（发酵工程专业论文）肌苷产生菌的选育及其发酵条件研究.pdf

天津科技大学硕士学位论史 摘要 本文以代谢控制发酵理论为指导 重点研究了肌苷高产菌的选育及其发 酵条件 主要研究内容和结果如下 1 建立了发酵液中肌苷定量测定的方法 离子交换法 对其最佳分离 条件进行了研究 并与纸层析法进行比较 发现该方法准确度和精确度比纸 层析方法高 可用于简单条件下对肌苷发酵液中目的产物的测定 2 以枯草芽孢杆菌t y 一2 1 为出发菌株 通过硫酸二乙酯 d e s 诱变定 向选育出一株肌苷产生菌t x 一3 其遗传标记为腺嘌呤缺陷 硫胺素缺陷 8 氮鸟嘌呤抗性和磺胺胍抗性 a d e t h 8 a g s g 在未经优化的摇瓶发酵 条件下可产肌苷1 2 4 1 d l 3 研究了枯草芽孢杆菌 b a c i l l u ss u b t i l i s t x 一3 摇瓶发酵生产肌苷的最 佳条件 通过均匀设计和模式识别方法分别研究了肌苷种子和发酵培养基的 最佳配比 在最佳条件下 摇瓶分批发酵产量为1 8 9 4 l 同时采用流加方 式研究了摇瓶补料分批发酵条件 该条件下肌苷产量可达到2 4 7 9 l 4 利用5l 罐分批发酵数据 对发酵过程进行了代谢流分析 基于物流 平衡原理 初步进行了发酵过程的代谢流分析 结合发酵过程曲线分析了肌 苷发酵全程代谢行为 应用t x 一3 菌株的代谢流量平衡模型计算出了肌苷发酵 中后期的代谢流分布并通过m a t l a b 软件线性规划得到理想代谢流分布 结 果表明尽量降低e m p 途径的代谢通量有利于肌苷的合成 提高肌苷合成途径 中各关键酶的活力可有效增加肌昔的生成量 减少副产物的生成和提高发酵 过程溶氧水平均可增加肌苷合成代谢流 关键词 肌苷 枯草芽孢杆菌 诱变育种 发酵 代谢流分析 天津科技大学硕士学位论文 a b s t r a c t a c c o r d i n gt o t h e t h e o r yo fm e t a b o l i cc o n t r o lf e r m e n t a t i o n t h ed i s s e r t a t i o n f o c u s e so nt h eb r e e d i n ga n df e r m e n t a t i o nc o n d i t i o no fi n o s i n ep r o d u c i n gs t r a i n t h em a i nr e s e a r c hc o n t e n t sa n dr e s u l t sa r ea sf o l l o w s 1 t h e m e t h o do fi o ne x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h yw a sd e f i n e dt od e t e r m i n a t e i n o s i n ec o n c e n t r a t i o nq u a n t i t a t i v e l yi nt h ef e r m e n t a t i o nb r o t h t h e s e p a r a t i o n c o n d i t i o n so ft h i sm e t h o dw a s o p t i m i z e d a n d c o m p a r e d w i t h p a p e r c h r o m a t o g r a p h ym e t h o d b o t ha c c u r a c ya n dp r e c i s i o na r eb e t t e rt h a nt h a to fp a p e r c h r o m a t o g r a p h y 2 o n ei n o s i n eh i g h p r o d u c i n g s t r a i n t x 一3 a d e 一 t h i 8 一a g s g w a s d e r i v e df r o mb a c i l l u ss u b t i l i st y 2 1w i t hd e st r e a t m e n t w h i c hc o u l dp r o d u c e i n o s i n e1 2 4 1g lu n d e rt h ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o nw i t h o u tb e i n go p t i m i z e d 3 t h e b a t c hf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o no fs t r a i nt x 一3i ns h a k ef l a s kw a ss t u d i e d i nt h i sd i s s e r t a t i o n t h ep r o p o r t i o n so fs e e dm e d i u ma n df e r m e n t a t i o nm e d i u m w e r eo p t i m i z e db yp a t t e r nr e c o g n i t i o na n du n i f o r md e s i g ne x p e r i m e n t t h es e e d c u l t u r ec o n d i t i o n sa n df e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sw e r ea l s os t u d i e d u n d e rt h e o p t i m u mc o n d i t i o n s t r a i nt x 3 c o u l dp r o d u c ei n o s i n e1 8 9 4 9 lb ys h a k i n gf l a s k b a t c hf e r m e n t a t i o n m e a n w h i l et h ef e db a t c hf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sw e r es t u d i e d t h e p r o d u c t i o no f i n o s i n eu n d e ro p t i m i z e df e db a t c hf e r m e n t a t i o nw a s 2 4 7 9 9 l 4 t h em e t a b o l i cf l u xa n a l y s i sw a sa p p l i e di ni n o s i n ef e r m e n t a t i o np r o c e s s b a s e do nt h ee x p e r i m e n t a ld a t af r o mb a t c hf e r m e n t a t i o ni n5 l i t e rf e r m e n t o r b a s e d o nt h ef l u xb a l a n c ep r i n c i p l e t h em e t a b o l i cf l u xa n a l y s i sm e t h o do fi n o s i n eb a t c h f e r m e n t a t i o nw a sd e f i n e d t h ew h o l em e t a b o l i cp r o c e s so fi n o s i n ew a sa n a l y s e d c o m b i n e dw i t hf e r m e n t a t i o np r o c e s sc u r v e u s i n gm e t a b o l i cf l u xb a l a n c em o d e lo f i n o s i n e s y n t h e s i sb yb a c i l l u s s u b t i l i s m o d e l t h em e t a b o l i cf l u x d i s t r i b u t i o n s d u r i n g t h em i d d l ea n dl a s t p e r i o d w e r ed e t e r m i n a t i o na n dt h e o p t i m a l f l u x d i s t r i b u t i o n sw e r ec a l c u l a t e db yl i n e a rp r o g r a mo fm a t l a bs o f t w a r e t h ef l u x a n a l y s i si n d i c a t e dt h a tr e d u c i n gt h em e t a b o l i cf l u xo fe m pp a t h w a y w e r eu s e f u lt o l i es y n t h e s i s i n c r e a s i n ga c t i v i t i e so f k e ye n z y m e s i ni n o s i n eb i o s y n t h e s i sp a t h w a y w o u l di n c r e a s ei n o s i n ep r o d u c t i o n r e d u c i n gb y p r o d u c ts y n t h e s i sw e r ei m p o r t a n t f o ri n o s i n eh i g hp r o d u c i n g a sw e l la st h eh e i g h t e n i n gs o l u b l eo x y g e nl e v e l k e y w o r d s i n o s i n e b a c i l l u ss u b t i l i m u t a g e n i cb r e e d i n g f e r m e n t a t i o n m e t a b l i cf l u xa n a l y s i s 天津科技大学硕士学位论文 1 前言 1 1 肌苷的理他性质 肌苷 1 n o s i n e 缩写i r 又称次黄嘌呤核苷 是次黄嘌呤和核糖的缩合物 其磷 酸酯为肌苷酸 次黄嘌呤核苷中 在次黄嘌呤碱基n 9 的位置上 以糖苷键的形式联 结了以呋喃形式存在的核糖的第一位碳原子 肌苷分子式为c 1 h 1 2 n 4 0 5 相对分子质 量2 6 8 2 3 其化学结构为 o h 肌苷为白色结晶或呈无水粉末状 易溶于水 口h 近中性 在饱 1 1 水溶液中约含 肌苷1 5 盛 l 在稀盐酸或氢荤眦钠溶液中易溶 在氯仿 乙醇中不溶 无臭 昧微苦 熔点为2 1 8 c 肌营在水中存在三种晶体形式 1 两个结晶水的晶体 常见的肌苷 2 a 型 斜方晶 无水晶体 3 a 型 单斜晶 无水晶体 常温下 加 肌昔主要以两个结晶水的晶体形式存在 在较高温度下 存在 两种无水晶体形式 肌苷分子中的碱基存在酮式和烯醇式互变异构现象 所以在碱性 条件下烯醇式结构的分子能显示出弱酸 生 和碱反应生成盐 肌苷钠容易和水结合成 带2 5 个结晶水的月n 苷钠晶体 在水中溶解度增大 在肌苷工业生产中 利用肌苷和 h n 昔钠盐之溶解度不同的性质 通过调整溶液p h 值的方法 将肌苷从溶液中结晶分 离出来 胍苷除了能和碱反应生成盐外 还可和酸反应生成盐 这是由于目n 苷分子中 碱基上的氰原子和氢离子作用的结果 在朋着工业中 将肌苷发酵液的d h 值调为3 4 使肌苷变成带正电荷的离子 然后将该渤盈过阳离子交换树脂 使肌苷阳离子在树脂 上进行交换并吸附 其它不带正电荷的杂质则不被交换吸附 使月n 蔚得到分离 肌苷在酸 碱陛溶液中会发生降解 在中性溶液中则较稳定 因此 为了使肌苷 在溶液中稳定不分解 可加入含有磷酸盐的缓冲溶液 加热并调口h 值为7 4 至少可 保持6 个月之久 利用肌苷该性质可较长时间保存待分析检测的肌苷样品 需要时再 将样品的p h 值调至测试所规定的酸度值进行肌菅含量1 3 q n 定 以满足分析工作中的 某些需要 在酸眭溶液中 肌苷降f 挥的产物为次黄口票呤和d 核糖 该反应被认为是酸眭催化 1 前言 水解 在减眭溶液中 肌昔发生三个竞争反应 温度升高 反应速度明显加快 该三 个竞争反应及酸幽撇解反应在日n 着工业生产过程中都会发生 是造成肌苷降解损 失的主要原因 因此在肌苷发酵液调至酸性后 应尽量缩短其停放时间 以减少酸胜 降解损失 在肌苷溶液蒸发浓缩过程中 工业e 采用提高真空度的方法 以阿氏其蒸 发温度 同时尽量缩短蒸发时间 使月n 苷在碱性溶液中的降解损失减少到黾低值 2 由于肌苷分子中的碱基含有共轭体系 所以肌苷分子能吸收紫外光 当溶液d h 值 在3 6 时 肌苷在紫外最大吸收波长为2 4 8 5 n m 最大摩尔吸光系数为1 2 2 5 0 当溶 液p h 值为1 1 2 时 最大吸收波长为2 5 3 n m 最大摩尔吸光系数为1 3 1 0 0 当溶液中 含2 nh c i 时 最大吸收波长为2 5 1 r a n 最大孽尔吸光系数为1 0 9 0 0 1 根据以上吸光 特 生 可定性或定量分析检钡4 肌苷 1 2 肌苷的用途 在食品方面 肌营是57 肌苷酸的前体 而5 肌营酸是食品工业中重要的助鲜剂 可与鸟苷酸 谷氨酸钠以一定比例混合制成复合鲜味剂一一强力味精 对传统味精的 升级换代起重要作用 肌苷可直接透过细胞膜 进入 体细胞内 使处于低能缺氧状态下的细胞 荻复正 常水平 继续进行新陈代谢 并能活化丙酮酸氧化酶类 参与人体细胞蛋白质的合成 具有激活细胞 刺激代谢等良好作用 当细胞内a t p 含量显著或持续下降时 细胞功鲥氐下 此时细胞进 低自罄陕态 a t p 的加入可以解除i 新州聂能状态 但瑚 p 不能透过细胞膜 而日n 若对细跑有高度的 渗透陉 因此 肌苷是唯 代替 体增加a t p 的药物 月n 营进入 细胞后生成丙酮酸 丙酮酸可分解为辅酶a 和乳酬 肌苷的医用价值较广泛 主要应用于心脏疾病 肝脏病 白血球减少症 放射陛 照射病 贫血病 血吸虫病 视网膜炎 神经萎缩 毛地黄中毒等症 日月昔还可以制 成肌苷二醛 异丙肌苷 对精巢t 皮瘤 麦粒细胞癌以及某些病毒性疾患都可以起缓 解或抵抗作用 还可以制造干扰素的诱导剂 其毒副作用小 安全 勤于 也是预防肝 炎 心血管疾病等多种疾患的良好保健药品 肌苷除作为药用外 以它为起始原料 可以合成多种抗病毒药 病毒唑是由肌育衍生出的抗病毒药 近几年发展很怏 无环 鸟苷是第二代新型广谱抗病毒药 是我国规划重点发展的抗病毒药物之一 我国首刨 了以肌苷为原料合成无环鸟苷的工艺路线 从日n 营取得次黄嘌呤 然后合成乙酰鸟苷 进而合成无环鸟苷 异丙腮若是一个潜在开发的肌菅衍生物 它除了具有抗病毒作用 外 同时具有延缓衰老和增强i 己忆的作用 也是一种延缓衰老的保健用药 2 3 双 脱氧肌苷 d d i 是新开发的以肌苷为前体物的艾滋病治疗药物 在美国已正式上市 叼 1 3 肌苷的测定方法圈 肌苷的分离测定方法有离子交换法 纸层析法 纸电泳法 薄层色谱法 高压液 天津科技大学硕士学位论文 相色谱法等方法 这些分离定量方法各有利弊 如高压液相色谱是一种高效能的方法 时间短 需样量少 分析时间短 但仪器昂贵 难于普及 离子交换 纸层析 纸电 泳等分离定量方法 灵敏度稍差 时间长 但历史悠久 设备简单 操作方便 只要 选择好适当的分离条件也可达到要求 应用较广泛 1 3 1 离子交换法分离测定肌苷 离子交换柱层析是根据物质的酸碱度 极性和分子大小的差异而予以分离的技 术 应用离子交换层析技术分离测定核酸类物质 是由科恩等开发的 现已作为准确 可靠的标准方法而被广泛采用 既可以应用强碱l 生阴离子树脂以硼酸缓冲液分离发酵 液中的朋昔和次黄嘌呤 也可以应用强酸性阳离子交换树脂用醋酸或盐酸淋洗液梯度 洗脱分离提纯肌苷 1 3 2 高压液相色谱法分离测定肌苷 高压液相色谱的特点是采用长而细的层析柱 柱内填充物的粒度较细 在 3 0 l o o k g c m 2 的高压下操作 具有分辨力高 分椰惠度 点 适用于核酸类物质 的分离分析 可在几分钟到几十分钟的短时间内定量分离0 1 1 匝g 的样品 核苷类物 质的分离所用吸附剂为薄膜阳离子交换剂 洗脱缓冲液为甲酸铵或磷酸二氢铵溶液 国内应用i i p l c 方法测定朋若含量的研究也有重要进展 具体方法见 文献 w 1 3 3 酶法分析铡定肌苷 使用酶法分析测定核酸类物质 即使样品中混杂有异构体或结构类似物之类的物 质 也能利用酶的底物专 性而区别定量 而目 酶法分析还有能够同时定量分析多种 待测物质的优点 但是在酶法分析中 有时需将样品稀释几百倍乃至几千倍后再j 撕亍 测定 其分析结果受测定的紫外吸光度变化的微小误差的影响甚大 故定量和测定操 作需小心进行 酶 去测定日n 苷使罔核苷磷酸化酶和黄嘌呤氧化酶 由肌昔生成次黄嘌 呤 进而生成黄嘌呤 最后生成尿酸进行测定 1 0 州l 1 3 4 纸层析法分离测定肌苷 纸层析法是以滤纸为惰性支持物 利用各种物质不同的分配系数 使混合物随流 动相通过固定相时而予以分离的方法 由于其设备简单 价廉 所需样品少 操作方 便 分辨能力一般能达到要求等优点而被广泛采用 在肌苷的分析中 可以使用异丁 醇 氨水 异丁酸 醋酸 氨水 正丁醇 醋酸 水等溶剂系统展层或双向纸层挢 1 3 5 电泳法测定肌苷 带电粒子在电场中向与其自身相反电荷的电极移动称为电泳 纸电泳是以滤纸为 支持物的电泳方法 包括常压 高压纸电泳 纸电泳与纸层析一样 操作较简便 尤 其是通过使用高压 大大缩短了分离时间 现在应用毛细管电泳法进行朋着含量测定 也取得了较好的效果 1 3 1 4 1 3 6 薄层层析法分离测定肌苷 薄层尉i 是将作为固定相的支持剂涂于支持板上而进行的一种层析技术 核酸类 物质的薄层层析是由兰德拉思开发的 与纸层析等分离定量方法相比 薄层层析具有 1 前言 层析速度陕 分离效果好 分辨力高 不产生拖尾及斑点 扩蘸则 等优点而被广泛采 用 有 采用m n 一纤维素 e a e 的薄层 以0 l 0 5 n 盐酸为展开溶剂分离了碱基 核 苷和脱氧核苷 1 4 肌苷的生产方法及生产概况 肌苷生产方法有化学分解法和发酵法两类 但目前在工业生产上实施的只有发酵 法 发酵法就是利用微生物的代谢作用 生物合成并过量积累肌苷 包括添加前体物 发酵法和直接发酵法两类 1 4 1 肌苷的生产方法 1 4 1 1 化学分解法 核苷类物页可用核糖核酸的化学分解法生产 用化学分解法分解r n a 生产核苷 的反应 基本上是磷酸二酯的加水分解反应 由于r n a 是单核苷酸通过3 5 磷酸二 酯键连接而构成的 核苷酸为核苷的磷酸酯 故为了通过加水分解r n a 来生产核苷 需要切断核苷5 o h 和3 o h 位上结合的磷酸二酯键 并目进 步建立核苷不再分解 的条件 由于工艺复杂 收率f 氏 成本高等原因 在工业生产肌苷已不采用化学分 解法 通常为发酵法吼 1 4 1 2 直接发酵法 直接发酵法是借助于微生物具有合成自身所需核苷的能力 通过对特定微生物的 诱变处理 选育出营养缺陷型及核苷结构类1 以物抗性突变株 以解除代谢调节中的反 馈抑制和反馈阻遏 从而达到过量积累某种核苷的目的 1 4 1 3 添加前体物发酵法 添加前体物发酵法是利用核苷酸生物合成途径的补救途径 通过在肌苷生产菌的 培养基中添加前体物次黄嘌呤 使嘌呤碱基通过补救途径直接合成核苷 从而增加肌 苷的生成量 1 4 2 肌苷的生产概况 对肌苷等核酸类物质的研究不过几十年的时间 但取得了举世瞩目的成果 其研 究起源于日本 1 9 1 3 年小玉新太郎等发现干松鱼的鲜味是肌苷酸的组氨酸盐 紧接着 国中等人阐明了y i m p 5 g m p 的呈味j 生 最初 人们从一些天然物质中提取制备肌苷酸 5 一 先从蛇毒 小肠粘膜提 取蛇毒陡磷酸二酯酶 用该酬哿核酸中的a m p 分解成游离状态的y a m p 然后脱氨 生成5 i m p 后来 又从干鱼 乌贼肌肉中提取闺曙再生成y i m p 但是这样的方 法材料不易大量采取 产量很小 无法进行工业化生产 1 9 6 0 年 国中 大村和绪方等 砂酵母中提取r n a 再酶解生产5 j m p 创立了 所谓二步发酵法畸 实现了工业化生产 此方法的缺点是工艺复杂 收率低 成本 高 伴随着二步发酵法的工业化生产 丌始了对不经过r n a 制备阶段的一步发酵法 天津科技大学硕 学位论文 的研究 首先 罔林等 有马等 古屋等 中山等经过大量的研究实践发现 野生型 菌株积累核酸类4 颁的能力都很低 于是人们开始将注意力转向利用生化突变株生产 核酸类物质的研究 1 9 5 7 年 戈斛1 7 j 和帕特里奇掣1 目先后发表了利用大肠杆菌和粗糙脉孢霉的腺嘌呤 缺陷型菌株能在培养液中积累次黄嘌呤的报导 开刨了选育用于直接发酵法生产核酸 类物质的突变株的新纪元 1 9 6 1 年 u c h i d a t l 9 1 等首先报导了从b a c i l i u s 菌种的突变株来获得肌苷 a o l d m l 腺嘌呤缺陷型b s u b t i i i s 为出发菌株进行诱变 得到并分离出多重营养缺陷型突变株 其中c 3 0 a d e h i s 廿n 被发现具有低的肌苷分解活力 能够积累6 3 m g m l 肌苷 1 9 6 7 年 n o g a m i 等从亲株b a c i l l u s p n o1 0 2 得到一个具有腺嘌呤抗性的突变株 肌昔累计 达到1 1 7 m 咖l 随后获得具有低的核苷磷酸化酶活性的突变株 其同时积累的嘌呤 碱基的量是可以忽略的 s h i i o 等从b s u b t i l i sr d a 1 6 中获得具有抗低水平8 氮乌嘌呤 的突变株 它需要腺嘌呤 并且缺乏腺嘌呤脱胺酶活性 发现其中一个突变株的p r p p 转酰胺酶不被嚎嘌呤所抑制 能够积累1 8 m g m l 的肌苷 e n e i 等发现具有高的核苷酸 酶活性的b s u b t i l i sa l 1 1 0 4 4 可以产肌苷2 0 9 l m a t s u i 等同样发现核苷酸酶活性在叽 苷积累中具有重要的作用 1 9 8 0 年得到苏氨酸挠 生的b s u b t i l i sa l1 1 3 7 4 可以积累 1 5 9 l 的肌昔 而其亲株只能积累0 9 9 l 肌苷 m i y a g a w n 等通过n t g 诱变得到的 b s u b o j i si f o 1 4 1 8 9 可以积累1 8 罾e 的肌苷 嘌呤核苷发酵是典型的代谢控制发酵 不仅优良的生产菌株选育是日n 昔发酵的关 键 而且由于任何菌株最终都必须落实到反应器水平的发酵控制才能应用于实际生 产 因而 发酵条件的控制对产苷也至关重要 甚至成为生产上影响产苷的主要因素 关于i 匿冈搅拌剁斗对发酵的影响进行了大量的研究 a 出 等发现摇饭发酵中肌苷积 累的最适氧吸收速度系数趔为7 8 1 0 4 m o u a t m m 1 m i n 随后的放大中提出以氧传 递速率 为依据调整空气流量和搅拌转速 通过维持相当成功地将摇瓶条件放大到 5 0 m 反应器规模 s h i b a i 2 1 删等通过一系列研究发现枯草杆菌发酵生产肌苷时 通风 不仅起到供氧的作用 而且还具有降附著养液c o z 分压的作用 培养基的高c o 分压 对叽苷发酵有抑制作用 所以即使在供氧充分的条件下 若通气量小起不到应有的换 气效果 肌昔的积累也会受到抑制 国内围绕影口铲苷的工艺进行了大量的研究 张克旭掣船 通过均匀设计对培养基 成分 初始p h 值 菌龄 通风 温度 温度对产茜影响的研究 得到了较好的产萤 得率 吴先道等人认为不同发酵时期通过控制相应的排气c 0 2 量调节发酵通风量有利 于肌苷积累 对生产有指导意义 李崇等研究了通气 搅拌 接种量及 j f 力口补糖对产 苷的影响 王梦鹤等通过在2 l 发酵罐中调节通风和转速条件优f 艺工艺使产苷提高约 2 5 陈文元 李永刺1 4 j 等分别对肌苷发酵与分离耦合过程的优化条件进行了探讨 研究表明该法与f 可歇发酵相比能显著提高产南峦率和产苷率 此外 已知补救途径在 发酵过捌空制中也司发挥重要作用 1 9 6 5 年 1 a n 0 f 2 5 唧提出补救途径螭埽 枯草芽 1 前言 孢杆菌将外部添加的次黄嘌呤转化为肌苷的能力 陈家平等利用枯草芽孢杆菌 7 1 7 1 9 1 菌株 在摇瓶中进行添加次黄嘌呤试验 结果表明 添加1 5 的次黄嘌呤 均有利于肌营的积累 在发酵罐中添加l 的次黄嘌呤使日n 苷产量增产达3 0 庄贤 军 钱铭镛等也证实培养基中添加次黄嘌呤可显著提高产苷 此外 徐海等在静息培 养系统和2 0 吨发酵罐e 都证实翘雠拧忝加次静票呤可使朋苷得率得到提高 1 5 肌苷的生物合成途径及其代时调节机制嘲 肌苷的生物合成途径及代i 身f 调节机制是定向选育肌苷生产菌的理论基础 1 9 5 9 年 b u c h a n a n 等首先利用鸽肝匀浆研究了核苷酸的生物合成途径 接着 h a r t m a n m o s t m a g a s a n i k 等又对此进行了大量研究 现已基本阐明枯草芽孢杆菌肌营生物合 成途径及代谢调节机制 并预测了朋苷生产菌的定向育种途径 1 5 1 肌苷的生物合成途径 核苷酸的生物合哟黼两条 一条是利用葡萄糖等碳源和氮源 以5 i 磷酸核糖 为出发物质的全合成途径 d e n o v o p a t h w a y 一条是由嘌呤碱基由于核糖基化及磷酸 化而合成的补救途径 s a l v a g e p a t h w a y n i s h i k a w a 等对枯草芽孢杆静票呤核苷酸的生物合岗鑫径的研究结果表明 葡萄糖 经h m p 途径生成5 磷酸核糖 从5 埔 酸核糖经过1 1 步酶促反应生成肌苷的直接前 体物i m p i m p 再经脱磷酸化转化为肌苷 同时在枯草芽孢杆菌中 从i m p 开始分出 两条环形路线 一条是经过x m p 合成g m p 再经g m p 还原酶的作用生成i m p 另一 条是经a 立 s a m e 合成a a 佃 再经过a m p 脱氨酶的作用生成i m p 从而实现a m p 和 g m p 的相互转变 在枯草芽孢杆菌中 嘌呤核苷酸的全合成途径如图1 1 所示 由此可见 i m p 是 肌苷的直接前体物 i m p 由全合成途径生成后 再经脱磷酸化即转变为肌昔 6 i 堡 垄盔兰堡圭兰堡堡苎 一拔蒲器鼢o ho h 零 娑p r p p 引 黼 p r j 干音戒礴 转蔬艘酶 6 hb 占 磷酸 蔓搪熊磷靛 f f 壤p p 篓 良 争 w 如蔷 q n m 一 刚张 眙螨 f n h t v 阿 j 碡酸梭搪瞎 r p r a 甘氟盛 a 1 p a d p h p 监 n i n o 甲 t h f 眦o t h 譬 o o 1 一 辩艘接蛞甘氟礴 转转甲蹴謦 甲酰甘氰瞧辖括背缓 f f g a r 虻一 h n 8 0 h j i i i 瓦i i h n 一 盘一 5 钮崔味畦核拌醴 r a f r s 氯莲一4 甲酸噼唑丰薹苷酸 c a i r 嘞0 l 坪化脱 水爵ti m p d 幽 h y 蚓 5 二矾苷醵 5 f m p j c x e 挺丁坶二二 5 甲最胺 4 氰甲酰眯唑 棱替融 f a i c a r r 铽髋鞍技瞽酸 g a r 0 c 5 7 栽蓦 4 一骁珀基 代铽 审酰睬矬核苷酸 s a i c a r l 馏鬻k 反二 啦 of h n c n 州0 n h i n c c h 知岣 昧鑫辫器是畚 a m p g m p 图卜1 嘌呤核苷酸的全合成途径 瞻1 1 d e n o v o p a t h w a y o f p u r i n e r i l 0 n u c l c o t i d e b i o s y n t h b 7 o 函心 奠 醚 菪 瞄挈 专 佣 孽一 州姐吣 m i p 矿 州 1 前言 此外 在肌苷的发酵生产中 补救途径亦具有重要的功能 当全合成途径受阻时 微划勿可通过j 笏辑睐合廊獭着酸 嘲途径也 际分段合髓姑豆b 铪届遴径 是 旨微 生物从培养基中取得完整的嘌呤或嘧啶 和戊糖 磷酸通过酶促反应直接合成单核苷 酸 与补救途径有关的酶包括核苷磷酸化酶 碱基 r 1 p 一核苷 p i 核苷酸焦磷酸 化酶 碱基 p i 岍 一5 1 一核昔酸 p 峨 和核苷酸磷酸激酶 核苷 江p 5 i 核苷酸 a d p 其中最为重要的是核苷酸焦磷酸化酶所催化的反应 枯草芽孢杆菌能利用外部添加的 次黄嘌呤 通过核苷酸焦磷酸化酶的作用 使嘌呤日或基与p r p p 合成为相应的嘌呤核 苷酸 肌苛生物合成的补救途径如图1 2 所示 核苷酸 p 核苷 a d pa t p 图1 2 嘌呤碱基 核苷和核苷酸的相互转变的补救途径 l v l g 1 2s a l v a g e p a t h w a y o f t r a n f o r m a m o n g l m r i n e b a s b r i b o n u d e o s i d e a n d n b o n u c l c o f i d e 1 5 2 肌苷合成的代谢调节机制 对枯草芽黼 菌的研究结果表明 在a m p 生物合成途径中专 性酶 s a m p 合 成酶 仅受a m p 系物质的反馈阻遏 g m p 生物合成途径中专 性酶 i m p 脱氢酶 仅受o m p 系物质的反馈阻遏 与a m p g m p 合成共用的i m p 生物合成有关的酶 i m p 转甲酰酶 s a m p 裂解酶 p 砒甲转酰胺酶 受a m p 系 g m p 系任 物质的反馈阻 遏 另外 嘌呤核苷酸生物合成途径中的关键酶有p r p p 转酰胺酶 i m p 脱氢酶和 s a m p 合成酶 其中 唧转酰胺酶特异煅a h 佃 a d p 的完全反馈抑制 但也 受i m p g m p x m p 和a t p 的抑制 不过抑制程度较弱 i m p 脱氢酶受g m p 最强 的反馈抑制 5 8 其次是如 pg o x m p 3 9 g t p 2 6 的反馈抑制 综合上述结果 枯草芽孢杆菌中嘌呤核苷酸生物合成的调节机制是 在a m p 的 生物合成中 p r p p 转酰胺酶受a m p 的反馈抑制 i m p 生物合成系的酶和a m p 生物 合成系的酶受腺嘌呤系化合物的反馈阻遏 在g m p 的生物合成中 i m p 脱氢酶受g m p 的反馈抑制 i m p 生物合成系的酶和g m p 生物合成系的酶受g m p 的反馈阻遏 从 i m p 合成a m p g m p 倾向于优先合成g m p 天津科技大学顼士学位论文 p r p p 台成途径 优先合成 反馈抑制 反馈阻遢 p 图1 3 枯草芽孢秆菌中嘌呤核苷酸生物合成的调节机制 f i g 1 3 m 曲i b 0 艋c l 鼬蚰n n 搬由a i l 劬o f p u 豳e b 0 i l 嘴k 嘣d e i i l 且捌酗治 当培养基中腺嘌岭和鸟嘌呤过剩时 腺嘌呤和鸟嘌呤便对p 磁中转酰胺酶产生阻 遏作用 使萄潍通过补蝴合成嘌呤核苷酸 但是 补救甚陉也存舀玳谢调控问题 已知在枯草芽孢杆菌中 补救途径中的酶 核苷酸磷酸化酶 核苷酸焦磷酸化酶及 核苷酸磷酸激酶等所催化的反应亦为多种嘌呤核苷酸所抑制 如x m p 焦磷酸化酶受 到g t p 特别强烈的反馈抑制 1 6 肌苷产生菌育种思路 根据丰古草芽孢杆菌生物合成的代谢调节机制及成功的育种实例 肌苷生产菌的定 向育种途径如下 1 6 1 选择5 核苷酸酶活力强的菌株 由5 肌苷酸生成肌苷的反应由5 核苷酸酶所催化 5 一核苷酸酶活力强 则有利 于5 一肌苷酸转化成且门苷 从而使肌昔得以大量积累 实践表明 以具有一定产苷能力 的枯草芽孢杆菌作为出发菌株 更有希望在短期内获得肌苷高产菌 1 6 2 切断支路代谢 1 选育丧失s a m p 合成酶的突变株 即腺嘌呤缺陷突变株 可切断从i m p 到 a m p 支g 射啪十 通过限量 忝加腺嘌呤榴除腺嘌岭系化合物对m 生物台成的 反馈调节 增加肌苷前体物i m p 的积累 2 选育丧失i m p 脱氢酶或x m p 氨化酶的突变株 即黄嘌呤缺陷突变株或鸟嘌 呤缺陷突变侏 通过限量添加黄嘌呤或鸟嘌呤来解除鸟嘌呤系化合物对i m p 生 物合成的反馈调节 增加肌昔前体物i m p 的积累 3 选育a d e 一 x 鲫 或a d e 一 g u 双重缺陷突变株 切断i m p 到a m p 和i m p 到g m p 两条支路代谢 通过限量控制腺嘌呤和黄嘌呤或鸟嘌呤来解除腺嘿呤和 1 前言 鸟嘌呤系化合物对i m p 生物合成的反馈调节 使i m p 大量积累 从而使肌苷得 以大量积累 4 选育硫胺素缺陷突变株和组氨酸缺陷突变株 分别切断c a l r 至i 硫胺素和从 a i c a r 到组氨酸的支咯f 锄 加强主代谢漉 从而增加肌苷的积累 5 选育核苷磷酸化酶活力微弱或丧失的突变株 使生成的肌苷不再分解成次黄 嘌呤 1 6 3 解除菌体自身的反馈调节 通过选育抗腺嘌呤 鸟嘌呤结构类似物如8 a g 6 m 1 8 r 等与 或 抗磺 胺类药物如s g r s 下等突变株 造就肌遗传上解除正常代谢调控的理想菌株 这是因 为 菌体带上彳弋鞠封茜抗物抗陛标记后 一个可能途径是关键酶 如p r p p 转酰胺酶 的结构基因发生突变 使关键酶的调节部位不再自跻口效应物结合 而滑陡中心部位却 不变 因此当细胞中已有大量最终产物时仍能继续合崩亥产物 另 个可能途径是调 节基因发生突变 使阻遏物不再能和效应物结合 因此当细胞中已有大量最终产物时 由于其不自邑与阻遥物相结合 故仍能继续合成有关的酶 在肌苷生产菌的选育中 常 用的代谢拮抗物主要有8 氮腺嘌呤 8 氨鸟嘌呤 6 巯基嘌呤 磺胺胍 磺胶哒嗪 磺胺嘧啶等 1 6 4 增加前体物的合成 由于肌苷生物合成的最初前体物是5 埘牾佥陔糖 所以选育丧失转酮酶活力的突变 株 可以切断h m p 途径中该酶所催化的反应 使5 一磷酸核糖的积累增加 从而增加 肌苷生物合成的主代谢流 选育转酮酶缺陷的方法是 选育不利用肛葡萄糖酸或l 阿拉伯糖等必须通过磷酸燃趟 新亍代谢的糖类的突变株 或者选育莽草酸缺陷突 变株 总之 以枯草芽孢杆菌为出发菌株 肌苷高产菌直该具有以下标记 即 a d e 一 x a n 一 h i s 8 a g s g n p 一 k s m r d e a g m p r e d g u 一 1 6 5 睨苷产生菌育种实例 1 9 6 7 年 百濑等 佐藤等 石井等对芽孢杆菌属嘌呤核苷酸生物合成的代谢调节 机篇 j i 挂 亍了深入的研究 发现了 系列嘌吟核苷酸类物质的发酵机制 1 9 6 9 年 奈良 木下祝郎等对产氨短杆菌嘌呤核苷酸类物质的生物合成调节机制也进行了研究 为核 酸类物质的发酵生产提供了理论基础 为肌苷生产菌的育种工作打下了坚实的基础 以后 陆续选出了许多肌苷生产菌株 包括枯草芽孢杆菌 短小芽融杆菌 产氨 短杆菌及其他微生物等 1 9 6 8 1 9 8 0 年枯草杆菌n o 1 0 2 经过紫外线照射和d n a 转化法得到腺嘌呤和黄瞟 呤双重缺陷型 并对8 氮杂鸟嘌呤有抗l 生的突变株 g 3 4 6 2 2 6 突变株可以生成 2 2 3 岛几的肌苷 或在次黄嘌呤 1 存在下 生成3 3 1 舀l 的肌苷 1 9 7 6 年将产氨短杆菌突变株a t c c 6 8 7 2 用n t g 处理后 在涂布于含有6 一疏基鸟 嘌呤的培养基上 由此选出菌株a t c c 2 1 4 7 7 用各种阻遏剂及抑制剂孙童些突变株与 天津科投大学硕士学位论文 亲株进行比书猕疆睑 结果a t c c 2 1 4 7 7 的i m p 生物合成的酶系不受阻遏剂阻遏 也不 受抑制剂的抑制 将a t c c 2 1 4 7 7 再用药剂处理 获得腺嘌呤和鸟嘌呤双重缺陷型突 变株衄c c l 4 8 0 可产肌苷高达5 2 4 9 j l 1 9 7 3 年 还选得了短小芽孢杆菌肌苷生产菌a s b 5 7 4 1 8 0 2 1 可产肌苷8 4 9 l 恢菌是腺嘌呤 苏氨酸 组氨酸三重缺陷型 相比之下 我国的肌昔工业起步较晚 与先进水平有一定差距 但经我国科学工 作者的努力 取得了很大的进展 1 9 7 2 年 中国科学院上海生化所以枯草杆菌n o 1 0 1 为出发菌株选得具腺嘌呤 硫胺素缺陷型的菌株7 1 7 1 d 1 产苷1 1 6 5 9 l 2 8 1 1 9 8 6 年 复旦大学选得f d 8 6 0 1 在5 l 自控罐e 发酵可产苷2 6 5 9 u 凹3 1 9 8 4 年 江苏微生物 研究胛划以7 1 7 1 6 1 为出发菌株 经诱变处理 获得一株具有腺嘌呤 组氨酸 硫胺 索三重缺陷并对8 氮杂鸟嘌呤 6 一巯基嘌呤具有挠f 生的突变株j s 饵1 0 1 9 该菌株摇 2 0 酽l 天津轻工业学院张克旭 陈宁等近来对日n 苷萄粥是育做了大量研究 通过诱变 转化 融合等方法选得多株肌苷高产彦争矧 最高达2 7 8 5 扎 南开大学的 王岳五 张蓓等将原生质体诱变技术蝴狞硼昔生产菌株的选育 证明非常有效 3 1 l 1 7 代谢工程与肌苷工程菌的构建 代谢工程珏剀是指应用重组d n a 技术和应用分子生物学相关的遗传学手段进行有 精确目标的遗传操作 改变酶的功能和输送体系的功能 甚至产能体系的功能 以改 进微生物细胞某些方面的代谢清 生的整套工作 包括代谢分析 代谢设计 遗传操作 目的代谢活l 生的实现等 代谢工程的目标是修饰初级代谢 将碳架物质流导入目的产 物的载流途径以获得产物的最大转化率 随着代自扛程与各种学科知识的融合 越来越多的研究方法和策略被应用于代谢 工程的研究 1 分子生物学方法 构建特殊的基因转移系统 尤其对于具有较高生产价值的 教生物 具有重要意义 例如在棒杆菌中 通过寻找土著质粒 利用不同的启动子构建特殊的载体 实现了外 源基因在棒杆菌中的表达 2 分析化学及检测方法 代谢工程的研究对象是代谢途径 因此必须对代谢通路中的 些酶及产物进行研 究和分析 倒 传统的分析通路的手段有 物质平衡 同位素标记 分离障碍突变株 等 目前它们仍然是必不可少的手段 而核磁共振 流氏细胞术的应用则为这 领域 的发展增添了新的活力 3 数学及计算机工具 研字科弋诩j 工程不仅需要遗传学知识 而且需要对宿主菌的生化代谢途径和生理学 有深入的了解 所以有效地将d n a 数据库的信息应用于代谢工程并开发出适合的软 件系统 有利于代谢工程的发展 随着研究的深入 用整体系统观念来研究细胞越来越显得重要 相关的代谢工程 1 前言 理谢姗9 1 也在不断发展 新的检测手段及数学 计算机方法的应用 为人们提供了设 计和改造微生物的条件 代谢工程为发展更为复杂的组织工程 基因治疗直至整个生 命的工程奠定了基础 1 7 1 基于代谢工程理论的肌苷工程菌构建的具体思路 代i 身 工程的具体思路和常规诱变育种技术有所不同 1 改变代谢流 改变分支代谢途径的流量 阻断有害产物 可采驳如下措施 a 加速限速反应 通过克隆对生物合成起限速作用的关键酶基因 加速代谢流的 流动 b 构建 弋谢旁路 用代谓扭程的方法可以阻断或降f 氏副产物的合成 特别是有毒 产物的产生 c 改变能量代谢途径 d 改变分支代谢途径的流量 通过提高代谢分叉点的某一个分支代谢途径酶系的 活力 以得到高产的末端代谢产物 2 扩展代谢途径和构建新的代谢途径 通过引入外源基因 可以延伸原来的代 谢途径 产生新的末端代谢产物 或者利用新的底物作为生物合成的原料 也可构建 新的代 9 j j 鑫径来合成具有新化学结构的代谢产物 a 延伸代谢途径 b 构建新的生物合成途径 1 2 肌苷工程菌的构建 删 从理论上讲 肌苷工程菌的构建策略有下列几种 第一 借助于基因克隆与表达 技术 将肌苷生物合成途径中的限速酶编码基因导入生产菌中 通过增加基因剂量和 或 更换表达调控条件 扩增其表达 导入的限蠛因既可以是生产菌自身的内 源基因 也可以是来自非生产菌 如大肠杆菌 的外源基因 第二 采取类似的方法 扩增表达j j 1 著输出系统的关键基因 或者降低某些基因产物的表达速率 最大限度地 解除肌苷及其生物全合成中间产物对某生物合j 狯径可能造成的反馈抑制 第三 将 多种完整的核苷生物合成操纵子导入另 种核昔生产菌中 构建能同时生成两种甚至 多种核苷的工程菌 实施l 述战略的第一步是有关基因的克隆 特别是限速酶基因的扩增 生物体内 负责催化从p r p p 到i m p 反应步 聚有1 0 个酶 分别由p u t 基因系列负责编码 其中 限速酶之一 p r p p 转酰8 安酶是p u f f 基因的产物 在大肠杆菌中 p u f f 位于一个 三基因的操纵子中 其它两个基因的功能尚不清楚 o f f l 6 2 z p u r f d e d f 一个与启动子 相邻的开放式阅读框 o p e nr e a d i n gf i a m e d 一负责编码一条1 6 2 个氨基酸残基的肽链 d e d f 是操纵子的末端基因 启动基因位于 3 5 位和 1 0 位的基因之帆操纵子的位置在 一2 6 和一2 7 位问变化 并且在操纵子位至少有一个是p u r f 基因阻遏物作用的位点 在 大肠杆菌细胞中 伊受p u r r 基因编码的阻遏物所调控 p u r r 还负责编码调控朋r c 讲f 也 p u r e p u r h j d 和p u r m 基因的阳遏4 驴 1 2 天津科技大学硕士学位论文 由于大肠杆菌被视为原核生物基因表达的典范 因此对枯草芽褂f 菌中基因组合 和调控与生物合成代谢的关系的研究较少 但是枯草芽孢杆菌中的基因类型和代谢途 径等与肠道细菌的有所区别f 4 2 j 枯草芽孢杼菌中p u r 操纵子基因排列顺序为 p u r e k b c o r f q l m n h j d 如图1 4 所示 箭头处为转录起始位点 转录起始于p u