（遗传学专业论文）棉铃虫滞育激素基因启动子分析.pdf

巾科! 学技术人学硕十! 学位论文作者洪波 专业：i i 圣传，7 a g b h l h b o r n b r c g r p c n s c r e c r e b d h a b d o m i n a lg a n g l i o n b a s i ch e l i x - l o o p - - h e l i x b o m b y xm o r i b r a i n 缩略词表 c a l c i t o n i ng e n er e l a t e dp e p t i d e c e n t r a ln e r v o u ss y s t e m c a m pr e s p o n s i v ee l e m e n t 腹神经节 基础的螺旋环螺旋 家蚕 脑 降钙素基因相关肽 中枢神经系统 c a m p 应答元件 c a m pr e s p o n s i v ee l e m e n tb i n d i n gp r o t e i n c a m p 应答元件结合蛋白 d i a p a u s eh o r m o n e d h m b p d h m o d u l a t o r - b i n d i n gp r o t e i n d r m e m s a e p f b h a r i p o u m e f 2 m g m t p b a n p t t h r a c e r p p t s g s l g t b p t g d r o s o p h i l am e l a n o g a s t e e l e c t r o p h o r e t i cm o b i l i t ys h i f ta s s a y s e p i d e r m i s f a tb o d y h e l i c o v e r p aa m i g e r a i n h i b i t o ro fp o u m y o c y t ee n h a n c e rf a c t o r2 m i d g u t m a l p i g h i a nt u b u l e 滞育激素 滞育激素调节了结合蛋白 黑腹果蝇 凝胶阻滞分析 表皮 脂肪体 棉铃虫 p o u 的抑制了 肌细胞增强因予2 中肠 马氏管 p h e r o m o n eb i o s y n t h e s i sa c t i v a t i n gn e u r o p e p t i d e 性信息素合成激活肽 p r o t h o r a c i c o t r o p i ch o n n o n e r a p i da m p l i f i c a t i o no fc d n ae n d s r a t p r e p r o t a c h y k i n i n s l i b o e s o p h a g e a lg a n g l i o n s a l i v ag l a n d t a t ab o xb i n d i n gp r o t e i n t h o r a c i cg a n g l i o n 促前胸腺激素 c d n a 末端快速扩增 小鼠前速激肽原 咽下神经节 涎腺 t a t a 盒结合蛋白 胸神经节 巾科。披术火学硕士学位论文作：档洪波 + 专业遗传- 学 摘要 滞育激素( d h ) 和性信息素合成激活肽( p b a n ) 是调节昆虫发育利性激素合 成的两个重要的神经肽。它们由同一个基因所编码，称为d h p b a n 基因。本研究 重点围绕着棉铃虫d h p b a n 綦因的肩动了的相关的调控元件和可能的转录因了进 行了一系列实验。首先构建了不同长度的d h p b a n 基因的启动了连接到l u c i 荧光 素酶报告基因上游的报告质粒，瞬时转染进家蚕b m n 细胞，测定其启动了的转录 活性。结果显示，在棉铃虫d h p b a n 启动予上包含多个调节区域，它们能激活或 者抑制d h p b a n 启动予的活性。一个激活区域( 一4 6 7 3 7 1b p ) 能激活d h p b a n 肩动了的转录，而另一个抑制区域( 一9 6 5 一5 3 4 ) 能抑制其肩动了的活性。 凝胶阻滞分析显示在棉铃虫咽下神经节的核蛋白中，两个可能的转录因了 h a r d h m b p l 和h a r d h m b p 2 能特异地结合其激活区。进步，在棉铃虫d h p b a n 基因的启动子上发现了一个e b o x ( c a g c t g ) 调控元件，能与一个核蛋白 因了h a r d h m b p 3 结合。e b o x 是b h l h 家族转录因了结合的d n a 核心元件，推 测h a t d h m b p 一3 可能是b h l h 转录因子家族的成员。e 。b o x 的缺失将导致 d h p b a n 基因的启动予转录活性的下降，可能调节已经定位的激活区。总之，在 棉铃虫d h p b a n 基因的启动予上，多个调控元件和转录因_ 了包含在d h p b a n 基 因的转录过程。 在棉铃虫d h p b a n 基因的启动予的上游，发王见了多个f o r kh e a d 转录因了结合 位点。因此，我们克隆了棉铃虫的f o r kh e a d 转录因予，f o r kh e a d 转录因了在家蚕细 胞株b r a n 中过量表达能够增强棉铃虫d h p b a n 启动了活性。n o r t h e r nb l o t 表明f o r k h e a d 转录因予表达在棉铃虫的多种组织。半定量r t - p c r 显示f o r kh e a d 转录因了在 滞育个体脑中几乎不表达。在中肠中，滞育和非滞育的个体f o r kl i e a d 的表达趋势j l 乎相同，都是幼虫期表达量低，到了预蛹和蛹期表达量开始大量增加，这可能与棉 铃虫的滞育过程中的一些发育事件相关。 关键词：滞育激素；性信息素合成激活肽；转录调控；e b o x ；转录因了：棉铃虫： f o r kh e a d 转录因子；滞育。 巾科! 学技术大学硕士学位论文作者洪波专业遗传o a b s t r ac t d i a p a u s eh o r m o n e ( d h ) a n dp h e r o m o n eb i o s y n t h e s i sa c t i v a t i n gn e u r o p e p t i d e ( p b a n ) a r et w oc r u c i a ln e u r o p e p t i d e sw h i c hr e g u l a t e i n s e c td e v e l o p m e n ta n ds e x p h e r o m o n eb i o s y n t h e s i sr e s p e c t i v e l y t h e s ep e p t i d e sa r ee n c o d e db yas i n g l eg e n e ， t e r m e dd h p b a ng e n e i nt h i ss t u d y ，w ec h a r a c t e r i z e dt h ep r o m o t e ro ft h ed h p b a n g e n e ir a h e l i c o v e r p aa r m i g e r a ( h a r ) t r a n s i e n tt r a n s f e c t i o na s s a y su s i n gas e r i e so f s t e p w i s ed e l e t i o nf r a g m e n t sl i n k e dt o t h el u c i f e r a s e r e p o r t e rg e n ei n d i c a t e t h a tt h e p r o m o t e rc o n t a i n sm u l t i p l er e g u l a t o rd o m a i n st h a tc a na c t i v a t ea n dr e p r e s sr e p o r t e rg e n e e x p r e s s i o n t h ef r a g m e n ts p a n n i n g 一4 6 7t o 一3 7 1 b po ft h ed h p b a np r o m o t e ri s a n a c t i v a t o rd o m a i no ft r a n s c r i p t i o n ，w h e r e a st h er e g i o nf r o r t i 一9 6 5t o 5 3 4b pr e p r e s s e st h e p r o m o t e ra c t i v i t y i nt h ei n s e c tc e l ll i n eb r a n e l e c t r o p h o r e t i cm o b i l i t ys h i f ta s s a y s d e m o n s t r a t et h a ta tl e a s tt w on u c l e a rp r o t e i nf a c t o r sf r o mt h en u c l e a rp r o t e i ne x t r a c t so f ha r m i g e r as u b o e s o p h a g e a lg a n g l i o n ，h a r d h m b p 一1a n d 一2 ( d h - m o d u l a t o 卜b i n d i n g p r o t e ir a ) c a ns p e c i f i c a l l yb i n dt ot h ea c t i v a t i n gr e g i o n f u r t h e r m o r e ，w ec h a r a c t e r i z e di n d e t a ilt h a tt h en u c l e a rp r o t e i nf a c t o rh a r - d h m b p - 3c a ns p e c i f i c a ll yb i n dt oac l a s s i c a l e b o x ，c a g c t gl o c a l i z e da tp o s i t i o n 一3 6 0 一3 5 5b p ，ap o t e n t i a ls i t ef o ri n t e r a c t i o nw i t h b a s i ch e l i x l o o p h e l i xt r a n s c r i p t i o nf a c t o r s m u t a t i o no ft h i se b o xr e s u i t si nas i g n i f i c a n t r e d u c t i o no ft h ep r o m o t e ra c t i v i t y ，s u g g e s t i n gi tc a nm o d u l a t et h ep r e v i o u s l yi d e n t i f i e d a c t i v a t o rd o m a i n t a k e nt o g e t h e r , m u l t i p a r t i t ec i s e l e m e n t sa n dt r a n s c r i p t i o nf a c t o r si n t h ed h p b a np r o m o t e ra r ei n v o l v e di nr e g u l a t i o no f t h eg e n ee x p r e s s i o n s e v e r a lf o r kh e a dt r a n s c r i p t i o nf a c t o rb i n d i n gs i t e sa r ei n v o l v e di nh a r d h - p b a n p r o m o t e r w ec l o n e dt h ef o r kh e a dt r a n s c r i p t i o nf a c t o rf r o mh e l i c o v e r p aa r m i g e r a f u n c t i o n a la n a l y s i ss h o w e dt h a to v e r e x p r e s s i o no ff o r ki l e a dt r a n s c r i p t i o nf a c t o ri n t i l e b o m b y xc e l ll i n eb m n a c t i v a t e dt h ep r o m o t e ro fh a r d h p b a n n o r t h e r nb l o ta n a l y s i s s h o w e dt h a tf o r kh e a dt r a n s c r i p t i o nf a c t o rg e n ei s e x p r e s s e din n o n n e u r a ia n dn e u r a l t i s s u e s s e m i q u a n t i t a t i v er t - p c ra n a l y s i sd e m o n s t r a t e dt h a t f o r kh e a dm r n air at h e b r a i no fd i a p a u s ei n d i v i d u a li sn o te x p r e s s e d i nt h em i d g u to fd i a p a u s ea n dn o n d i a p a u s e t y p e ，t h el e v e lo ff o r kh e a dm r n ao fe a r l ya n dm i d d l es t a g e so f6 mi n s t a rl a r v a ew a s l o w e rt h a ni a t e6 mi n s t a rl a r v a ls t a g ea n de a r l yp u p a ls t a g ei nb o t ht y p e s t h e s e d a t a s u g g e s tap o s s i b l er o l ef o rf o r kh e a dt r a n s c r i p t i o nf a c t o ri nt h ed e v e l o p m e n ti nd i a p a u s e p l o c e s so fh e l i c o v e r p aa r m i g e r a k e y w o r d ：d i a p a u s eh o r m o n e ；p h e r o m o n eb i o s y n t h e s i sa c t i v a t i n gn e u r o p e p t i d e ； t r a j l s c l i p t i o n a lr e g u l a t i o n ；e b o x ；t r a n s c r i p t i o nf a c t or ；h e l i c o v e r p aa r m ( g e r a ；f o r kh e a d t r a n s c r i p t i o nf a c t o r ；d i a p a u s e 巾l i 科0 ：技术人! 学硕十学位论文作名洪波 专业遗传￥ 棉铃虫滞育激素基因启动子分析 前言 1 神经元特异基因表达的转录调控 在细胞中，一些特异基因的表达决定它的表型。这些基因的表达是由一些组织 特异的、发育的和牛理性的刺激的所决定。这些特异基因的表达由细胞接受的胞外 信号所激活或者抑制。基因表达能在转录水平被调控，例如m r n a 的合成；基因表 达也能在后转录水平调控，例如m r n a 的剪切和稳定性。神经系统在机休中是最复 杂的组织，表现出一种细胞表型的多样性。这种多样性可能反映在细胞分化过程- 二p 苯因表达的转录调节机制的多样化。在神经元中，基因表达的转录调节系统是非常 复杂的，通常应答于细胞接受到的多种胞外刺激。另外，在神经系统发育利随着神 经元分化成独特的神经元的表型过程中，是一个各种基因表达的激活和抑制的相可 作用的过程。 基因在体内是包装在非常紧密的染色体中。染色体的结构是可变的，如果一些 染色体区域的结构是浓缩状态的，认为这个区域的d n a 不能与大多数转录因了相 瓦作用的，因此这个区域的基因是转录沉默的。如果一些染色体区域的结构是开放 的，则一些转录因子就可能与这个区域的d n a 相互作用，导致转录激活。因此研 究神经元特异基因的表达，染色体结构的调节也是非常重要的一豺i 。 处于转录激活状态的染色体上的基因的转录调控取决于基因上游或者基因内部 的一些保守的d n a 元件和转录因子的相互作用。这些转录因了决定启动了的活力， 刺激或者抑制基因表达的水平。在所有基因的启动了上，存在有限数量的保守的 d n a 元件，这些元件由一些转录因子蛋白家族所识别，而这些蛋白家族的成员常常 表达在一个组织，有相同的发育和刺激诱导模式。能识别这些特异的d n a 元件的 蛋白数量因为各种转录因予之间形成异二聚体而数量大增，从而用有限数量的蛋白 进行非常复杂的基因转录调控，比如一种转录因了如果与一个它的搭档形成二聚体， 它j l 哿引起某个基因的转录激活，但是如果它与另一个它的搭档形成二聚体，将引起 某个摹因的转录抑制。在基因的启动了上存在一些保守的d n a 元件，这些转录复 合体有不同的亲利力与特异的保守d n a 序列结合，行使不同的功能。这些d n a 元 件在肩动了上排列和定位导致了结合在这些元件一l 的转录因了的相瓦作用。这些 4 科。j j 技术人学硕? 卜! 学位论文作描洪波 d n a 功能元件的组合对于多细胞生物产牛基因表达的多样性是需要的。| 三i 前，通过 无性繁殖细胞系的使用，一些基因的转录调节机制的已经研究。仙有一个前提，那 些要研究的基因在某个细胞系中是有活力的。通过这个研究可以回答二个问题。 l ，允许转录因了结合的d n a 区域在哪里? 2 ，在各种细胞系中，或者在细胞应答各种刺激下，j 南动了增强基因表达的能力如 何? 3 ，和d n a 元件相可作用的转录因了是什么? l 1 基因表达的基础转录机制 核心肩动予认为位于转录起始位点周围，由r n a 聚合酶i i 和基础转录因了识别 的区域，这个区域对于任何转录的发生都是重要的。在真核细胞中，r n a 聚合酶i i 是大多数功能基因转录的聚合酶，至少由十个组分组成的多亚基复合物( n a k a t a n i e ta 1 19 9 0 ) 。r n a 聚合酶ii 识别的核心肩动予包含t a t ab o x 并l i 通常有一个i n i t i a t o r m o t i f 。r n a 聚合酶i i 转录复合物与核心肩动予的结合是由基础转录因了t f i i d 经 t b p ( t a t ab o xb i n d i n gp r o t e i n ) 与t a t ab o x 相瓦作用引发的( u s h e v ae t a 1 ，1 9 9 2 ) 。然后一系列的其它基础转录因予和r n a 聚合酶i i 结合形成一个多亚基的 转录起始复合物从而转录起始。转录起始复合物也是结合在启动予其它区域转录因 了与之相瓦作用的靶( d y n l a c h te ta 1 ，1 9 9 1 ) 。 1 2 启动子上的调控元件 转录因了根据与特异的d n a 序列结合的结构域，利与一些蛋白结合的二聚化的结 构域，可以分成一些家族( h ea n dr o s e n f e l d ，1 9 9 1 ；l a t c h m a n ，1 9 9 3 ；s t r u h l ，1 9 9 1 ) 。 转录因予以一种序列特异型的方式与d n a 元件相互作用。在肩动了上，有一些有限 数量的、保守的d n a 元件，它们通常是由6 到1 2 碱基组成的短d n a 序列。基于特定 家族转录因子与d n a 元件结合序列的比对，每个家族的转录因了结合的特异d n a 元 件都拥有共同的保守序列( 表1 ) 。这些元件能被一些组织特异性的、发育的、刺 激诱导的转录因予家族所识别，因此决定了什么转录因了与肩动了结合以及与肩动 了结合的位置，最终决定了特异基因转录调节的机制 ( 图1 ) 。 1 3 启动子功能的分析 中国科学技术大学硕士学位论文 作者洪波 专业遗传学 1 3 1 报告基因构建的瞬时表达分析 要利用瞬时转染分析对基因的启动子进行研究，必须完成下列步骤：选择合 适的细胞系；确定将d n a 导入细胞的转染程度；选择报告基因和相应的报道分 析方法；鉴定目的基因的假定启动子区；将启动子插入到合适载体内报告基因 的上游。上述这些初始步骤完成后，就可以进行瞬时转染实验，以确定是否可以检 测得到启动子依赖型报道基因的活性。 t + t i 黜硝砸删砌咖r t i s s u er c s 口i c t e dr e p r o o f r e p r e s e n m i l lh e t e r o d t m s r “哪睁nd l f f o r o r s tm e m b e r so f 竹m 4 t w i qm t r t r l p 矗o nh c 蜘r f a z m l l y l r h ed i f f e r e n t i d r a p r e s e n t sd i s l h l 畸tm i e n so fi l l m tf a m i l y ；g r e yi s u b l q u l t e m f l ys x p r m m e df a c l o rm n d 帅o i h s n s n - 岫u r m s t m t c t s di n 时m l re x p n m s l o n 图i 一个基因的启动子区能与组成型的和组织特异的转录因子相互作用。这些转录因子可能是 基因表达的增强或抑制因子。这些因子以单体或与别的蛋白形成多聚体的形式与d n a 结合。核 心启动子与基础转录因子和r n a 聚合酶i i 相互作用，这是对转录的起始非常重要的。 表1 转录因子家族和它们识别的d n a 元件 f a m i l y c o n s e n s u ss e q u e n c e m e m b e r s a p l t g ac ( 3 t c a b a s i ch e l i x l o o p - h e l i x ( b h l h ) c a n n t g o c t a m e r b i n d i n gp r o t e i n a t g c t a a t c a m p r e s p o n s i v e ( c r e b a t f ) t g a g c t c a c - j u n ，c - f o s ，j u n d u s f ，m y o d ，m a s h ，a p 一4 ，c m y c o c t a m e ri ，b r n3 c r e b ；心f - 1 6 巾科7 ：披术人t 硕十学位论文作者洪波 l ，细胞材料 用于瞬时转染分析的细胞材料必须符合二项标准：它们应表达含有目的肩动 了的内源基因；能使培养物中的细胞在2 3 天内保持数i - ：1 恒定，以保证实验的完 成：必须有一套将质粒d n a 转染进细胞的方法。 如果难以获得表达内源目的基因的转化细胞系，可以尝试分离表达i 源目的綦医l 的原代刍1 胞的方法。仙是原代细胞通常难以分离分离科i 保存，且对于常用的转染方 法有抗性。另外，根据目的调控区的性质，可以合理地检测与没有表达相关内源苯 区| 自勺细胞类型密切相关的另一种细胞类型。相关的细胞类型中可能含有许多摹因活 性所需的转录因予。因为在人工瞬时转染分析中，这种相关细胞中抑制内源基因的 机制可能不发挥作用，可能检测到肩动- 了活性。仙是，该策略远不是理想的选择， 一般用作最后的凭借予段。 2 ，转染程序 已有多种转染方法用于瞬时转染分析，包括磷酸钙转染、d e a e 一葡聚糖转染、 电穿孔转染、脂质体转染、利用其他阳离予试剂的转染科i 原牛质体转染。对给定的 细胞系，为确定哪种转染方法最可能成功，应首先进行文献检索，确定f 哪种方法已 经成功地用于某种细胞株，或相关细胞系( 既来源与相似组织的细胞系) 。 3 ，报告基因，载体和分析方法 瞬时转染中，除了鉴定合适来源的细胞外，还要选择一种合适的报告基因，将 报告撼因的m r n a 、蛋白质和酶水平( 或活性) 作为衡量肩动了活性的指标。利用 报道基因，而不用受调控区控制的生理基因，其优点使报道基因能消除将质粒转录 物和内源转录物区分的网难。 最常用的报告基因来源于昆虫( 荧光素酶) 或原核牛物( c a t 矛i 1 1 3 - 半乳糖苷 酶) ，它们所编码的酶活性在大多数真核细胞中未发现。一般：睁k t 的肩动了区捅入 报道摹因编码序列的上游，因为报道基因通常含有k o z a k 共有序列( e l i 含有真核翻 i ：g ：1 记- h - 一, ，密码了的序列) 和下游p o l ya 信号，由r n a 聚合酶i i 合成的r n r n a 能有效地 翻译成蛋白质。通常测定相应的酶活性可检测到这些报道基因表达活性于肩动了转 录起始频率大致成比例，因此报道基因检测提供了一种合理又精确的肩动了活性评 价方法。 中国科学技术大学硕士学位论文 作者洪波专业遗传学 4 ，质粒的构建 要分析启动子的活性，就必须将假定的启动子序列插入到报道基因的上游。为 了选择要插入报道载体的合适d n a 片段，必须首先确定翻译起始密码子和转录起始 位点的位置。 一般来讲，初步研究过程中启动子片段的下游界限应选择在转录起始位点和 a t g 之间。已有报道说明功能性启动子元件位于这一转录前导区中，因此，插入片 段应包括尽可能多的非翻译区。 插入报道载体启动子片断的合适上游界限更难进行界定。有些启动子具有强的 活性，在转录起始位点上游2 0 0 - - 一3 0 0 b p 处进行正确的调控。而有些启动子如果不带 有远距离调控区( 如增强子) ，则不能行使调控，就不可能产生可检测的活性。 1 3 2 转基因分析 利用转基因的方法，果蝇的f m r f a 神经肽的转录调控机理得到了深入的研究。 把f m r f a 基因的上游序列连接到一个报告基因上游，通过p 转座子进行转基因， 可以在活体水平上分析启动子上与转录调控相关的重要单元盒。利用这种方法，发 现了f m r f a 基因的一个增强子上有三个转录因子a p t e r o u s 的结合位点，它们对基 因的特异表达起到关键作用( 图2 ；b e n v e n i s t ee ta 1 ，1 9 9 8 ) 。a p t e r o u s 是一个具有 l i m 同源盒结构域的转录因子。 a a8 c bc 图2 通过果蝇转基因的方法研究转录因子a p t e r o u s 对 f m r f a 神经肽的转录调节作用。( a ) f i v r f a 神经肽上游 增强子上由三个转录因子a p t e r o u s 的潜在结合位点( - - 个 空白区) ，把野生型和a p t e r o u s 结合位点突变的增强子连 在h s p 基本启动子的上游，下游接有l a c z 报告基因。把构 建好的片段通过p 转座子整合到果蝇基因组中。( b ) 野生 型增强子能驱动l a c z 报告基因在表达特异表达f m r f a 的 神经分泌细胞中表达。( c ) a p t e r o u s 结合位点被突变后， 则检测不到l a c z 活性。( 引自b e n v e n i s t e e t a l 1 9 9 8 ) 。 中国科学技术太学硕士学位论文作者洪皱 专业遗传学 1 3 3 利用昆虫杆状病毒瞬时转染分析 最近，s h i o m i 等对于家蚕p t t h 神经肽的启动子活性的研究中，建立了一套 利用重组杆状病毒a c n i w 转染p t t h 启动子连接报告基因绿色荧光蛋白( g f p ) 进入中心神经系统的方法( s h i o m i e ta i ，2 0 0 3 ) 。使用这个系统，他们能很好的在家 蚕脑的两对分泌p t t h 的神经分泌细胞中观察到在p t t h 启动子控制下的绿色荧光 蛋白( g f p ) 的表达。从而找到了一个参与家蚕p t t h 转录调节的一个关键的转录 因子m y o c y t ee n h a n c e r f a c t o r 2 q v i e v 2 ) ( 图3 ：s h i o m ie ta 1 2 0 0 5 ) 图3 通过昆虫杆状病毒瞬时转染分析的方法研究家蚕p t t h 基因启动子在家蚕p t t h 神经分泌 细胞的体内转录活性。( a ) p i t h 神经肽基因启动子下游接有g f p 报告基因。把构建好的片段 通过昆虫杆状病毒a c n p v 转染到家蚕中枢神经系统。( b i ) 不同长度p t t h 启动子驱动的g f p 在家蚕p m 神经分泌细胞的特异性表达。其中b 为最长的启动子s 7 0 b p ，i 为最短长度的启动 子8 0 b p 。从b 到l ，扁动子长度依次变短。( j ) 不同长度p ”h 启动子驱动的g f p 在家蚕p t t h 申经分泌细胞的特异性表达的相对荧光强度( 引自s h i a m ie t a l 2 0 0 5 ) 。 9 巾科! j o 技术大学硕士学位论文作者洪波 i 4 调节神经元特异基因表达的转录因子家族 1 4 1 转录激活子a p 1 a p 1 转录因子复合物识另i j t g ac gt c a 保守的d n a 序列， c - j z l n ，c - f o s 家族的 成员利别的组织特异性的转录因子形成二聚体( c u r r a na n df r a n z a ，1 9 8 8 ；f r a n z ae ta 1 ， 1 9 8 8 ) 。a p 1 已经在神经科学领域受到了广泛的关注，因为它是最早特征的转录因 了之一，在许多神经元和神经元驱动的细胞中，它应答许多胞外信号而向上调控的 ( c u r r a na n dm o r g a n ，1 9 8 5 ；m o r g a na n dc u r r a n ，1 9 9 1 ；n a t a n j oe ta 1 ，1 9 9 】a ，1 9 9 1 b ) 。 然而在基因调节的过程中，a p 1 的各种功能仍然不清楚。 大量的研究已经显示a p 一1 家族转录因子应答与多种胞外刺激，包括神经牛长因 了( n g f ) ，疼痛和有毒物质的刺激( m i l b r a n d t ，】9 8 6 ；n a r a n j oe ta 1 ，1 9 9 1 b ；q u i n n ， l9 9 1 ；s o n n e n b e r ge ta 1 ，1 9 8 9 ) 。a p 一1 可以与c a m pr e s p o n s i v ee l e m e n tb i n d i n gp r o t e i n s ( c r e b ) 形成异二聚体，从而与c a m pr e s p o n s i v ee l e m e n t ( c r e ) 或者a p 一1 识别的保 守序列结合，应答c a m p 信号。a p 一1 可以与不同的蛋白结合形成不同的异二聚体， 从而应答不同的刺激。 a p 1 还可以与一些邻近的结合在启动子上的转录因了协同作用履行神经元特 异基因的表达。a p 一】位点与e b o x 的协同作用已经报道在小鼠神经肽 p r e p r o t a c h y k i n i n a ( r p p t ) 启动予的研究中( m e r m o de ta 1 ，19 8 8 ) 。 1 4 2 组织特异性的转录因子 有限数量的d n a 元件存在所有基因的启动子上，相同的d n a 元件可能被来自相 同家族的不同成员结合。因此，结合这些元件的一些组织特异性转录因子可能是一 个转录因- 了家族的不同的变异体。虽然它们有低的同源性，但是它们与d n a 结合的 结构域是非常保守的，一些蛋白二聚化的结构域也是保守的。 b a s i ch e l i x 1 0 0 p h e l i x ( b h l h ) 家族转录因予结合到一个叫做e b o x 的d n a 元件， 参与多个组织特异性基因的表达。b h l h 家族转录因了形成同源二聚体或异源二聚 体是它与d n a 结合的先决条件( c h u r c he ta 1 ，19 8 5 ；m u r r ee ta 1 ，19 9 4 ；m u r r ee ta 1 ， 19 8 9 ) 。b h l h 家族转录因了通过结合e b o x 调节许多神经肽基因的表达，比如i n s u l i n ( n a y a e ta 1 ，1 9 9 5 ) ，s e c r e t i n ( m u t o he ta 1 ，1 9 9 7 ) ，v a s o p r e s s i n ( g r a c ee ta 1 ，1 9 9 9 ) 。广泛 表达的b h l h 家族转录因了与组织特异性表达的这个家族的转录因了形成异二聚体 巾h 科学技术人学硕七! 学位论文作者洪波 与e - b o x 结合作为组织特异性基因表达的转录调节机制( r a s h b a s se ta 1 ，19 9 2 ；s a w a d a a n dl i t t m a n ，1 9 9 3 ) 。许多研究发现b h l h 家族转录因了在神经元特异表达的基因转 录调节过程中扮演重要的角色( y u t z e ya n dk o n i e c z n y ，1 9 9 2 ) 。 另一个家族的组织特异性转录因予是p o u 家族的转录因子。p o u 的名字来源与 二种最先发现的这个家族的转录因子。它们是p i tf ，o c t a m e rb i n d i n gp r o t e i n ，u n c1 p o u 转录因了的特征是含有一个p o u 结构域，它包括p o us p e c i f i c 一利p o uh o m e o d o m a i n 。p o u 的结合位点一般为八聚体序列，但与周围的序列也有关( a n d e r s e na n d r o s e n f e l d ，2 0 0 1 ) 。p o u 在果蝇中的同源蛋白是c f l a d r i f t e r ，它首先被证明的功能 是参与神经元中多巴胺脱羧酶( d o p ad e c a r b o x y l a s e ) 的转录调节( j o h n s o na n dh i r s h ， l9 9 0 ) ，此后还发现它与气管和神经胶质细胞的迁移相关( a n d e r s o ne ta 1 ，19 9 5 ) 。 c f l a d r i f t e r 归属于p o ui i i 亚家族，哺乳动物p o u1 1 1 亚家族成员的丰要功能是与神 经系统，尤其是下丘脑一垂体神经分泌系统的发育相关，而且能直接作用于某些神经 肽基因的上游，影响它们的转录调控( a n d e r s e na n dr o s e n f e l d ，2 0 0 1 ) 。p o u 家族的 转录因子能够激活和抑制一些基因的表达，研究表明p o u 对基因的表达是抑制还是 激活取决与p o u 结合位点在启动子上定位( d eg r a z i ae ta 1 ，1 9 9 4 ) 。p o u 还能与一 些蛋白形成异二聚体，从而抑铝1 o c t a m e rb i n d i n gp r o t e i n 结合到启动了上。果蝇的p o u 蛋白c f l _ a 可以与i p o u ( i n h i b i t o ro f p o u ) 形成异二聚体，抑制c f l a 结合到启动了 上的功能( t r e a c y e ta 1 ，1 9 9 1 ；t r e a c ye ta 1 ，1 9 9 2 ) 。 2 家蚕和棉铃虫d h p b a n 基因的转录调控 2 1 昆虫滞育激素基因的结构和功能 滞育激素( d h ) 首先在家蚕中被纯化测序( i m a i e ta 1 ，1 9 9 1 ) ，它含有2 4 个氨 基酸，c 端被酰胺化，它可诱导家蚕进入胚胎滞育( y a m a s h i t a ，19 9 6 ) 。随后，家 蚕的d hc d n a 也被克隆得到，发现它编码的1 9 4 个氨基酸前体肽还包括一个性信息 素合成激活肽( p b a n ) ，利三个新神经肽，并命名为o 【，p ，1 ，一s g 神经肽( s u b o e s o p h a d e a l g a n g l i o nn e u r o p e p t i d e ，s g n p ) ( 图4 ) ，因此编码d h 的基因也叫做d h p b a n 基因 ( s a t oe ta 1 、19 9 1 ) 。d h 特异的表达在食道下神经节中有l2 个阳性细胞( 刘d h p b a n 表达细胞) ，他们成簇分布在沿食道下神经节腹中线的三个特定区域内，其中4 个细 叶科。、技术人0 1 ：硕十! 学位论文作者洪波 专业遗化 胞分两对位于一i 颚神经元( r n a n d i b u l a rn e u r o m e r e ) 。6 个细胞分二对位于下颚衬l 经 元( m a x i l l a r yn e u r o m e r e ) ，余下2 个细胞作为一对位于下唇神经元( 1 a b i a l1 1 e u i o m e r e ) ( s a t oe ta 1 ，1 9 9 4 ，s u ne ta 1 ，2 0 0 5 ) 。 d h p b a nc d n a 在昆虫中广泛存在，先后在棉铃虫( h e l i c o v e r p aa r m i g e l 一臼) ( z h a n ge ta 1 ，2 0 0 4 a ) ，玉米夜蛾( h e l i c o v e r p az e a ) ( m ae ta 1 ，19 9 4 ) ，烟青虫 ( h e l i c m ，e r p aa s s u l t a ) ( c h o ie ta 1 ，19 9 8 ) ，小地老虎( a g r o t i si p s i l o n ) ( d u p o r t e t se ta 1 ， 19 9 9 ) ，海灰翅夜蛾( s p o d o p t e r al i t t o r a l i s ) ( i g l e s i a se ta 1 ，2 0 0 2 ) ，烟芽夜蛾( h e l i o t h i ， v i r e s c e n s ) ( x ua n dd e n l i n g e r ，2 0 0 3 ) ，茶姬卷叶蛾( a d o x o p h y e ss p ) ( c h o ie ta 1 ，2 0 0 4 ) ， 甘蓝夜蛾( m a m e s t r ab r a s s i c a e ) ( j a c q u i n j o l ye ta 1 ，19 9 8 ) ，蓖麻蚕( s a m i ac y n t h i a r i c i n i ) ( w e ie ta 1 ，2 0 0 4 ) ，和柞蚕( a n t h e r a e ap e r n y i ) ( g e n b a n k1 1 0 a y 4 4 5 6 5 8 ) 等 昆虫中被克隆，它们的c d n a 结构都很相似。然而d h 在这些昆虫种中所起的牛物学 意义仍然是未知的。有趣的是，d h 可以加速蛹发育和终止蛹滞育的一个新功能已经 在夜蛾科种棉铃虫( ha r m i g e r a ) ( z h a n ge ta 1 ，2 0 0 4 b ) ，烟青虫( ha s s u l t a ) ( z h a o e ta 1 ，2 0 0 3 ) ，烟芽夜蛾( hv i r e s c e n s ) ( x ua n dd e n l i n g e r ，2 0 0 3 ) 中被揭示。 迄今为止，d h p b a n 基因序列已经分别在家蚕( x ue ta 1 ，1 9 9 5 ) 和棉铃虫( z h a n g e ta 1 ，2 0 0 4