（遗传学专业论文）苦杏仁苷酶关键酶基因cdna的克隆和表达.pdf

中文摘要 苦杏仁营酶是粗酶制剂，包含p 一葡萄糖苷酶( p g l u e o s i d a s e ，b g l u ) 和羟基腈 裂解酶( h y d r o x y n i l r i l el y a s e ，h n l s ) 等，主要存在于杏、桃、李子、苹果等多 种果实的种子中，现在一般也将其作为主要含植物b g l u 等糖苷酶的一般名使用， 是与植物香气和产氰现象密切相关的酶。产氰现象是植物体的一种自然防御现 象，能够保护植物免受病原真菌和害虫的侵袭，这主要是因为植物体中b g l u 和 h n l s 联合作用降解含氰糖营产生有毒的氢氰酸所致。目前，发掘与作物品质和抗 性相关的基因资源仍是作物育种学研究的一项重要任务，由于b g l u 和h n l s 的独特 作用，其在作物育种学研究中的应用必将会受到越来越多的重视。前期研究结果 表明，烟草中缺乏水解以醇系香气物质为苷元的糖苷酶，商品苦杏仁苷酶( 商品 名为：3 - g l u c o s i d a s ef r o ma l m o n d ) 能高效水解烟草糖苷产生醇系香气类物质， 因此可将该酶基因转入烟草。一方面能使烟草表达产生相应的苦杏仁苷酶，水解 糖苷类物质释放香气，提高烟草的香气品质：另一方面烟草在受到病原菌和害虫 的侵袭时，通过该酶的作用，能够抑制烟草病原真菌的生长。 本研究采用原核表达系统p e t 3 2 a ( + ) 载体和b l 2 1 t r x b ( d e 3 ) 菌株对茶树中两 种b g l u 基因c d n a ( g l ui 和g l u i i ) 进行了表达，研究了不同诱导时间、不同诱 导温度对这两种b g l u 基因表达量的影响并测定了两者表达产物的活性。表达分析 结果表明，诱导6 h 、2 5 时，g l ui 在总蛋白中所占比例最高：诱导6 h 、3 74 c 时， g l u l l 在总蛋白中所占比例最高。活性测定结果表明，两种表达产物均能水解b g l u 的通用底物对硝基苯酚b 一葡萄糖苷( p n p g ) ，并且在相同的测定条件下，g l u l i 活性( 0 3 1 0 0 0 3u m l l ) l l g l ui 活性( 0 2 3 4 0 0 3u m l l ) 更高；薄层 层析( t h i nl a y e rc h r o m a t o g r a p h y ，t l c ) 测定结果表明，两者均能水解苯甲醇 一b 一葡萄糖苷和苯乙醇一p 一葡萄糖苷，产生葡萄糖和相应的苷元；气相色谱( g a s c h r o m a t o g r a p h y ，g c ) 测定结果表明，两者对烟草糖苷均具有一定的水解活性。 通过将杏树不同器官中粗酶液与烟草糖苷进行酶促反应发现，杏仁中的粗酶 液具有水解烟草糖苷的活性，杏叶中几乎没有活性；本研究分析了商品苦杏仁苷 酶的主要够成，确定了这种酶是由h n l s 和另外的蛋白组成；通过对商品苦杏仁 苷酶进行肽指纹图谱分析( p e p t i d e m a s sf i n g e r p r i n t ，p m f ) ，得到了其部分一级 结构信息( 氨基酸序列信息) ，报摇这些氨基酸序列信息设计了两对简并引物x 和x 。x 。和x 。，尝试从杏仁中克隆了h n l s 基因e d n a 。 关键词：苦杏仁苷酶，b 一葡萄糖萤酶，羟基腈裂解酶，克隆，表达 a b s t r a c t a r m y d a s ei sc r u d ee n z y m e s ，m a i n l yc o n t a i n i n g1 3 - g l u c o s i d a s ea n dh y d r o x y n i t r i l e l y a s e ，a n dc o n s i s t i n gi nt h es e e do fa p r i c o t ，p l u m ，p e a c h ，a p p l ea n ds oo n ，a r n l i y d a s ei s c o r r e l a t e dw i t ht h ea r o m a t i co f p l a n ta n dt h ep h e n o m e n ao f c y a n o g e n ，t h ep h e n o m e l l a o fc y a n o g e ni sr e l a t e dt ot h er e s i s t a n c et on a t u r a ld e f e n c eo fp l a n t ，w h i c hp r o t e c tt h e p l a n tf r o md i s e a s ea n dp e s t t h ef u n c t i o no ft h eb g l uc o m b i n e dw i t hh n l si st o d e g r a d a t ec y a n o g e n i cg l y c o s i d ep r o d u c i n gh y d r o g e nc y a n i d e ，n o w d a y , i ti sa l s oa n i m p o r t a n td u t yf o r t h er e s e a r c h e rt o f i n dt h eg e n e sr e s o u r c e s c o r r e l a t i n gw i t h r e s i s t a n c ea n dq u a l i t yi nt h ea r e ao fc r o pb r e e d i n g ，m o r ea n dm o r er e s e a r c h e rw i l l c o n c e r nt h e m ，b e c a u s eo ft h e p a r t i c u l a r i l yi m p o r t a n tf u n c t i o n o fb g l ua n d h n l s t h ee a r l i e rp e r i o df i n d i n g si n d i c a t e dt h a t ，t o b a c c ol a c k st h eh y d r o l y t i ce n z y m e t h a tc a nh y d r o l i s i sm a t e r i a l sm a d eu po ff r a g r a n c e m a t e r i a l ，t h ea r m y d a b ef r o m a l m o n d ( f 3 一g l u c o s i d a s ef r o ma l m o n d ) c a r lh i g h l yh y d r o l y s i st o b a c c o s g l y c o s i d e ， p r o d u c i n gf r a g r a n c em a t e r i a l s w ec a l lc l o n et h i sk i n do fm a t e r i a l s sg e n ef r o mt h e a p r i c o tt r e ea n dc h a n g ei to v e rt ot h et o b a c c o ，o nt h eo n eh a n d ，i tc a nc a u s et h e t o b a c c ot oe x p r e s st h i sk i n do fe n z y m ew h i c ht h e nh y d r o l i s i st h et o b a c c og h i c o s i d et o r e l e a s ef r a g r a n c ea n de n h a n c e st h ef r a g r a n c eq u a l i t yo ft o b a c c o ；o nt h eo t h e rh a n d ， t h r o u g ht h i se n z y m ei n d i r e c tf u n c t i o n ，i tc a ns u p p r e s st h eg r o w t ho ff u n g u si nt o b a c c o ， w h e nt h et o b a c c or e c e i v e sf u n g u si n v a d e s p r o k a r y o t i ce x p e r i m e n t a ls y s t e mo fe x p r e s s i o nv e c t o rp e t - 3 2 a ( + ) a n d b l 2 1 t r x b ( d e 3 ) s t r a i nw e r ee m p l o y e dt oe x p r e s st w ok i n d so f t e ab g l u ( g l uia n d g l ui i ) c d n ag e n e t h ei m p a c t so fd i f f e r e n ti n d u c t i o nt i m ea n dt e m p e r a t u r eo nt h e e x p r e s s i o na m o u n to ft h e s et w ok i n d so ft e ab g l uw e r es t u d i e da n dt h ea c t i v i t i e so f b o t hk i n d so fb g l uw e r ed e t e r m i n e d t h ee x p r e s s i o nr e s u l t sr e v e a l e dt h a tt h eg l ui s h o w nt h eh i 曲e s tp r o p o r t i o no ft h et o t a lp r o t e i ni nt h ec o n d i t i o n so fs i xh o u r sa t2 5 ，a n dt h e ng l ui is h o w nt h eh i g h e s tp r o p o r t i o na ts i xh o u r sa t3 7 。c b o t ht h e r e s u l t e dp r o d u c t se x h i b i t e dn o r m a lb g l ua c t i v i t y ，a n db o t ho ft h e mc a l lh y d r o l y s i s p n p gw h i c hi sa nu n i v e r s a lm a t e r i a lt h a tb g l uc a nh y d r o l y s i s ，a n dg l ui i ( o 310 a ：0 0 3u m l l ) e x p r e s s i n gp r o d u c ts h o w nm u c hh i g h e rb g l u a c t i v i t yt h a nt h a t o f g h ii ( 0 2 3 4 士0 0 3u m l l ) b o t ho f t h e mc a nw e a k l y h y d r o l i s i st o b a c c og l u c o s i d e t h r o u g hg ct e c h n o l o g y ，w h i c hp r o v i d et h eb a s i so fe u k a r y o t i ce x p r e s s i o no ft e a b g l iii nt o b a c c o h t h r o u g ht h er e a c t i o nb e t w e e nt h e1 1 1 i c ke n z y m ef l u i df r o md i f f e r e n to r g a no f a p r i c o tt r e ea n dt h et o b a c c og l u c o s i d e ，i th a sb e e nd i s c o v e r i e dt h a tt h ee n z y m ef l u i d o fa l m o n dc a l l h y d r o l i s i st o b a c c og l u c o s i d e ，a n dt h ea p r i c o tl e a fd i dn o th a v e a c t i v e n e s s t h i se x p e r i m e n th a sa n a l y z e dt h ec o n s t i t u t i o no ft h i sk i n do fc o m m o d i t y e n z y m e ，a n dh a sd e t e r m i n e dt h a tt h i sk i n do fp r o t e i ni sc o m p o s e do fo n ek i n do f p r o t e e nc a l l e dn i t r i l el y t i ce n z y m ep r o t e i na n do t h e rm i x e dp r o t e i n w eo b t a i n e d p a r t i a ls t r u c t u r ei n f o r m a t i o no f t h i sk i n do f p r o t e i n ( a m i n oa c i ds e q u e n c e ) ，t h r o u g ht h e t e c h n o l o g y o f p m f ( p e p t i d e m a s s f i n g e r p r i n t ) w e h a v e d e s i g n e d t w o p a i r so f p r i m e r s s u c ha sx 1a n dx 2 ，x 3a n dx 4a c c o r d i n gt ot h e s ei n f o r m a t i o n sa n da t t e m p t e dc l o n e t h ee d n ao f t h i sk i n do f h n l s p r o t e e n k e yw o r d s ：a r m y d a s e ，1 3 一g l u c o s i d a s e ，h y d r o x y n i t r i l el y a s e ，c l o n e ，e x p r e s s 1 1 1 文献综述 1 苦杏仁苷酶研究进展 苦杏仁苷酶( a m y g d a l a s e ) ，是糖苷酶中的重要一种，能将l 单位苦杏仁苷 ( 一种含氰糖苷，别名扁桃苷、维生素b ”，结构式如图1 所示) 水解成2 单位葡 萄糖、1 单位苯甲醛和i 单位氢氰酸。 苦杏仁苷酶最初由德国化学家冯利毕格( j f y o nl i e b i g ，1 8 3 7 年) 在研 究苦杏仁中化合物时发现，后来发现该酶主要来源于杏、桃、李子、苹果、山楂 等多种果实的种子中，但是现在一般将其作为从植物体得到的主要含1 3 葡糖苷 酶( 1 3 - g l u c o s i d a s e ，e c 3 2 i 2 1 ，以下简称b g l u ) 等糖苷酶的粗酶制剂的一般 名使用，苦杏仁苷酶是一类混合酶，植物来源的b g l u 属于苦杏仁苷酶中的主要 组成部分，该酶还包括其他一些酶类“】。 研：o k( 1 ) 夕一f “伽 n 皤剖吨) o “ m 6 ：l 图1 苦杏仁苷结构式 f i g it h e m o l e c u l a r f o r m u l a o f a m y g d a l i n 苦杏仁苷最终被水解成葡萄糖、苯甲醛和氢氰酸，必须将( 1 ) 、( 2 ) 、( 3 ) 三处化学键全部断开( 如图1 所示) ，而b g l u 属于水解酶类，只催化水解1 3 一 葡萄糖苷键，不能作用于( 3 ) 处的腈键。实际上( 3 ) 处则是由羟基腈裂解酶 ( h y d r o x y n i t r i l el y a s e ，e c 4 2 1 1 0 ，以下简称h n l s ) 催化裂解完成“1 。因此， 从这个意义上来说，苦杏仁苷酶主要包括植物源b g l u 、h n l s 及其他酶类。 1 2 且一葡糖苷酶研究进展 1 2 1b 一葡糖苷酶的分布及性质研究 b g l u 广泛存在于自然界中，包括微生物、植物以及动物“1 ，在各种糖苷酶 中，由于天然的糖苷类香气前体几乎都是d 一葡萄糖营且几乎所有的天然糖苷都 是b 一糖苷，因此b g l u 是作为水解天然葡萄糖苷最合适的酶类”1 。近年来，许 多学者成功的从微生物、植物以及动物中纯化、鉴定出了b g l u ，并进行了广泛 的酶学性质研究( 如：表1 ) ”。生物体中b g l u 多以单体酶或二聚体形式存 在，四聚体、六聚体形式较为少见，目前在各种生物体中发现的b g l u 的等电点 均在6 6 8 以下，全部为酸性蛋白。该酶分子量变化较大，微生物中从1 8 k d 到 4 8 0 k d 均有报道，植物中分子量基本上都在2 0 0 k d 以下。酶的来源不同，水解 的底物也不同，但不同来源的该酶几乎都对人工合成的对硝基苯1 3 d 葡萄糖苷 ( p n p g ) 表现出较高的酶活性，葡萄糖是该酶典型的抑制剂，葡萄糖内脂、对 氯高汞苯甲酸、异丙基1 3 d 一硫代葡萄糖苷对部分来源的该酶也表现出抑制作 用。金属离子的抑制作用，因酶来源不同差异较大，但h 矿、a g + 对大部分酶抑 制作用明显。 微生物中，对b g l u 的研究主要集中在酵母、细菌、真菌、链霉菌上，其纯 化方式主要是先后用硫酸铵沉淀及柱层析等分离步骤“”1 。微生物中b g l u 的功 能主要是给机体提供能源，能将纤维素二糖和纤维素寡糖水锯成葡萄糖，根霉能 在许多种纤维素物质上生长，正是由于它能产生包括b g l u 在内的多种纤维素酶 所致“。 表1 部分已分离纯化的b 一葡萄糖苷酶 t a b l e1p a r to f i s o l a t e da n d p u r i f i c a t e d1 3 - g l u c o s i d a s e 植物中，不同的组织和器官均有该酶的分布，酶活性在叶、茎干、根表皮、 果实、种皮中随着植物的种类不同而变化，在细胞水平上，该酶不是分布在某个 特定的细胞器中，细胞质中含量较高，但细胞壁、叶绿体、胞质丝、液泡中也有 该酶的报道“。b g l u 的植物来源主要有园艺植物、药用植物、粮食作物等，学 者们曾先后从玉米、胡萝h 、番木瓜、茶叶等植物中提取分离了该酶，并对其酶 学性质进行了研究o ”刎。茶叶作为一种叶用植物，香气因子是质量审评中的重要 因子之一，其香气品质壹接影响茶叶品质，因此，茶树中b g l u 的研究近年来已 成为热点，目f ； f 已发现茶树中含有多种b g l u 同功酶且已分离纯化，对茶树生长、 茶叶加工过程中该酶的分布、活性变化情况也有比较充分的研究汹1 ”。 动物性来源的b g l u 主要分御在一些昆虫的口腔上皮细胞以及高等动物的 消化和吸收器官，这些都是因为该酶是水解酶类关键成员，能够有效的水解9 2 葡萄糖苷键。茶尺蠖取食茶树后，口腔分泌物( 含b g l u ) 作用于损伤部位，致 使茶树释放出与新稍完全不同的挥发物，从而强化了天敌昆虫的寄生效率，减轻 了茶树的受害程度“。 1 2 2b 一葡糖蕾酶分子生物学水平研究 从分子水平上对b g l u 的研究也有很多报道，生物体中多种来源的b g l u 基因已经被克隆( 主要是微生物) ，为今后b g l u 基因的表达、调控等基础研究 提供了广阔的平台“”删。表2 为除水稻和拟南芥( 基因组计划内容) 外，部分植 物b g l u 基因克隆、测序的结果。 表2 部分已经克隆的植物1 3 一葡萄糖苷酶基因 t a b l e 2g e n e sc l o n e df r o mp a r to f p l a n t s 植物序列长度登录号作者 n a m eo fg e n e sa c c e s sn o l e n g t h a u t h o r 黄氏存花 1 8 7 5 b p a f l1 2 8 8 8g e e r li r i g sa 苜蓿5 7 6 b p a a 6 6 1 0 2 4 c o v i t zp a 玉米 1 9 0 9 b p a f 0 7 2 7 3 6d h a r m a w a r d h a n ad 小麦2 2 0 0 b p a b 2 3 6 4 2 2s u em 高粱1 3 9 5 b p a f 2 5 3 5 0 8 v i c h i t p h a ns 燕麦1 9 2 3 b p a f 0 8 2 9 9 ik i my w 大麦4152bp l 4 1 8 6 9l e a hr 大豆 1 9 1 4 b p a m 2 3 8 6 5 8 f o u r r i e rn 油菜 1 9 4 5 b p x 8 2 5 7 7f a l ka 苋菜2 6 9 2 b p a y 3 2 0 2 5 7 v a l d e sd 0 西红柿5 5 8 b p b g l 3 0 7 6 lv a nd e rh o e v e nr 葡绚6 7 8 b p a y 0 3 9 0 3 4 s a r r yj e 西葫芦1 6 6 9 b p a f l 7 0 0 8 7 v a nd ev e nw t g 茶树 5 8 4 b p a f 5 3 7 1 2 7 j i a n gcj 黑樱桃 2 0 5 9 b p a f 2 21 5 2 7z h o uj 苹果2 4 3 b p a y 3 4 7 8 4 1 v e n i s s ej s 近年来，对b g l u 的分子水平研究已经深入到了基因的表达水平。陈亮等在 建立了茶树基因表达绝对定量实时p c r 检测方法后，检测了龙井4 3 新梢不同部 位叶片中的b g l u 基因的表达情况，结果表明b g l u 在一芽五叶新梢的第四叶中 表达活性最高，结果为第四叶 第三叶 第五叶 第二叶 一芽一叶”。 1 2 3 b 一葡糖苷酶应用 目前，工业上对b g l u 的主要应用是生产低聚龙胆糖呻1 。低聚龙胆糖是龙胆 二糖、三糖、四糖的混和物，比麦芽糖浆具有更高的吸水性和较低的粘度，可防 止食品中的淀粉老化和保持食品中的水分；不易为人体消化酶所消化，为低热值 低聚糖，具有轻微的苦味，对双歧杆菌具有较强的增殖作用，特别适合于咖啡制 品和巧克力制品中应用，具有增味或味觉改良作用。生产过程中，将高浓度的葡 萄糖液用霉菌生产的b g l u 在较高温度下作用，使葡萄糖发生转移反应和缩合反 应来酶法合成低聚龙胆糖，由于其显著的保健功能，低聚龙胆糖及类似低聚糖类 正日益受到消费者的青睐。 此外，b g l u 在作物栽培、食品工程等领域“6 ”也有应用。据试验，施有机 肥和大棚覆盖有利于提高包括b g l u 在内的糖苷酶活性，并可明显增加游离态醇 系香气含量及醇系香气总量。茶叶、水果中的风味前体物多以单萜烯基一1 3 一d 一葡萄糖苷和醇系糖菅的形式存在，b g l u 与其它风味酶协同作用于这些前体物 释放出风味成分，将其应用于果酒、茶叶、果汁中可起到增香作用。 已有研究表明苯甲醇、苯乙醇、顺一3 一己烯醇、香叶醇等醇系物质达到一 定浓度时，对棉花枯萎病菌、烟草赤星病菌、棉拟盘多孢菌、茶叶云纹叶枯病菌、 小麦纹枯病等病原菌的生长有不同程度上的抑制作用”“，而b g l u 正是产生这类 物质的一类关键酶，因此这为对经济作物中b g l u 基因进行调控或对缺乏这类基 因的作物进行转基因研究增添了价值砝码。 1 3 羟基腈裂解酶研究进展 1 3 1 羟基腈裂解酶的分类 h n l s 按照有无黄素腺嘌呤二核苷酸( f a d ) 可分为2 类：h n l s l 和h n l s i i 。 这种辅因子不会真正的参与反应，但若缺失它t f 丁贝j 会引起酶的失活，有的可以对 酶的结构起到稳定的作用，有的则是进化过程的残留，f a d 一般共价结合到靠近 酶活性中心的疏水区域。含有f a d 的h n l s 已经从一类属于蔷薇科、李亚科和苹果 亚科的植物的种子中提取出来，而且对植物的产氰有重要作用。缺乏f a d 的h n l s 通常在高粱属，木薯，亚麻等植物中比较丰富汹1 ，它是一种罕见蛋白质，与其他 蛋白质具有不同的分子量、糖基化位点、等电点、结构等物理化学性质。 i ，3 。2 羟基腈裂解酶的结构研究 近年来，多种来源的h n l s 基因已被克隆并在原核生物罩进行了高效表达且其 产物具有正常的酶活“7 “1 ，这极大的方便了对h n l s 的进一步研究，对h n l s 的理论 研究已经深入到晶体结构研究的层面。 4 图2 羟基腈裂解酶的立体结构图 f i g 2s t e r e o s c o p i cr e p r e s e n t a t i o n so f o n em o l e c u l a ro f h n l s 来自苦杏仁中h n l s 属于1 4 n l si 类，带有f a d 辅因子，其立体结构如图2 所示 。h n l s 具备2 个f a d 结合位点和其它的底物结合位点。f a d 辅因子埋在酶分 子的深处，完全与介质隔绝。f a d 结合部位有a 和b 片断，都被包围在6 个n 螺 旋( h 1 ，h 2 ，h 3 ，h 4 ，h 5 ，h 6 和h 9 ) 和2 个3 l o 类型的螺旋中。3 1 0 类型的螺旋 是蛋白质的一种二级结构，每一螺旋含有3 个氨基酸残基和l o 个原子组成的氢 键。这一结合部位还有1 3 折叠和在中心平面上的1 3ab 部分，后者对结合f a d 起 着重要作用。底物结合位点有明显的特征，3 个螺旋( b 4 ，h 7 和1 4 8 ) 和1 个3 1 0 类型的螺旋包围着6 个b 折叠片断。 1 3 3 羟基腈裂解酶的功能及应用 植物的产氰现象是由于b g l u 和h n l s 的联合作用释放出氢氰酸，氢氰酸有剧 毒，对植食昆虫有阻滞作用被用作趋虫剂，而且能够有效的抵制真菌类病原的生 长，因此能对植物起到一定的保护作用。实际上含氰苷存在于叶表皮的液泡中， 而分解含氰瞀的酶( 主要是b g l u ) 则存在叶肉中，互不接触，当叶片被咬碎或 机械损伤后，含氰苷就与酶混合，含氰苷中的氰醇和糖分开，前者再在h n l s 作 用下分解为酮 f j h c n ，这一现象在高等植物中比较常见，如：亚麻科、大戟科、 藤黄科、铁青树科、蔷薇科、禾本科植物等“”。 轾 b 弗r i * 口 h7 e 一0 0 ；z 雌第 * r 一 舛， 釉g a f 嚣 n 誉e 一0 一o h 科 | 崎d r o x c n r n 糖h o t r h o k e 。o l 、 。：赡- 图3 b 一葡萄糖苷酶和羟基腈裂解酶的反应机理 f i g ，3t h er e a c t i o nm e c h a n i s mo f b e t a g l u c o m d a s ea n dh y d r o x y n i t r i l el y a s e 除此之外，其中的氢氰酸( b c n ) 还可以用于氨基酸合成代谢的氮源1 。在 氨基酸合成中，氢氰酸在氰丙氨酸合成酶作用下重新转化为氰丙氨酸，后者在氰 丙氨酸水解酶作用下进一步水解为天冬氨酸，整个反应过程如图3 所示。 h n l s 能可逆地催化h c n 和醛或酮类化台物反应生成手性氰醇化合物或手性药 5 嚣一 鬻一一 物，在化学工业中能作为一种重要的生物催化剂“”。早在1 9 0 9 年，r o s e n t h a l e r 利用由杏仁中提取出的h n l s 成功的将醛和酮转化为手性氰醇，这一发现大大促进 t h c n 与醛酮的不对称缩合形成氰醇的工艺进展“”。该酶在有机合成中催化碳碳 键的形成，产物可转化成羟基化合物、胺化合物、羧基化合物等多种重要的手性 中间体，可进而转化成多种手性药物”“，如图4 所示。氰醇衍生物也是合成某些 化工产品的重要原料，如拟除虫菊酯杀虫剂，氯氰菊，氟胺氰戊菊酯。因此，在 不对称合成领域中，h n l s 日益成为研究的热点。 h 妒h 旦h 傩她嫩 r 7 、c , 0 2 h r7 、c n l i 越k 7 h 0 h r 乃n h 2 摄h 2 0 m s 认 h | ，n 吃 r x c o ，h 图4 氰醇是合成其他化合物的前体物 f i g 4t h ec y a n o h y d r i ni st h ep r e c u r s o ro fo t h e rs y n t h e s i z e dc o m p o u n d 2 苦杏仁苷酶的研究展望 苦杏仁苷酶是一种混和酶，其主要成份h n l s 、b g l u 的理论和应用研究虽然 已经有了较快的发展，但是笔者认为在农业生物技术领域对该酶的理论和应用研 究尚存在较大的发展空间，总体来讲对该酶的这方面的进一步研究可以从以下两 个方面着手： ( 1 ) 对含有h n l s 和b g l u 的经济作物开展该酶基因的表达和调控研究，加大 该酶基因结构和功能的研究深度，从而利用现代生物技术控制和调节，使其能够 按照人们的意愿来生产农业原料，这样才有可能从根本上解决经济作物育种、栽 培及加工中遇到的技术难题。 ( 2 ) 如前所述，该酶作用于作物体内的一些糖苷类等次生代谢物质对作物 的自我保护及品质十分有利( 如产氰现象、提高香气品质等) ，将该酶基因转化 到一些缺乏该基因的作物体内，加快转基因研究步伐，能够产生巨大的商业价值 和经济效益。 6 h h ￥o h r 二引言 1 研究内容 本实验室前期研究结果表明，烟草中缺乏水解以苯甲醇、苯乙醇、顺一3 一己 烯醇、香叶醇等醇系香气物质为苷元的糖营酶，商品苦杏仁苷酶( 商品名为： b g l u c o s i d a s ef r o ma l m o n d ) 能高效水解烟草中的糖苷类物质，产生苯甲醇、 苯乙醇、j 1 颐- 3 - 己烯醇、香叶醇等香气类物质。研究报道，苦杏仁苷酶与植物产 氰现象密切相关。产氰现象是植物体的一种自然防御现象，能够保护植物免受真 菌和昆虫的侵袭，这主要是因为植物体中b g l u 和 t n l s 联合作用降解含氰糖苷产 生有毒的氢氰酸所致。因此，可以将该商品苦杏仁苷酶基因转化到烟草中进行转 基因研究，以提高烟草的品质和抗性。本实验初步研究这种商品苦杏仁苷酶的组 成，尝试从杏树中克隆该酶基因c d n a 。 前期本实验室以化学合成的b g l u 的抑制剂b 一葡萄糖脒为配体，通过胪糖苷 键交联到支持物上，使糖脒a l 糖苷键一侧的氨基保持带j 下电荷的活化状态，合成 了- - ：种b g l u 的亲和层析树脂。利用这种亲和层析树脂从茶树叶片中纯化出了两 种分子量的b g l u 单体酶( 以下简称g l ui 和g l ui i ) ，根据这两种酶蛋白的端基氨 基酸序列设计寡聚核苷酸引物克隆了酶的基因c d n a 阅读框全长( g l ui1 8 9 9 b p 和 g l u i l l 8 9 0 b p ) 。本实验利用大肠杆菌表达系统体外表达茶树中这两种b g l u 基因， 研究这两种基因工程酶是否具有商品苦杏仁营酶类似的高效水解烟草中的糖苷 类物质的活性。 2 研究意义 克隆商品苦杏仁苷酶基因c d n a 并转入烟草，在烟草中转录和翻译这种基因， 一方面能使烟草产生相应的苦杏仁苷酶，水解糖菅类物质释放香气，提高烟草的 香气品质；同时，在烟草在受到病原菌的侵染时，苦杏仁苷酶能够水解烟草中的 含氰糖苷，释放出氢氰酸，从而抑制烟草病原菌的生长，对于培育高香、高抗型烟 草具有重要的意义。 若茶树8 g l u 基因表达产物具有高活性，必将会为作物育种学研究中基因资 源的发掘作出贡献，这无疑会提高其存在的价值。 7 3 技术路线 三茶树的两种b 一葡萄糖苷酶因c d n a 在大肠杆菌中的表达 1 材料 茶树龙井4 3 叶片取自安徽农业大学茶业系品种园，上海生工产品：d n a m a r k e r 、t a qd n a 聚合酶、p c r 合成系统。北京鼎国公司产品：g e le x t r a c t i o n k i t ；p r o m e g a 公司产品：m - m l v 逆转录酶；t a k a r a 公司产品：p m d 一1 8 ts i m p l e v e c t o r ；p h a m a c i a 公司产品：m r n a 提取纯化试剂盒；其他常用试剂皆为a m r e s c o 公司产品。 2 方法 2 1 茶树且一葡萄糖苷酶基因c d n a 的克隆 2 1 1 茶树叶片总r n a 的提取与鉴定 总r n a 提取参照江昌俊“”等的方法，具体步骤如下： 1 晴天取茶树鲜叶，称取0 5 9 放置预冷的研钵中，加入液氮、不溶性聚乙 烯吡咯烷酮( p v p p ，m m ，1 0 ) 和少许石英砂，迅速加入液氮研磨成粉 状。 2 加入0 9 m l 变性溶液( 4 m o l l 1 异硫氰酸胍，2 5 m m o l l 一，p h 7 0 柠檬 酸钠，0 5 十二烷基肌氨酸钠，0 i m o l l 。b 一筑基乙醇) ，冰浴1 5 m i n 。 3 4 c ，1 4 0 0 0 g 离心2 0 m i n ，移取5 5 0 ul 上清液至另一干净离心管。加 入1 1 0 体积( 5 5 “1 ) 2 m e l l - n a a c ( p h 4 0 ) ，等体积( 6 0 5 “1 ) 饱和酚 ( p h 3 5 ) 和1 5 体积( 2 4 0 u1 ) 氯仿异戊醇( 4 9 ：1 ) ，冰浴1 5m i n ，并 l r j 歇缓慢混匀。 4 4 c ，1 4 0 0 0 x g 离心2 0 m i n ，移取6 0 0 pl 上清至另一干净离心管中，加 入等体积( 6 0 01 11 ) 的异丙醇，混匀后置一7 0 。c 冰箱冷冻l o m i n 或一2 0 。c 冰 箱冷冻l h 。 5 4 c ，1 3 0 0 0 x g 离心2 0 m i n ，去上清，加入3 0 0 “1 变性溶液彻底溶解沉 淀，再加3 0 0 l 的异丙醇，混匀后置一7 0 。c 冰箱冷冻l o m i n 或一2 0 冰箱 冷冻1 h 。 6 4 c ，1 3 0 0 0x g 离心2 0 m i n ，去上清，加1 m 1 7 5 乙醇，冰浴5 m i n 。 7 4 c ，1 2 0 0 0 x 占离心5 m i n ，去上清，加1 m 1 7 5 乙醇，冰浴5 m i n 。 8 4 c ，1 2 0 0 0 x g 离心5 m i n ，除尽乙醇，空气中干燥沉淀，加3 5 “l 经d e p c 处理的d d h 。o ，存放于- 2 04 c 冰箱备用或于- 7 0 。c 冰箱较长时间保存。 提取出来的茶树总r n a 用甲醛变性凝胶电泳法检测其完整性，并用紫外分光 光度法检测其纯度。 2 1 2c d n a 第一链的合成 9 以0 1 i g o d ( t ) + 。为引物，参照逆转录酶说明书合成c d n a 第一链，反应总体 积为2 5 p l 。 1 取一d e p c 处理过的1 5 m l 的离心管，依次加入：4 “l 总r n a ( 约2 g ) ， 2 u 1o l i g o d ( t ) 。( o 2 5ug ”1 ) ，6 u 1 经d e p c 处理的d d h 。0 ，混匀后 7 0 温浴5 m i n ，然后立即置于冰上。 2 在上述管中依次加入：5p1 5 m - m l v 逆转录酶反应缓冲液，1 2 5ul d n t p s ( 1 0 m m o l l - 1 e a c h ) ，0 6 5 1 1 lr n a s i n ( 4 0 u p 1 ) ，1 1 斗1m m l v 逆转录酶( 2 0 0 u 1 t 1 ) 和5 “l 经d e p c 处理的d d h ：0 。 3 4 2 进行逆转录反应l h 。 4 7 0 l o m i n ，- 2 0 保存备用。 2 1 3r t p c r 法克隆茶树b 一葡萄糖苷酶c d n a 编码区序列 根据前期从茶叶中纯化并测序的两种b g l u 基因c d n a 的( g l ui 和g l ul i ) 碱 基序列设计引物。为了方便后续的基因工程操作，利用d n a s t a r 软件分析这两条 c d n a 编码区序列的酶切位点，选择d 厅v 和s a ci 两种限制性内切酶，并将其 位点序列分别列入上下游引物序列中。其中g l ui 上游引物p 与g l uic d n a5 端起始密码子及其后的序列相同：5 一g c a g a t a t c a t g g g g a g a t t t t c a a t a 一3 ( 下 画线部分表示胡v 酶切位点序列) ：下游引物p ：与g l uic d n a3 端终止密 码子及其前面的序列反向互补：5 一a g t g a g c t c t c 从t t c t t c a c a g g t t g 一3 ( 下画线 部分表示s a ci 酶切位点序列) 。由于这两条b g l u 基因c d n a 编码区序列都不 能被艮胡v 和s a ci 酶切，同样选择e c o rv 和s a ci 两种限制性内切酶，同 理设哥rg l ui i 匕游g | 物p ，序歹0 ：5 一g c g g a t a t c a t g g a a a t g g c g a a a a c t 一3 、g l ui i 下游引物p 序列：5 一a t a g a g c t c c t a g g t g g c c t t g g c a g g 一3 。 为了确保扩增出目的片段，在g l ui 和g l u i i c d n a 的开放阅读框外圈设计外 围引物w 和w ：，w 。和w ；两对，分别与带酶切位点的内部引物( p l 和p ：，p 。和p 1 ) 形成嵌套，进行巢式p c r 扩增。序列为w l ：a t a c c t c c a g a g t c t c c a t 订； w 2 ：t t a g t t t t c c a a g a a c a g a g c ；w 3 ：t a g a a c t a c a g g g c g a c a a c c ： w 4 ：a a t c c a c a c c c a a a c a c t a c c 。 【1 】在o 2 m l p c r 反应管中依次加入：d d h 2 03 4 7 p 1 ；c d n a4 p _ l ；l o x p y r o b e s t b u f f e r5 p 1 ；d n t p4 山；w f w 2 或w 3 f w 4 ( 1 0 t m o l l ) 2 p l 。 扩增程序采用热启动方法( 下文的p c r 皆用此方法) ，将反应混合体系置于 p c r 热循环仪中，按照以下程序进行降落p c r 反应：9 5 预热5 m i n ；7 8 保存加 0 3 “l t a q 酶；9 5 变性3 0 s e c 、6 2 ( g l ui ) 或6 7 ( g l u i i ) 退火3 0 s e c 、7 2 延伸2 m i n 、共2 个循环；9 5 变性3 0 s e c 、6 2 。c ( g i u i ) 或6 7 ( g l u i i ) 退火 3 0 s e c 、7 2 延伸2 m i n 、每个循环降低0 3 、共2 0 个循环；9 5 变性3 0 s e c 、 6 0 ( g l ui ) 或6 2 ( g l u i i ) 退火3 0 s e e 、7 2 延伸2 r a i n 、共1 0 个循环； 7 2 1 0 r a i n ，4 c 保存。 2 再向0 2 m l p c r 反应管中依次加入：d d h 2 03 7 7 1 1 1 ；上述p c r 产物i g l ； 1 0 p y r o b e s tb u f f e r 5 9 l ；d n t p4 p l ：p i m 2 或p 3 p ( 1 0 h m o l l ) 2 9 l 。 将反应混合体系置于p c r 热循环仪中，扩增程序如下：9 5