 有很大缺陷 相比之下 半导体纳米量子 点具有宽范围的激发波长 窄而对称的发射光谱 多样可调的光谱性质 稳定的 荧光强度 这些特征都使之成为未来生物分子标记的首选 n i es m 研究组 2 3 j 综合 考虑复合球的荧光效率 内部量子点的光谱重合等因素 用5 6 种颜色 6 d 强度 级别的q d s 任意组合成三色标记球 能产生1 0 0 0 0 4 0 0 0 0 个可识别编码 实验证 明 微球大小均匀 组合成微球的q d s 荧光强度与游离q d s 相同 q d s 之间光 谱稳定 没有能量转移 他们用这种微球特定标记多种d n a 探针 结合使用荧光 染料来标识靶d n a 的位置 得到了很好的序列分析结果 将这项以半导体纳米粒 子为多重标记的技术应用于基因组学 蛋白质组学 组合生物学和组合化学 面 对多样的生物 化学 分子 科研人员可以真正实现对海量的标记和研究 更灵敏的 检测技术 如双光子激发激光扫描显微术 双光子激发激光扫描显微术是一种最 新发展的显微技术 双光子激发是指荧光物质同时被两个光子激发 对于同一对能 级 双光子激发与紫外单光子激发相比 激发光波长加倍 2 4 1 4 2 激素及生物因子亚细胞研究成像 量子点在细胞亚结构中 甚至在激素和生物因子水平的应用也有报道 在原 位杂交培植和免疫组化中用量子点结合激光共聚焦扫描显微镜 可观察到三维空 间中蛋白质和m r n a 的关系 这种方法可显现蛋白质和相关联的m r n a 合成和定位 的功能性成像 m a t s u n o t 2 5 利用量子点的特性和激光共聚焦扫描显微镜对生长激素 和泌乳刺激素及它们的m r n a 进行了三维成像 量子点在各种生物因子中研究最多是表皮生长因子 2 6 2 7 l i d k e 等 2 7 将量子点 标记到表皮生长因子上 通过激光共聚焦显微镜 观测到肿瘤细胞通过胞吞途径 特异性摄取这种表皮生长因子的全过程 量子点通过标记并结合荧光检测系统用于研究激素及生物因子 对生长发育 学和内分泌学的研究打开了一个新窗口 提供了一种新的方法 1 4 3 活细胞荧光标记及组织光学成像 细胞生物学中一个重大的突破就是活细胞成像 细胞或细胞组分成像的标准 方法是用荧光物质对相关部位进行标记 量子点作为纳米尺寸的晶体 有独特的 光化学和光物理学特性 使其不仅适合单分子成像 也可以进行组织整体的成像 研究 2 引 量子点标记技术在初期已被广泛应用在固定细胞的荧光成像方面 而活 细胞成像中大多局限在细胞膜受体定位和细胞质的研究中 c h e n 等1 2 9 首次报道了 将量子点与标记分子复合物通过转染进入细胞核 在实验中他们将量子点与s v 4 0 猴病毒4 0 大的t 抗原核定位信号 n l s 结合 并经转染进入活细胞 通过荧光成 单个量了点的荧光光谱成像和散射成像 像系统监测到复合物从细胞质到细胞核的运动过程 经一星期以上时间的培养观 察没有发觉对细胞有负面影响 长时间观测可以看到复合物堆积在细胞核中 这 一工作首次将量子点用在细胞核中进行长时间观测生物现象 提供了一种新的无 细胞毒性成像技术来研究细胞核的交换机制及过程 使细胞核的研究工作提高到 可视化程度 量子点颜色的可调性 使其可实现同一细胞的多色标记 有研究表 明 3 0 1 可同时用发红色荧光的量子点标记细胞核 发橙黄色荧光的量子点标记高 尔基体 发绿色荧光的量子点标记微管 经单一波长的光激发后 3 种颜色同时显 现 这是常用的标记物和荧光染料所无法做到的 足以可见量子点生物应用的广 阔前景 量子点在活细胞成像中的应用除细胞核外 还被用于细胞内源蛋白 3 表皮 蛋白 细胞内组分 3 2 1 及细胞内外受体运输途径f 3 3 3 4 l 的研究 量子点进入细胞的 途径也可以不经修饰而通过转染技术 由磷脂脂质体包裹直接进入 35 1 这种技术 增加了量子点的水溶性和生物兼容性 脂质体中的量子点非常的稳定 甚至经过 9 0r a i n 的光照射后荧光强度仍保持在正常的数量级 这种脂质体包裹的量子点除了 在活细胞中应用外 还可以用于组织和生物大分子中 组织光学成像是量子点的另一大优势 水溶性量子点外包被生物分子增加了 其生物兼容性 可使量子点进入组织进行长时间光学成像 这是众多荧光染料分 子所不能比拟的 由于血脑屏障的存在 脑组织中荧光可视成像一直是神经科学 研究的难点 量子点却可以突破这个屏障进入脑组织 如量子点与t a t 一种细胞 敏感的缩氨酸 连接后 通过动脉进入脑内 几分钟内就标记到脑组织上而不受血 脑屏障的影响 用低功率的紫外灯就可以使整个鼠脑的荧光清晰可显 组织学数 据显示 除了内皮细胞外 l t 连接的量子点都可到达脑组织 未连接t a t 的量子 点则不能进入 3 6 1 这一实验证实量子点进入脑组织成像是完全可能的 这为脑内 药物靶向递呈研究和神经科学及开发人工智能提供了强有力的工具 量子点活细胞标记成像技术不仅可以用在动物细胞和组织中 还可用于植物 细胞中 r a v i n d r a n 等 3 7 1 将与花粉粘着素 s c a 一种花粉管粘着蛋白质 结合的量 子点加入到已发芽的百合花花粉颗粒中 在共聚焦显微镜下 对这种蛋白质首次 进行了定位观察 为量子点的应用开阔了新的领域 量子点在活细胞荧光标记及组织光学成像中的应用 使我们更深入的了解到 不同种类细胞的内部结构 分子运行轨迹及深组织形态学 为生理学研究 药物 靶向载体的开发提供了一种新的途径 1 4 4 肿瘤细胞示踪及诊断影像 肿瘤及癌症的诊断和治疗问题是全世界都在关注的焦点 光学成像技术在敏 感的肿瘤诊断尤其是在肿瘤的早期诊断阶段有着巨大潜力 这是一项灵敏的 非 硕十学位论文 侵入性 非电离性 临床应用安全 花费相对便宜的技术 3 引 在肿瘤转移的研究 中 v o u r a 等 3 9 通过量子点标记和多光子激发 光谱成像 观察到了肿瘤细胞转移 到肺组织中的5 个入口 子宫颈癌作为高发肿瘤之一 世界各国都在积极开发早期诊断及治疗的方法 目前 量子点已经可成功地使之应用在细胞水平的肿瘤成像上 n i d a 等 4 0 采用量 子点标记的表皮生长因子受体与抗生长因子抗体形成共轭对来探测子宫颈癌前期 生物学标志物 经过适当地控制 观测到准确标记的生长因子受体 结合光学成 像技术 显示子宫颈癌在分子水平的变化 该技术有助于肿瘤早期的诊断 量子点还可用于检测肿瘤的血管变化 肿瘤组织周围血管丰富 细胞生长迅 速 通常所用荧光试剂不能同时对多种组织成像 而多色量子点标记技术可以应 用到肿瘤细胞 肿瘤血管及周围区域的边界研究中 从而应用于肿瘤早期诊断和 治疗 s t r o h 等 4 1 将量子点 多光子成像技术和表达绿色荧光蛋白的转基因老鼠相 结合研究肿瘤血管周围的细胞和组织 结果证实这些纳米荧光晶体可以实时成像 并可从血管周围的细胞和组织中区分出肿瘤血管 他们还利用量子点标记成功地 检测到了干细胞由骨髓补充到肿瘤脉管系统的过程 这为多功能的量子点用于肿 瘤病理生理学研究开辟了一条道路 近红外荧光由于能穿透组织进行深层组织成像且自发荧光背景较低 已引起 有关研究者的注意 且已将其引入到肿瘤研究中 发射近红外荧光的量子点已经 被制备出来 并用于多种疾病的前哨淋巴结 s l n 的定位标记成像 如非小细胞肺 癌 食道癌等癌症和胸膜部位疾病等 4 2 1 在鼠的前肢皮下和猪的腹股沟皮下注射 近红外荧光量子点做为肿瘤细胞淋巴示踪 通过近红外荧光成像系统观察到量子 点被引流到前哨淋巴结 该方法是确定癌症是否扩散到身体其它部分的第一步 也是最关键的一步 近红外荧光量子点成像系统可同时显现外科手术区域和淋巴 液排泄途径及节点 提供实时可视化成像来指导定位和外科切除术 4 引 因此克服 了许多现有技术的局限性 量子点在识别肿瘤细胞中的研究较多 但用在肿瘤治疗中鲜有报道 量子点 的光学特性使其可以作为光敏剂用于光动力治疗中 b a k a l o v a 等 4 4 在2 0 0 4 年报道 用量子点可以简单识别癌细胞与正常细胞 也可以单独将癌细胞杀死而不影响正 常细胞 他们将量子点与特异性识别癌细胞的糖结合蛋白 又叫植物凝集素 抗体进 行融合 将这种复合物加到癌细胞中 紫外线照射时 癌细胞与这种量子点结合 发出绿色的荧光 正常细胞则不能结合亦不能显色 以此可用来区别正常细胞与 癌细胞 而且经过持续的紫外线照射 可将癌细胞杀死 数据显示 紫外线照射 6 0m i n 后 有1 0 1 5 的癌细胞死亡 这仅是量子点在肿瘤治疗方面应用的尝试 相信不久的将来在这方面的研究会越来越多 单个量子点的灭光光谱成像和散射成像 1 4 5 动物活体成像 动物活体中量子点作为光学对比剂结合荧光成像系统可进行肿瘤的定位 实 时监测肿瘤细胞的生长和转移 对肿瘤动力学的研究及指导癌症手术提供了帮助 聂书明等 4 5 首次实现了用量子点同时在活体内定位和成像 他们用a b ct f i b l o c k 聚合物纳米颗粒层和聚 醇包被量子点 将其附着在单克隆抗体上 此抗体连 接物可以和前列腺肿瘤细胞上的前列腺特异性抗原结合 这种量子点注射入有前 列腺肿瘤的裸鼠循环系统后聚集到肿瘤细胞周围 荧光成像检测可得到载体肿瘤 细胞敏感的多色的荧光图 并获得肿瘤大小和定位的信息 他们还用未结合抗体 的量子点去 被动 的定位肿瘤 发现尽管量子点可以从肿瘤血管上 渗漏 出来并在 肿瘤上聚集 但这个过程比结合了抗体的量子点聚集要慢很多 效果也差 这种 特别设计的量子点在较宽范围的p h 和盐条件下是稳定的 适用于复杂的体内实验 h o s h i o n 等 4 6 1 利用量子点通过内吞作用进入小鼠的淋巴瘤细胞 结果显示 量 子点标记物在细胞中很稳定 不会影响细胞的活动和功能 被量子点标记的淋巴 瘤细胞经尾静脉注入小鼠体内 5 d 后用荧光显微镜和流式细胞仪结合组织切片观 察 量子点标记物在外周血中的浓度约为1 0 7 d 后在鼠的肝 肾 脾 肺中仍 可观察到约2 0 的标记细胞的初始量子点 b y r o n 等1 4 7 将一组4 种表面各有不同修 饰层的量子点注射入鼠体内 经循环实验发现 表面不同修饰的量子点在体内的 半衰期也不同 利用表面材料 可确定量子点在体内的位置 实验结果表明 在 体内4 个月后 这些量子点仍能发出荧光 在生物实验中 荧光染料的生物毒性也是关注的焦点之一 动物活体实验数 据表明 在量子点标记的细胞内及动物体内并未出现异常迹象 由此可以说明量 子点荧光标记是一项安全有效的技术 至少在动物活体内如此 量子点作为荧光 标记物在长时程追踪活体内的靶细胞时 是非常有用的生物成像工具 动物实验 的数据也为量子点进一步在临床应用积累了经验 研发适合人体组织的光学影像 探测系统的量子点将是今后重要的发展方向之一 1 5 展望 生命科学的飞速前进离不开新技术新方法的应用 荧光显微成像技术出现后 人们对于细胞内精细结构 细胞间相互作用 细胞信号转导及大分子蛋白的作用 有了更深入的了解 研究人员不断致力于新的荧光成像技术和荧光探针的开发和 研究 但有两大难题一直横亘在探索的道路上 一是无法有效的克服细胞在可见 光区的自发荧光对标记分子所发信号的掩盖 二是由于荧光有机染料分子易发生 光漂白 无法较好的实现对所研究分子的长时程荧光标记观察 这就迫切需要出 现一种有强大的 持续的荧光效应能掩盖细胞的自发荧光且具有抗光漂白作用的 硕士学位论文 新的荧光物质 量子点的许多光学特性恰可以解决这两个问题 而且其尺寸特点 也使得它非常适于在生物荧光成像中做荧光标记物 量子点的出现特别是其在生物学中的应用给生命科学众多领域的研究带来了 曙光 近两年来 随着新一代量子点技术的开发 量子点得到了更广泛的应用 在荧光成像方面展示出无穷魅力 得到了许多非常有意义的结果 在生命科学中 发挥了越来越重要的作用 量子点是新兴的荧光成像材料 高性能的多功能量子点与先进的光学成像技 术相结合 为实时地动态地监测细胞内和生物活体内的分子事件提供强有力的实 验手段 为揭示生命活动规律及研究疾病的发生 诊断 治疗提供了新技术新方 法 极大地促进了生命科学的发展 随着荧光标记研究领域的日益深入 如何提 高量子点的生物相容性及对标记物的敏感性 特异性 稳定性及荧光的高效性等 多方面的研究 将是下一步的重点 另外 如何更高效地将量子点与识别分子相 结合也是一个有待解决的问题之一 然而 尽管在应用中存在着这些难点 量子 点作为一种新的荧光标记物仍将为荧光成像带来新的高峰 对细胞生物学 光子 学成像及医学领域也将会产生深远的影响 1 6 本论文涉及的内容 量子点具有光谱对称分布 宽度窄 颜色可调 光化学稳定性高 不易光解 等优良的光学特性 其最有前途的应用领域是在生物体系中作为荧光探针 将不 同材料的量子点与生物大分子偶联 但特定的光谱范围内只能使用一种量子点进 行染色 难以单通道下同时检测多色量子点 同时 量子点虽然光化学稳定性高 长时间照射仍表现为光漂白 至今并没有学者给出光漂白现象的直接证据 本论文针对这些问题 开展了以下工作 1 研究多色量子点的同时单通道检测 两种不同的量子点分别标记牛血清蛋 白 并将标记了不同量子点的牛血清蛋白按照一定比例混合 以放置透射光栅的 普通宽场荧光显微镜为手段 以分别标记了不同颜色q d 的b s a 混合液为对象 借 助光栅的分光作用 将发射光分成一个零级点和一个一级条纹光谱 测量两种量 子点的零级和一级光谱距离 实现单通道检测器下的双色量子点的同时成像 2 研究量子点的散射成像 给出量子点光漂白现象的直接证据 长时间光照 条件下 量子点个数减少的原因可能有以下三个原因 一 玻片上已吸附的量子 点发生了脱附 二 量子点长时间的光照条件下发生光漂白 三 量子点蓝移出 滤光块的波长范围 通过优化实验条件 以暗场成像和荧光成像相结合的方法获 得单个量子点的暗场散射成像 对比量子点漂白前后的暗场成像 证明长时间光 照条件下 量子点发生光漂白现象 单个量子点的荧光光谱成像和散射成像 2 1 引言 第2 章双色量子点同时荧光光谱成像 q d s 最有前途的应用领域是在生物体系中作为荧光探针 将不同材料的q d s 与生物分子相偶联 就可以代替很多荧光染料分子 每种有机染料分子都需要自 己相应的激发光源 虽然半导体量子点组成和粒径大小不同时可以发出不同波长 的光 而且半峰宽窄 峰形对称 但是在一个特定的光谱范围内只可以使用一种 颜色的量子点进行染色 这就难以在单通道下 同种溶液中研究两种或两种以上 量子点的标记物 如果将某一生物过程中有关的生物分子标记不同颜色的q d s 就可以实现对活 细胞内部生物分子之间的相互作用进行检测 或实时观测特定受体的相互作用 从而在蛋白标记 细胞器定位 信号转导原位杂交 胞内组分的运动和迁移等研 究中发挥巨大作用 这必将大大推动生物活体成像的研究进程 目前 多色量子 点的检测主要通过多通道检测器实现 但多通道的透光率限制了成像分辨率 而 单通道由于本身的限制性 每一个像素代表一个灰度值 见附录c 图1 2 其检 测呈现黑白像素图像 只能分辨出一种发光量子点 如果能在单通道下实现检测 多色量子点 就可以大大减少实验仪器的成本 更有利于简便操作 本论文借助透射光栅以荧光光谱成像方式 对同一溶液中标记了两种不同量 子点的牛血清蛋白荧光光谱进行了研究 通过测量两种标记物零级和一级光谱之 间的距离 成功实现了单通道检测 为实现活细胞内生物分子相互作用的检测打 下了基础 透射光栅是衍射光栅中的一种 利用多缝衍射原理 可使复合光发生色散 h a r t 等人 4 8 1 利用透射光栅的分光作用 在荧光显微镜下研究了单个分子的荧光光 谱 l i t 4 9 j 等人利用透射光栅追踪了溶液中运动的单个量子点的分子光谱 2 2 实验部分 2 2 1 试剂与仪器 2 2 1 1 试剂 羧基修饰的量子点 q d 5 2 5 q d 6 5 5 8 m i t k t m i n v i t r o g e n m o l e e u l a rp r o b e s e u g e n e o r u s a 牛血清蛋白 b s a 2 4 1 t m g 冻干粉 北京鼎国生物技术有 限责任公司 硕士学位论文 硼酸盐缓冲溶液 5 0 m m p h 9 0 其它试剂为国产分析纯 实验用水为m i l l q w a t e r m i l l i p o r e 所配溶液均用o 2 2 m 孔径的滤膜过滤 2 2 1 2 仪器 正置荧光显微镜 o l y m p u sb x 5 1 j a p a n 1 0 0 x 油镜 u p l s a p 0 o l y m p u s j a p a n 汞灯 电子倍增耦合器件 e m c c d d v 8 8 7 a n d o rt e c h n o l o g y n o r t h i r e la n d 透射光栅 7 0 1 i n e s m m e d m u n ds c i e n t i f i c b a r r i n g t o n n j u s a 超滤 离心管3 0 k d 5 0 k d 1 0 0 k d m i c r o c o n m i l l i p o r e u s a 载玻片 s h i t a ie x p e r i m e n t e q u i p m e n tc o l t d c h i n a 盖玻片 e l e c t r o nm i c r o s c o p ys c i e n c e s p a u s a 滤光片 f i t c 3 5 4 0 b t x r e d 4 0 4 0 b 双通 f f 0 1 s e m r o c k u s a 2 2 1 3 数据处理软件 i m a g ej n a t i o n a li n s t i t u t e so fh e a l t h u s a m a t l a b m a t h w o r k s u s a 2 2 2 实验方法 2 2 2 1q d 5 2 5 b s a 与q d 6 5 5 b s a 的制备 取0 5 0 l 量子点 8 1 a m l 硼酸缓冲液稀释至4 t t l 取b s a l o t t l 加入到稀释好的量子点中 取1 0 m g e d c l m l 二次水 配成1 0 m g m l 溶液 取配制好的o 6 u l 的e d c 溶液迅速加入量子点与b s a 的混合液中 将溶液放置摇床上振荡约1 5 小时 4 冰箱过夜 次日再次振荡o 5 小时 超滤离心管离心 正置离心三次 每次2 0 分钟 倒转离心管离心两次 取下层液避光4 c 冰箱保存 2 2 2 2 混合量子点溶液的制备 取5 0m m p h 9 0 硼酸盐缓冲液将量子点q d 5 2 5 b s a q d 6 5 5 一b s a 原液稀释 至合适浓度 取两种不同量子点的标记物按一定比例混合 使最终溶液c 5 2 5 b s a c 6 5 5 b s a 4 1 c 5 2 5 b s a 0 8 n m c 6 5 5 b s a o 2 n m 振荡 摇匀 4 c 冰箱保存 待 用 2 2 2 3 未加光栅 显微镜观察 取2 1 x l 混合液制片 送荧光显微镜o l y m p u sb x 5 1 观察 1 0 0 x 油镜调焦 不 加光栅观察视场范围内的量子点标记物 q d 5 2 5 一b s a 6 5 5 b s a 各自滤光片下 观察其荧光成像 之后双通滤光片观察两种量子点的荧光成像 1 3 单个量子点的荧光光谱成像和散射成像 2 2 2 4 加入光栅 显微镜观察 常温 电子倍增耦合器件e m c c d 前插入透射光栅 对溶液视场范围内的量 子点标记物q d 5 2 5 b s a 6 5 5 b s a 分别f i t c t x r e d 滤光片和双通滤光片下激 发 拍摄 观测单个量子点零级点与一级条纹光谱间的距离 2 3 结果与讨论 2 3 1 透射光栅的分光作用 本文实验通过e m c c d 前插入透射光栅 使量子点发出的荧光通过透射光栅 后 荧光光谱分解为0 级点和1 级条纹光谱 0 级点和1 级条纹光谱可同时成像 于e m c c d 的芯片上 便于检测 图2 1 透射光栅成像示意图 5 0 n e e s 透射光栅与e m c c d 芯片间的距离 九 量子点的荧光波长 d 光栅常数 o t h 0 级光 谱点 1 s t l 级光谱条纹 l 0 级点与1 级条纹光谱间的距离 q df l u o r e s c e n c e 量子点荧 光 t r a n s m i s s i o ng r a t i n g 透射光栅 e m c c dc h i p e m c c d 芯片 图2 1 量子点所发出的荧光经透射光栅分光后在e m c c d 芯片上的成像示意 图 s 光路中透射光栅与e m c c d 芯片间的距离 九 溶液中单个量子点所发出 荧光的波长 单个量子点的荧光波长不同 成正态分布状态 d 透射光栅常数 l 0 级光谱点与其对应的1 级光谱条