（植物学专业论文）金针茹和灵芝药用成分获取技术的优化.pdf

独创性声明 本人郑重声明 所提交的学位论文是本人在导师指导下独立进行研究 工作所取得的成果 据我所知 除了特别加以标注和致谢的地方外 论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果 对本人的研究做出重要贡 献的个人和集体 均已在文中作了明确的说明 本声明的法律结果由本人 承担 学位论文作者签名 易饧敬日期 幽 歹 g 学位论文使用授权书 本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留 使用学位论文的规 定 即 东北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的 复印件和电子版 允许论文被查阅和借阅 本人授权东北师范大学可以将 学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索 可以采用影印 缩 印或其它复制手段保存 汇编本学位论文 保密的学位论文在解密后适用本授权书 学位论文作者签名 彬妞 日期 沙 p 留 学位论文作者毕业后去向 工作单位 通讯地址 指导教师签名 刚 伙 日 期 伽 6 多 电话 邮编 摘要 灵芝是一种著名的药用真菌 它对于肿瘤病辅助治疗 慢性支气管炎 冠心病 肝炎 高血脂症 神经衰弱 皮肌炎等疾病均有不同程度的疗效 金针菇作为一种药 食兼用的真菌 可预防和治疗肝炎 胃肠溃疡 并具有抗癌 降低血清胆固醇的作用 传统培养这两种真菌的方法费时费力 且品质不易控制 随着现代科学生产的发展 采用液体深层发酵技术可以对这两种真菌进行大规模生产 具有生产量大 占地少 周期短 生产过程易于控制等优点 从这两种真菌中提取的具有免疫调节功能的小分 子蛋白 真菌免疫调节蛋白 具有凝集血细胞的生物活性 同时也表现出促进淋巴 细胞增殖 诱导免疫细胞分泌多种细胞因子等免疫调节活性 本论文对灵芝和金针菇菌丝体的液体深层发酵工艺进行了初步的研究 将两种菌 丝体在以花生和大豆为不同氮源配比的培养基中培养 检测两种菌丝体在摇瓶和静止 培养板两种不同培养方式中的生长状况及干鲜重比较 对在六种不同培养基中培养的 两种菌丝体的生物学特性进行了测定 试验结果表明 静止培养的两种菌丝体干 鲜 重明显高于摇瓶培养 静止培养下 花生培养基中的菌丝体中总蛋白含量略高于大豆 培养基 总糖含量基本等同于大豆培养基中 但每升花生培养基的成本高于大豆培养 基 因此优化的液体深层发酵茵丝体培养基为含有2 0 9 r 大豆粉的培养基 以毕赤酵母为宿主进行了金针菇免疫调节蛋白的重组表达 通过苯酚一硫酸法对 重组蛋白纯品糖含量的分析表明 重组真菌免疫调节蛋白在酵母表达载体中可能发生 了糖基化修饰 经过优化重组蛋白诱导表达技术和纯化技术 获得了高表达和高纯度 的重组金针菇免疫调节蛋白 对纯化后的重组金针菇免疫调节蛋白进行了生物学活性 检测 结果表明 重组蛋白具有凝集血细胞的活性和促进小鼠淋巴细胞增殖的活性 本论文对灵芝和金针菇液体深层发酵的培养基进行了优化 同时也对重组金针菇 免疫调节蛋白的重组表达技术进行了优化 本实验结果为灵芝和金针菇的液体深层发 酵生产开发提供了一定的实验依据 也为真菌免疫调节蛋白的进一步实验研究提供了 一定的理论基础 关键词 灵芝 金针菇 免疫调节蛋白 深层发酵 重组表达 生理学功能 a b s t r a c t a sak i n do fw e l l k n o w nm e d i c i n a lf u n g u s g a n o d e r m al u c i d u mh a sb e e np r o v e dt h a t i ti sa l le f f e c t i v et h e r a p e u t i ca d j u v a n tf o rc a n c e r c h r o n i cb r o n c h i t i s c o r o n a r yh e a r td i s e a s e h e p a t i t i s h i 曲b l o o dl i p i dd i s o r d e r s n e u r o l o g i c a ld i s e a s ea n ds o o nt oc e r t a i nd e g r e e a n o t h 髓e d i b l ea n dm e d i c a lf u n g u sf l a m m u l i n av e l u t i p e s c a nn o to n l yp r e v e n ta n dc u r e h e p a t i t i s g a s t r o i n t e s t i n a lu l c e r s b u t a l s od e c r e a s es e r u mc h o l e s t e r 0 1 i ti sh a r dt o c u l t i v a t et h e s et w of u n g iw i t hat r a d i t i o n a lm e t h o dw a s t i n gt i m ea n de f f o r t s a n dt oc o n t r o l t h eq u a l i t y an e wt e c h n i q u ef o ral a r g e s c a l ep r o d u c t i o no ft h e s et w of u n g ii st h el i q u i d s u b m e r g e df e r m e n t a t i o n t h ea d v a n t a g e so ft h i sn e wm e t h o da r eo b v i o u s s u c ha sh i g h e r y i e l d l e s sp l a c e s h o r t e rt i m e a n dm o r e e a s i l yc o n t r o l l e d 1 1 1 em i c r o p r o t e i n f u n g a l i m m u n o m o d u l a t o r yp r o t e i n e x t r a c t e df r o mgl u c i d u ma n dev e l u t i p e s w i t ht h e i m m u n e r e g u l a t e df u n c t i o nh a sb i o l o g i c a la c t i v i t yi n c l u d i n ga g g l u t i n a t i n gb l o o dc e l l s p r o m o t i n gl y m p h o c y t ep r o l i f e r a t i o n a n di n d u c i n gi m m u n e c e l l st os e c r e t ec y t o k i n e s t h i sp a p e rp r e l i m i n a r i l ys t u d i e s t h el i q u i d s u b m e r g e df e r m e n t a t i o np r o c e s so ft h e v e l u t i p e sm y c e l i ao fev e l u t i p e sa n dg l u c i d u m t h eb i o l o g i c a la c t i v i t i e sw e r et e s t e d t o w a r d sd i f f e r e n tc u l t i v a t i o no np e a n u ta n ds o y b e a nm e d i u mr e s p e c t i v e l y a n dt h eg r o w t h s t a t u si ns h a k e f l a s ka n ds t a t i o n a r yc u l t i v a t e dp l a t e sw a sr e c o r d e d t h er e s u l tw a st h a ti t c o u l dg e th i g h e rp r o t e i na n ds u g a rc o n t e n tt o t a l l yo fev e l u t i p e sm y c e l i ai nt h e p e a n u t m e d i u mc u l t i v a t i o nb ys t a t i o n a r yc u l t i v a t e dp l a t e s i tc o u l dg e tt h eh i g h e rd r y w e i g h ta n df r e s hw e i g h to fm y c e l i u mi ns t a t i o n a r yc u l t i v a t e dp l a t e st h a n i ns h a k e f l a s k i td e m o n s t r a t e dt h a tt h er e c o m b i n a n tf u n g a li m m u n o m o d u l a t o r yp r o t e i nm i g h tb et h e g l y c o s y l a t e dp r o t e i n i n t h e y e a s te x p r e s s i o ns y s t e m w h i c hw a sa n a l y z e db y t h e p h e n 0 1 s u l f u r i ca c i dm e t h o d a l s ot h ep u r i f i e dr e c o m b i n a n tp r o t e i nh a sah i 曲p u r i t y q u a l i f yt h r o u g ha no p t i m i z e dr e c o m b i n a n te x p r e s s i o nt e c h n i q u e 砀eb i o l o g i c a la c t i v i t y t e s ta l s os h o w e dt h a tt h ep u r i f i e dr e c o m b i n a n tf u n g a li m m u n o m o d u l a t o r yp r o t e i nc o u l d a g g l u t i n a t eb l o o dc e l l sa n dp r o m o t el y m p h o c y t ep r o l i f e r a t i o ni nm i c e t h i ss t u d yo p t i m i z e sb o t ht h es u b m e r g e df e r m e n t a t i o nm e d i ao fgl u c i d u ma n de v e l u t i p e sa n dt h er e c o m b i n a n te x p r e s s i o nt e c h n o l o g yo ff u n a li m m u n o m o d u l a t o r yp r o t e i n m e a n w h i l ei tp r o v i d e sa ne x p e r i m e n t a le v i d e n c ef o rt h es u b m e r g e df e r m e n t a t i o no fg l u c i d u ma n dev e l u t i p e s a n dat h e o r e t i c a lf o u n d a t i o nf o rt h ef u r t h e rs t u d yo nf u n g a l i m m u n o m o d u l a t o r yp r o t e i n k e yw o r d s g a n o d e r m al u c i d u m f l a m m u l i n av e l u t i p e s i m m u n o m o d u l a t o r yp r o t e i n f e r m e n t a t i o n r e c o m b i n a n te x p r e s s i o n p h y s i o l o g i c a lf u n c t i o n 目录 中文摘要 i 英文摘要 i i 目录 1 弓l言 1 1 1 灵芝和金针菇的药用价值 1 1 2 灵芝和金针菇深层发酵研究进展 2 1 3 真菌免疫调节蛋白的生物学功能 3 1 4 灵芝和金针菇免疫调节蛋白的重组表达 6 1 5 本实验的研究目的和主要研究内容 6 2 材料和方法 8 2 1 实验材料 8 2 2 实验方法 9 2 2 1 灵芝和金针菇的深层发酵工艺 9 2 2 2 重组金针菇免疫调节蛋白的工程菌表达 1 2 3 结果与分析 1 5 3 1 灵芝和金针菇菌丝体的液体培养工艺 1 5 3 2 金针菇免疫调节蛋白的重组表达技术优化 2 1 3 3 重组蛋白p p i c 9 f i p f v e 的纯化 2 3 3 4 重组蛋白p p i c 9 f i p f v e 的糖含量检测 j 2 4 3 5 重组金针菇免疫调节蛋白的生理学功能检测 2 4 4 讨论 2 6 4 1 灵芝和金针菇的深层发酵培养方法的选择 2 6 4 2 重组真菌免疫调节蛋白表达技术及生理学功能 2 7 5 结 论 2 9 参考文献 3 0 致谢 3 3 东北师范大学硕士学位论文 1 引言 1 1灵芝和金针菇的药用价值 1 1 1 灵芝 1 1 1 1 灵芝的概述 灵芝 g a n o d e r m al u c i d u m 在我国入药已有几千年之久 是我国乃至世界的著名 药用真菌 又名瑞草 俗称灵芝草 在日本也被称之为万年茸 灵芝属担子菌亚门 层菌纲 无隔担子菌亚纲 非褶菌目或多孔菌目 灵芝科 灵芝属 l 灵芝在我国 分布较广 但其野生资源数量有限 且逐年递减 因此 人工栽培技术已逐渐被人 们推广 随着时代的发展 灵芝不仅被人们应用于医药行业 也日益成为一种新的 食品资源 应用于食品饮料等行业 1 1 1 2 灵芝的主要成分 灵芝富含的化学成分丰富i l 灵芝多糖是迄今为止 国内外学者研究最为广泛 的一种从灵芝中分离出来的一种大分子化合物 目前人们已经从灵芝属中的几种灵 芝中分离出了百余多种灵芝多糖 并测定了其结构和活性 灵芝多糖中主要含有葡 萄糖 除此之外还含有阿拉伯糖 半乳糖 木糖 甘露糖 岩藻糖等其他单糖 灵 芝酸是从灵芝中分离出的一种三萜类物质 同时这种物质的存在也是灵芝味苦的主 要原因 目前己分离出的灵芝酸也己达百余多种 迄今为止从灵芝中分离出的其他 化合物还有 腺苷 甘露醇 麦角甾醇 内酯 灵芝碱 牛磺酸 油酸 纤维素 真菌免疫调节蛋白等 1 1 1 3 灵芝的药用价值 灵芝的药用价值历史悠久 3 0 0 0 多年前周朝的 列子 书中就早已有了记载 汉时期的 神农本草经 中也把灵芝列为药物上品 明代李时珍在其编著的 本草 纲目 中对灵芝的功效有较为详尽的记载 灵芝有 益心气 人心生血 助心充脉 安神 益肺气 益脾气 补肝气 坚筋骨 利关节 耳聋 等功划2 1 灵芝可显著地 提高机体免疫功能 可促进淋巴细胞的增殖 提高巨噬细胞 t 细胞 n k 细胞吞噬 和杀伤的能力 灵芝能预防肿瘤的发生和抑制肿瘤的生长 灵芝能消除体内的自由 基 降低体内丙二醛 m d a 的含量 能提高机体超氧岐化酶的作用 可延缓机体 衰老 灵芝可提高红细胞的变性能力 降低血小板的聚集活性 从而对抗血栓有良 好的作用 灵芝可提高机体肝脏的解毒能力从而实现对有毒化学物质的对抗 实现 护肝解毒的功效 灵芝还有降血压 降血糖 降血脂 镇痛 镇静等功效 因此 东北师范大学硕士学位论文 灵芝常被用于治疗神经衰弱 失眠 慢性肝炎 胃病 肾盂肾炎 十二指肠溃疡 冠心病 高血压等急慢性疾病 均有不同程度的疗效 l o 1 1 2 金针菇 1 1 2 1 金针菇的概述 金针菇 f l a m m u l i n av e l u t i p e s 是我国著名的药食兼用类真菌 别名冬菇 朴菇 金菇 构菌 朴蕈 毛柄金钱菌 金针菇隶属于真菌门 担子菌亚门 蘑菇目 口 蘑科 小火菇属 金针菇分布于世界各地 亚洲 美洲 欧洲 澳洲均有其生长地 1 1 j 在我国 金针菇的人工栽培技术也应用得较早 其具有生产周期短 成本低 经济效益高等优点 因此 也被人们广泛应用于医药 食品 饲料加工等领域 1 1 2 2 金针菇的主要成分及药用价值 金针菇的中营养成分丰富 含有丰富的粗蛋白 碳水化合物 粗脂肪 粗纤维 烟酸 矿质元素如铁 钙 磷 钠等 其中蛋白质中含有人体必需的8 种氨基酸 其中的赖氨酸和精氨酸含量极为丰富 因此 其具有预防和治疗肝脏 胃肠等疾病 促进儿童智力发育 增强儿童体质等功效 1 1 金针菇中含有多种的功能性蛋白 3 4 1 9 7 4 年l i n 等人从金针菇中分离出的金针菇毒素 f l a m m u t o x i n f t x 又称毒心蛋白 是一种成孔溶细胞素 5 j 可对人 鼠 家兔等不同动物的红细胞产生裂解作用 使 肿瘤细胞溶胀破裂 且呈量 效关系 并能使肠上皮细胞的渗透性发生改变 从而促 进药物的吸收等作用 金针菇中分离出的核糖体失活蛋白 r o b o s o m ei n a c t i t a t i n g p r o t e i n s r l r 具有抗肿瘤 抗病毒等活性功能 从金针菇中分离出的由1 8 种氨基 酸组成的一种被称为朴菇素 f l a m m u l i n 的蛋白 对小白鼠艾氏腹水癌e c a s 和肉瘤s 1 8 0 有抑制作用i l j 近年来 人们从金针菇分离出来的真菌免疫调节蛋白 除抗肿瘤功效外 还具有抗过敏 抗增殖 免疫调节等功效 1 2 灵芝和金针菇深层发酵研究进展 液体深层发酵技术的概念是2 0 世纪4 0 年代由美国科学家h u m f e l d 所提出的 1 9 4 7 年 h u m f e l d 首先采用深层发酵技术栽培蘑菇菌丝体 酬 并获得了成功 此后 人们也将这一技术应用于野生蘑菇 羊肚菌等菌种的栽培上 自1 9 5 8 年起 我国也 开始研究深层发酵技术在蘑菇中的应用 到上世纪6 0 年代末期 已经能够进行大规 模的食用菌深层发酵生产 7 0 年代初 林忠平等人对灵芝进行了深层发酵研究 初 步研究了其菌丝体的生长过程 培养条件及形态等 7 1 同时深层发酵这一技术也被 国内研究人员应用于金针菇 冬虫夏草 香菇 草菇等食用菌的大规模产品生产中 并逐步应用于医药 食品 饮料等行业 6 深层发酵 f e r m e n t a t i o n 培养 亦称液体发酵培养 沉没培荆1 1 是将菌种生长 所需的营养物质溶解于液体中作为培养基 无菌条件下接入菌种 经过一段时间的 2 东北师范大学硕士学位论文 发酵培养 从而得到发酵液 也称菌液 所得液中含有菌体 被菌体分解及为分解 的营养成分 以及茵体产生的代谢产物 工业化生产一般采用发酵罐 实验室培养 则运用三角瓶更为广泛 l j 深层发酵生产与传统固体发酵生产相比较 具有可工业 化大规模生产 产量效率高 发酵生产周期短 生产过程易于控制 产品质量相对 比较稳定 相对容易进行提取分离等优点 但其前期投入设备投资相对较大是其不 足之处 l 8 传统上人们通过野外采集或是人工栽培种植以获得灵芝 且只能取其子实体或 是孢子 但由于灵芝的子实体生长周期长 品质不易控制等不利因素 采用深层发 酵菌种时 发酵培养基中的碳源 氮源 无机盐 微量元素 维生素和生物素等物 质是不可或缺的营养成分l l j 适合菌种深层发酵的氮源和碳源的范围较广 目前用 于实验室菌种培养比较常见的培养基中的碳源是葡萄糖 蔗糖 淀粉等 氮源一般 采用蛋白胨 铵盐 硝酸盐 氨水等 而在工业产业化生产中 较为常见的碳源为 玉米粉 蔗糖糖蜜等 氮源则为黄豆饼粉 花生粉 麦麸 氨气等 近几年来 国 内外学者对于深层发酵技术的研究也日渐增多 培养条件的优化也日渐丰富 据报 道 很多学者已经将糙米浆 麦芽汁 黄豆芽汁 9 米糠 lo 等作为深层发酵培养基 的主要原料 此外 为优化深层发酵培养基配方 促进菌种的生长以及提高次生代 谢产物的生产 很多研究人员在液体培养基中添加了不同的成分原料 例如 加入 了含硒化合物 对硒进行富集转化 使培养后的菌丝体富硒 再加工成富硒功能性 奶制品 l l 加入中药提取液 枸杞子 党参 薏苡仁 山药 牛等膝等 使其次生 代谢产物中营养丰富 l2 1 利于生产加工成为人们所需的产品 目前 利用深层发酵 技术所生产出的产品 已广泛应用于医药 保健品 食品 饮料等产业 被人们广 为熟知的产品有 灵芝胶囊 灵芝片 灵芝仙酒 灵芝保健茶 金针菇火腿 肠 等等 1 3 真菌免疫调节蛋白的生物学功能 1 9 8 9 年 日本学者k j n o 等最先从灵芝菌丝体提取物种分离出第一个真菌免疫 调节蛋白 f u n g a li m m u n o m o d u l a t o r yp r o t e i n f i p 1 1 3 这类蛋白是从某些药 食 用真菌中提取出的一类具生物学活性的小分子蛋白质 这类蛋白具有与真菌凝集素 和免疫球蛋白相类似的结构和功能1 1 4 1 迄今为止 人们已经从赤灵芝 金针菇 小 孢子灵芝 松山灵芝 紫芝 草菇及甜芝这七种真菌中发现了这类真菌免疫调节蛋 白 乃 9 1 实验表明 这类蛋白分子量在1 2 1 3 k d a 之间 由1 1 0 1 1 4 个氨基酸组成 n 端被乙酰化封闭 富含缬氨酸 天冬氨酸 甘氨酸 谷氨酸等 1 7 1 灵芝 金针菇 草菇和松山灵芝 这四种真菌免疫调节蛋白中不含甲硫氨酸 半胱氨酸和组氨酸 表 1 不同的真菌免疫调节蛋白之间的同源性较高 图1 1 3 1 目前 人们人在不断地探索和研究真菌免疫调节蛋白 其种类不断增多 生物 学功能也不断被探明 东北师范大学硕士学位论文 表1 三种真菌免疫调节蛋白氨基酸组分比较 a m i n oa c i d m l z 一8 灵芝 f i p f v e 金针菇 f i p w o 草菇 1 0 l l e o蛐 7 n 加 舳 l z 暑 i 玎p 缸 耵衅 d h 肿j m k f i p v i 图1 不同真菌免疫调节蛋白 f i p 之间的同源性比较 不同的真菌免疫调节蛋白之间存在较高的同源性 以灵芝免疫蛋白l z 8 为标准 松杉灵芝 f i p g t s 甜芝 f j p s j n 紫芝 f i p j a p f i p f v e f i p v v o 免疫调节蛋白分别和 l z 一8 具有1 0 0 9 9 8 6 6 3 和5 7 的同源性 4 东北p 币范大学硕士学位论文 1 3 1 血细胞凝集功能 实验表明 已发现的真菌免疫调节蛋白具有凝集血细胞的功能 作用效果类似 于植物凝集素 但作用机制与植物凝集素存在差异性 植物凝集素是 类具有凝血 活性和免疫调节活性的一类糖蛋白 可被某些单糖或二糖的抑带a j t l 4 但是 这类真 菌免疫调节蛋白出l z 一8 含有极低的糖分 1 3 外 其他的真菌免疫调节蛋白都 不含糖 且不受单糖或二糖的特异性抑制 已知的实验显示 蛋白浓度3 1 3 1 x g m l 以上的l z 8 可对绵羊血红细胞产生凝集作用 蛋白浓度在2g g m l 的金针菇真菌免 疫调节蛋白可对人血细胞产生凝集作用 1 5 2 0 l 蛋白浓度在1 1i t g m l 的草菇真菌免 疫调节蛋白可对小鼠血细胞产生凝集作用 蛋白浓度在0 1 3g g m l 的草菇真菌免疫 调节蛋白可对兔红血细胞产生凝集作用 1 6 1 3 2 促进淋巴细胞增殖功能 实验研究表明 这类真菌免疫调节蛋白在机体内可促进小鼠脾淋巴细胞增殖 并且在机体外能够激活人外周血淋巴细胞的增殖 1 3 2 1 1 蛋白浓度为3 1 3 t g m l 的 l z 8 对小鼠淋巴细胞增殖有促进作用 蛋白浓度为1 0 0j t g m l 的f i p f v e 对人外周 血淋巴细胞的增殖有刺激作用 蛋白浓度为5i t g m l 的f i p w d 能够最大限度地刺激 人外周血淋巴细胞增殖 1 5 1 6 2 0 1 除此之外 真菌免疫调节蛋白还可对细胞内d n a 的 合成堆积产生一定的作用 1 3 3 免疫调节功能 在对这类真菌免疫调节蛋白免疫调节机制的探究过程中 结果表明 这类蛋白 并不是对肿瘤细胞 致敏的目的细胞或是靶蛋白直接产生作用 而是通过刺激免疫 系统中细胞间的相互作用 以此促进脾淋巴细胞或者人类外周血淋巴细胞的分裂 通过各种细胞因子的分泌 并最终达到自身免疫调节功能 1 4 2 0 2 2 2 3 1 研究表明 l z 8 可分别诱导t 细胞和1 1 1 1 型淋巴细胞分泌i c a m i l 2 i n f 吖和n 吓 c 细胞因子 f i p f v e 可分别诱导t 细胞和1 1 1 1 型淋巴细胞分泌i c a m i l 2 和i n f 吖细胞因子 f i p w o 可分别诱导t 细胞 n 1 1 型淋巴细胞 t h 2 型淋巴细胞分泌i l 2 i n f t l t t n f g t i l 一4 等细胞因子 f i p g t s 可诱导t 细胞分泌i l 2 i f n 吖细胞因子 1 6 因此 可以说真菌免疫调节蛋白是一种潜在的促免疫细胞激活剂 真菌免疫调节蛋白的免疫调节功能还体现在 延长机体进行器官移植后的排异 时吲2 5 2 6 1 对自体免疫性糖尿病起到一定的抑制作用 2 7 抑制系统过敏反应和阿尔 图斯反应中所形成的抗体的产生 1 7 2 8 2 9 3 0 1 等作用 1 3 4 抗肿瘤功能 国际上对真菌免疫调节蛋白抗肿瘤机制的研究比较晚 其作用机制也相对比较 复杂 目前作用机制研究相对比较明确的是2 0 0 6 年c h a n g 等人对患肝癌小鼠口服喂 东北师范大学硕士学位论文 食f i p f v e 的实验 实验显示 口服喂食f i p f v e 可延长患癌小鼠的存活则3 1 抑制 肿瘤的大小 其机制是通过激活机体的特异性和非特异性细胞的相关免疫反应 增 强腹腔细胞和淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤能力 3 1 3 2 此后 l i a o 发现在大肠杆菌重 组表达的f i p g t s 可以选择性的抑制人肺癌a 5 4 9 的生长 3 3 w a n g 等人发现f i p g t s 可以抑制肿瘤细胞的移动1 3 4 1 但这些发现的作用机制尚不明确 1 4 灵芝和金针菇免疫调节蛋白的重组表达 目前 采用传统方法从天然原料的菌丝体或子实体中提取分离真菌免疫调节蛋 白的工作量较大 成本较高 且提取产量较低 一般来讲 从灵芝菌丝体中提取l z 8 的产量约为1 4 2 9 m g k g 而从金针菇菌丝体中提取出的f i p f v e 的产量约为 2 0 8 0 m g k g 2 引 随着基因工程技术的发展 很多的研究者选择采用基因工程技术在 不同的表达宿主中 通过结合不同表达宿主 采用不同的方法来重组表达真菌免疫 调节蛋白 以此获得具有生物活性功能的重组蛋白 f i p f v e 的重组表达首先是1 9 9 7 年l i n 等人在大肠杆菌t g l 中实现的 获得了 谷胱甘肽 s 转移酶融合的重组真菌免疫调节蛋白 表达水平是5m g l 3 5 娜 经测定 具有一定的生物活性 但活性低于天然蛋白 此后 f i p f v e 在昆虫表达系统中一s f 2 1 细胞的表达产量为6 2 5m e j l 3 1 1x 1 0 6 c e l l s 1 3 7 3 引 其活性远高于大肠杆菌表达的 f i p 2 0 0 2 年中国药科大学叶波平等实现了l z 8 在大肠杆菌h b l 0 1 中的重组表达 3 9 四年后 白杰英等将l z 8 在大肠杆菌b l 2 1 中进行了表达 表达产量约为3 4 6 m g l 4 0 同时 他们还在烟草 n i c o t i a n at a b a c u m 三 v a rw3 8 中表达了相同的基 因 表达效率为o 1 8 1 4 9 8p g g 鲜叶片 4 1 1 此后 y e h 等人又将l z 8 基因转 入芽孢杆菌 b a c i l l u ss u b t i l i sw b 8 0 0 和乳酸菌 l a c t o c o c c u sl a c t i sn z 9 0 0 0 中实 现了重组表达 表达产量分别为17 5m g l 和1 2 4m e t e 且具有生物学活性 4 2 1 1 5 本实验的研究目的和主要研究内容 金针菇和灵芝作为两种药食兼用的真菌生物 他们在生产生活中越来越受到人 们的关注和和对其的探究 其生物体本身所具有防病治病 延年益寿 强体益智等 功效也越来越受到人们的认可 但由于受其自身生长周期 生长质量等因素的影响 如要进行大规模地开发 利用生产出为人类所应用的医药 保健 食品 饮料等产 品是不可能实现的 因此 如何低成本 高效率地利用深层发酵技术对其进行大规 模地生产是具有重要的实践意义的 从金针菇中提取分离出的具有免疫调节 抗肿瘤 抗过敏等作用功效的真菌免 疫调节蛋白 也愈发地引起了人们的关注和认可 由于天然提取真菌免疫调节蛋白 工作量大 费时费力 成本相对较高 产率较低 因此利用基因工程技术从这金针 6 东北师范大学硕士学位论文 菇中克隆出编码f i p f v e 的基因 将其转入进表达载体中进行重组表达 同时对其诱 导条件进行优化 以期获得具有生物活性 产量高 成本低的真菌免疫调节蛋白具 有重要意义 本实验首先以金针菇和灵芝的菌丝体为材料 对其深层发酵工艺进行了优化 将金针菇和灵芝菌丝体分别在花生和大豆培养基中进行培养 然后根据其生产成本 产率 有效营养物质的比较 已获得最为优化的深层发酵培养基 其次 利用本实 验室已有的已表达f i p f v e 的工程菌 对其培养基成分进行优化实验培养 进一步深 入研究探讨f i p f v e 的生物学功能 以期为真菌免疫调节蛋白研制医用药物和开发保 健产品中提供一定的理论依据和技术基础 7 东北师范大学硕士学位论文 2 1实验材料 2 材料和方法 2 1 1 供试菌株 实验材料 灵芝和金针菇菌种购自吉林农业大学菌物研究所 小鼠由北华大学 生命科学研究中心提供 质粒 表达载体p p i c 9 由由吉林大学基础医学院孙非教授惠赠 菌株 含重组质粒p p i c 9 f i p f v e 的酵母菌株为本实验室保存菌株 细胞株 人血红细胞由东北师范大学校医院提供 2 1 2 主要试剂 酶类 低分子量蛋白m a r k e r 均为大连宝生物生物公司产品 试剂盒 b c a 试剂盒购自w a l t e r s o n 公司 生化试剂 溴酚兰为s i g m a 产品 小牛血清 b s a 生物素 植物凝集素 p h a 酵母氮源 呵b 不含硫酸铵不含氨基酸 为北京鼎国生物公司产品 其他生化试 剂均为国产分析纯 2 1 3 仪器设备 超净工作台 哈东联 冻干机 博劢行仪器有限公司 高速低温离心机 s i g m a 公司 稳压稳流电泳仪 北京六一厂 垂直电泳槽 北京六一厂 细胞培养箱 s a n y o e l e c t r i cc o l t d 酶标仪 b i o r a d 公司 紫外分光光度计 u n i c e 公司 恒 温培养箱 酸式滴定管 研磨器 高压灭菌锅 s a n y o 超滤系统 p a l lf i l t r o n 公司 a k t ae x p l o r e r1 0 0 型蛋白质纯化工作站 g ep h a r m a c i ab i o t e c h 公司 d e a e s e p h a r o s ef a s tf l o w 阴离子交换层析柱 h i l o a d1 6 6 0s u p e r d e xg 7 5 凝胶过滤 分子筛 层析柱 2 1 4 培养基 1 y p g 培养基 胰蛋白胨1 0g l 酵母提取物5g l 葡萄糖2 0g l 或麦 芽糖1 5 9 l m g s 0 40 5g l k h 2 p 0 4l g l 配制固体培养基时加琼脂粉1 5g l 1 1 0 高压灭菌3 0 m i n 2 y p d 培养基 胰蛋白胨2 0g l 酵母提取物1 0g l 葡萄糖2 0g l 配 制固体培养基时加琼脂粉1 5g l 1 1 0 高压灭菌3 0 m i n 3 m d 培养基 y n b1 3 4g l 生物素0 4g l 葡萄糖2 0g l 配制固体培 养基时加琼脂粉1 5g l 11 0 c 高压灭菌3 0 m i n 生物素需提前过滤除菌后在超净 工作台中加入到培养基中 8 东北师范大学硕士学位论文 4 毕赤酵母培养基母液配方 10 x y n b 1 3 4 的y n b 不含硫酸铵不含氨基酸 将3 4 9 y n b 和1 0 0 9 硫酸 铵溶解于1 0 0 0 m l 水中 加热至y n b 完全溶解 过滤除菌 存放于4 0 c 可放1 年 5 0 0 生物素 o 0 2 将2 0 m g 生物素溶解于1 0 0 m l 水中 过滤除菌 存放于 4 0 c 可放1 年 1 m 磷酸钾缓冲液p h6 o 将1 3 2 m l1 m 的k 2 h p 0 4 溶液与8 6 8 m l1 m 的 k h 2 p 0 4 溶液混合均匀 调节p h 值为6 0 a 0 1 如需调节p h 值 用磷酸或k z o h 溶 液 过滤或高压灭菌 室温下可放置1 年以上 5 b m g y 培养基 1 0 9 l 酵母提取物 2 0 9 l 胰蛋白胨 1 0 0 m l l1 m 的磷酸 钾缓冲液 1 0 m l l 甘油 经1 2 1 0 c 高压灭菌2 0 m i n 冷却至室温 加入1 0 0 m l l 1 0 x y n b 2 m l l5 0 0 x 生物素 6 b m m y 培养基 1 0 9 l 酵母提取物 2 0 9 l 胰蛋白胨 1 0 0 m l l1 m 的磷酸 钾缓冲液 经1 2 1 0 c 高压灭菌2 0 m i n 冷却至室温 加入1 0 0 m l l1 0 x y n b 2 m l l 5 0 0 x 生物素 甲醇终浓度至o 5 2 2实验方法 2 2 1 灵芝和金针菇的深层发酵工艺 2 2 1 1 灵芝和金针菇菌丝体的活化 在无菌条件下 将灵芝和金针菇菌种分别用接种针挑取一小块菌丝体接种于固 体y p g 培养基中 试管斜面或培养皿 在2 6 培养箱中培养5 7 天 挑选洁白 粗壮 浓密 无污染的菌丝体作为供试菌种 活化后的菌种可作为次级菌种保存于 4 c 冰箱中 2 2 1 2 含有不同配比花生和大豆的培养基的配制 表2 不同培养基的成分配比 g l 花生1 号花生2 号花生3 号大豆1 号大豆2 号大豆3 号 培养基培养基培养基培养基培养基培养基 花生粉 1 62 02 4 含量 大豆粉 含量 1 62 02 4 其余成分蔗糖2 0 磷酸氢二钾1 氯化钠2 硫酸镁o 5 分别将含有不同配比的花生和大豆液体培养基每2 5 0 m l 装入到5 0 0 m l 的三角瓶 经1 1 0 高压灭菌3 0 m i n 2 2 1 3 灵芝和金针菇菌丝体在不同配比花生和大豆液体培养基中摇瓶培养 1 分别配制表2 中的六种培养基 每种各2 0 0 0 m l 分别将每2 5 0 m l 装入到5 0 0 m l 9 东北师范大学硕士学位论文 的三角瓶中1 1 0 高压灭菌3 0 m i n 2 在超净工作台中 用已灭菌的接种铲分别将已活化后的灵芝和金针菇菌丝 体切取出约l c m 2 左右的菌丝体小块 3 用已灭菌的不同镊子分别均匀地将菌丝体小块加入到不同成分配比的六种 花生液体培养基和大豆液体培养基中 取每一种菌种的3 4 块菌丝体小块分别加入 到每瓶液体培养基中 每种菌种一次在一种液体培养基中平行培养4 瓶左右 4 将含有金针菇和灵芝菌丝体菌种的液体培养基分别从超净工作台中取出 分别将含有金针菇菌丝体的花生和大豆液体培养基放置于2 6 摇床中 而含有灵芝 菌丝体的花生和大豆液体培养基放置于2 8 摇床中 1 5 0 r p m 振荡培养8 1 0 天 2 2 1 4 灵芝和金针菇菌丝体在不同配比花生和大豆液体培养基中静止培养 1 配制表2 中的六种培养基 每种各6 0 0 m l 分别各装入1 0 0 0 m l 的三角瓶中 经1 1 0 高压灭菌3 0 m i n 2 取6 0 只直径为1 2 c m 干净的圆形玻璃平皿 分别包裹好 经1 2 1 高压灭 菌3 0 m i n 3 取出已灭过菌的培养基和培养皿 在超净工作台中 将1 0 0 0 m l 的大三角瓶 中的6 0 0 m l 的每种培养基分别小心地倒入1 0 个玻璃平皿中 每个平皿倒入6 0 m l 左 右的液体培养基 4 用己灭菌的接种铲分别将已活化后的灵芝和金针菇菌丝体分别切取出约 l c m 2 左右的菌丝体小块 5 用已灭菌的镊子分别将1 2 块菌丝体小块分别加入到含有不同液体培养基 的玻璃平皿中 6 将6 0 只含有灵芝和金针菇菌种的六种不同成分配比的液体培养基放置于 2 6 的恒温培养箱中静止培养1 0 1 2 天 2 2 1 5 灵芝和金针菇菌丝体在六种不同成分配比的液体培养基中 摇瓶和平皿静止 培养方式下鲜重和干重的测定 a 摇瓶培养 1 取出4 瓶在同一配比培养基下培养的每种菌种的发酵培养液 2 将4 瓶菌丝体发酵液分别取出 于 4 1 2 0 0 0 r p m 离心2 0 m i m 取出沉淀 即为发酵菌体 3 将取出的每种菌体的表面余液用干净的滤纸吸干 用蒸馏水冲洗3 5 次 再用洁净的滤纸吸干多余水分 4 分别称取每瓶发酵液得到的菌丝体的总重量 取出每种菌种在每一配比的 培养基中培养出菌丝体的重量平均值 作为平均鲜重 记录数值 5 将以上取出的摇瓶中菌丝体分别放置于6 5 恒温干燥烘干箱中进行烘干处 理 至烘干恒重时 分别称其重量 取出每种菌种在每一配比的培养基中培养出菌 丝体的干重平均值 作为平均干重 记录数据 b 静止培养 l o 东北9 币范大学硕士学位论文 1 取出5 只在同一配比培养基下培养的每种菌种的静止发酵培养液 2 用干净的镊子将培养好的片状菌丝体取出 用干净的滤纸吸干下面的余液 再用蒸馏水冲洗下端2 3 次 最后用滤纸吸干多余水分 3 分别称取每只平皿中得到的菌丝体总重量 取出每种菌种在每一配比的培 养基中培养出菌丝体的重量平均值 作为平均鲜重 记录数值 4 将以上取出的平皿中菌丝体分别放置于6 5 恒温干燥烘干箱中进行烘干处 理 至烘干恒重时 分别称其重量 取出每种菌种在每一配比的培养基中培养出菌 丝体的干重平均值 作为平均干重 记录数据 2 2 1 6 灵芝和金针菇菌丝体静止培养时在六种不同成分配比的液体培养基中总蛋白 含量的测定 a 样品的实验检测预处理 1 取每种菌丝体的干样1 0 0 m g 置于液氮中迅速研磨成细分状 2 迅速将研磨后的细粉加入到l m l 预冷的1 0 m mp h 7 2 的p b s 溶液中 放置 于4 c 冰箱中放置2 4 小时 3 取出混合液 1 2 0 0 0 r p m 离心2 0 r a i n 4 取出沉淀 将沉淀物用预冷的l m l p b s 溶液打散 重离心 5 取3 和4 步骤中的上清溶液 并分别检测其总蛋白含量 b 每种菌丝体抽提液中蛋白含量的鉴定 取1 5 此或2 0 l 每种菌体的抽提液 用s d s p a g e 凝胶电泳鉴定其是否存在 蛋白 c b c a 试剂盒法测定每种菌丝体中总蛋白含量 在碱性条件下 蛋白将c u 2 还原为c u 1 c u 1 与b c a 试剂形成紫色的络合物 测定其在5 6 0n l t i 处的吸光值 用试剂盒内附带的纯品b s a 1 2 5 2 5 0 5 0 0 7 5 0 1 0 0 0 1 5 0 0 和2 0 0 0 肛g m l 作对照标准 待检测的样品和标准品分别取1 0 9 l b c a 工作液 5 0 份试剂a i 份试剂b 工作液 取2 0 1 混和均匀分别加入到9 6 孔酶 标板中测定 之后放置于3 7 恒温箱中 反应3 0 m i n 冷却至室温后 于5 7 0n n l 下 测定光吸收值 以b s a 制作标准曲线 每个样品做3 个平行实验 取其平均值 并 计算蛋白纯度 2 2 1 7 灵芝和金针菇菌丝体静止培养时在六种不同成分配比的液体培养基中总糖含 量的测定 a 样品的实验检测预处理 1 取每种菌丝体的干样品1 0 0 m g 研磨 2 将捣碎后的干样品浸沉于2 5 m l 的8 0 的乙醇溶液中 9 5 回流提取4 h 3 将回流后的混合液1 2 0 0 0 r p m 离心2 0 m i n 4 取沉淀 将沉淀溶于2 5 m l 的热水中 9 5 回流提取2 h 5 取混合液1 2 0 0 0 r p m 离心1 5 m i n 取上清液 检测总糖含量 b 苯酚 硫酸法测定总糖含量 4 3 i l 东北师范大学硕士学位论文 1 基本原理 糖在浓硫酸作用下 脱水生成的糠醛或羟甲基糠醛能与苯酚缩合成一种橙红色 化合物 在1 0 1 0 0 m g 范围内其颜色深浅与糖的含量成正比 且在4 9 0 n m 波长下有 最大吸收峰 故可用比色法在此波长下测定可溶性中性糖的含量 2 标准曲线的制作 以葡萄糖作为标准物质 制作标准曲线 将葡萄糖配制成l o 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0 和1 0 01 t g m l 不同浓度的标准液 每个浓度各取l m l 至于试管中 同时取l m l 灭菌蒸馏水至于试管中做负对照 每个浓度的标准品平行做2 管 之后 用移液管分别向各试管中准确加入6 苯酚溶液0 5m l 振荡混匀 再分别沿试管 壁缓慢地准确加入2 5m l 浓硫酸 振荡混匀 然后放置冷却至室温 在7 2 3 型可见 光分度计于4 9 01 1 1 1 1 测定每