子宫内膜癌前病变中Kras与MTS1p16基因的表达及意义.doc

子宫内膜癌前病变中Kras与MTS1/p16基因的表达及意义【摘要】目的探讨Kras激活与MTS1/p16基因突变/缺失在子宫内膜癌中的发生发展关系。方法对子宫内膜癌及癌前病变组织Kras与MTS1/p16蛋白的免疫组化测定并用PCR技术对MTS1/p16基因在子宫内膜癌中的纯合性缺失进行检测。结果Kras、p16蛋白广泛存在于子宫内膜癌和癌前病变组织中，癌前病变Kras表达为11.9%，癌组为62.96%(P0.05),而p16表达分别为76.59%与51.85%。13例p16蛋白表达阴性子宫内膜癌PCR扩增，7例显示外显子1缺失。Kras表达与细胞恶性程度呈正相关，p16表达则呈负相关。结论(1) Kras基因激活与MTS1/p16基因突变/缺失导致细胞周期增殖失控，是内膜癌发生发展的一个重要环节；(2) 子宫内膜癌中p16基因外显子1纯合子缺失可能是p16蛋白表达降低的机制之一；(3) 动态观测内膜增生组织中的p21ras表达阳性者，对子宫内膜癌的早期发现可能有积极意义。 【关键词】 子宫内膜癌; 癌前病变; Kras基因;MTS1/p16基因;基因表达/缺失Kras and MTS1/p16 Gene Expression in Endometrial Carcinoma and Benign Endometrium and its SignificanceLI Aibin,WANG Qiongshu, LIU Yuanjiao, SHI YuxiaRenming Hospital of Wuhan University,Wuhan 430060,China;Wuhan General Hospital of Guangzhou Military CommandAbstract：Objective To discuss the relationship between Kras gene activation and MTS1/p16 gene mutation/deletion and the progression of endometrial carcinoma. Methods We determine the Kras protein and p16 protein in endometrial carcinoma and benign endometrium by immunohistochemistry, and determine the deletion of extronl of MTS1/p16 gene in endometrial carcinoma.Results The Kras protein and p16 protein extensively exist in endometrial carcinoma and benign endometrium. In benign endometrium Kras protein expression is 11.9%,in endometrial carcinoma,it is 62.96%(P0.05),p16 Protein expression is 76.59% and 51.85% respectively 13 case endometrial carcimoas which p16 protein expression is negative and were analyses by the PCR,7cases are the deletion of extron1. Kras protein expression is positively related to endometrial carcinoma. p16 Protein expression is negatively related.Conclusion (1) Kras gene activation and MTS1/p16 gene mutation/deletion lend to the lose of control of cell proliferative cycle, which is important in carcinoma development (2)The Homozygous deletion of extronl of MTSI/p16 gene in endometrial carcinoma is possibly one of the pathogenesis of p16 protein low expression;(3)It is important for early diagnosis of endometrial carcinoma by continualy watching the patients whose endometrium is expressed by p21 ras.Key words：Endometrial carcinoma; Benign endometrium;Kras gene;MTS1/p16 gene; Gene expression/deletion0 引言 目前认为子宫内膜癌的发生、发展与癌基因的激活和抑癌基因的失活有关1,2。本研究通过对子宫内膜癌及癌前病变组织Kras蛋白与MTS1/p16蛋白的免疫组化测定并用PCR技术对MTS1/p16基因在子宫内膜癌中的纯合性缺失进行检测，探讨Kras与MTSI/p16基因在子宫内膜癌中的表达及临床意义。1材料与方法1.1 标本来源 选取武汉大学人民医院1997年5月1999年12月，手术切取子宫内膜标本83例，其中子宫内膜息肉30例，不典型增生17例，子宫内膜癌36例（子宫内膜腺癌21例，子宫内膜乳突状癌11例，透明细胞癌2例，腺鳞癌2例，平均年龄58.53岁）。手术前病人未做任何抗癌治疗。所有病例均经病理证实，子宫内膜癌根据1988年ISGP肿瘤病理分级方案和1988年FIGO分期方案进行分级和临床分期。1.2 DNA的提取 参照分子克隆手册提取DNA。分别测定其中OD 260nm和OD 280nm 比值，在1.82.0之间为合格。1.3 试剂 Kras、p16蛋白单克隆抗体购自福州迈新公司。引物GibcoBRL公司合成。p16 Exon 1 5，GAAGAAAGAGGAGGGGCTC3，GCGCTACCTGATTCCAATTC 3，（340bp）1.4 方法 Kras、p16免疫组化方法检测。p16基因外显子1缺失的检测用于扩增的p16 Exon 1加入PCR反应液中同时扩增。PCR的循环参数为94，变性5min,55退火2min，72延伸3min；后续循环94 1min，55 1.5min, 72 2min;末轮循环94 1min， 55 2min, 72 2min，总循环数30次。PCR扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭溶液中染色。用HPIAS1 000高清晰病理图像分析系统观察，分析DNA泳带，并摄片记录。340bp处无电泳条带为p16基因Exon 1缺失。1.5 结果判断 免疫组化阳性染色为棕黄色颗粒，位于细胞膜或细胞浆内。1.6 统计分析 SPSS8.0软件进行卡方检验和四格表确切概率检验方法。差异有显著性(P0.05)。2 结果2.1 子宫内膜癌及癌前病变中Kras蛋白与p16蛋白表达 Kras蛋白的表达与p16蛋白表达癌前病变在各组间差异无显著性，不典增生组与子宫内膜癌组间差异有显著性，但各组内差异有显著性（P0.05）；进行组织学分级可见不典型增生、子宫内膜癌G1级间Kras蛋白与p16蛋白表达差异无显著性，但各组内差异有显著性。Kiras基因的表达强度与细胞恶性程度呈正相关，p16表达则呈负相关,见表1、2。表1 子宫内膜癌及癌前病变中Kras蛋白与p16表达（略）组内P0.005表2 Kras蛋白与p16蛋白表达子宫内膜癌病理分级（略）组内P0.052.2 PCR法检测p16基因外显子1 对免疫组化p16蛋白表达阴性的13例子宫内膜癌、2例子宫内膜息肉和1例不典型增生进行p16基因外显子1PCR扩增，7例癌组织扩增阴性（5例中分化腺癌，1例低分化粘液腺癌，1例鳞腺癌），提示p16基因外显子1纯合子缺失；息肉与不典型增生扩增阳性。3 讨论3.1 Kras基因激活与子宫内膜癌的发生发展 Kras基因产物p21ras蛋白与G蛋白a亚基同源3，功能类似。当ras基因点突变，p21ras氨基酸末端a螺旋丢失，与GTP结合力减弱，GTP酶活性降低，难使GTP分解成GDP，自身调节作用被阻断，使细胞无休止的分裂增殖，呈恶性增长。这种无限增殖的主要特征是不依赖外界信号刺激而自行发生4。Long等5首先报道应用免疫组化方法检测子宫内膜癌中p21ras改变，结果子宫内膜良性病变均无ras基因表达，4例不典型增生中1例阳性表达，子宫内膜癌G1期有18%表达，G2、G3有95%的表达。Sasaki6对98例子宫内膜增生患者进行研究，发现Kras突变在子宫内膜癌起始阶段就有发生。本实验发现Kras蛋白广泛存在于子宫内膜癌和癌前病变组织中，Kras蛋白的表达在癌前病变、子宫内膜息肉，不典型增生与子宫内膜癌间差异有显著性，在进行组织学分级可见不典型增生与子宫内膜癌（P=0.13）相一致7。说明Kras基因的突变失活不仅发生在肿瘤的起始阶段。本实验发现Kras蛋白广泛存在于子宫内膜癌和癌前病变组织中，Kras蛋白的表达在癌前病变、子宫内膜息内，不典型增生与子宫内膜癌间差异有显著性，在进行组织学分级可见不典型增生与子宫内膜癌G1级间Kras蛋白表达差异无显著性。这与Enonoto的研究发现不典型增生中Kras基因突变率略低于肿瘤组（P=0.13）相一致7。说明Kras基因的突变失活不仅发生在肿瘤的起始阶段，也发生在进展阶段。Kras基因的表达随内膜癌组织分化程度下降而上升，这提示可由p21ras的表达程度来判断内膜癌的恶性度；分化程度差者预后欠佳，提示Kras的高表达可能与预后有关，亦有资料显示Kras原癌基因激活在决定子宫内膜癌预后中起重要作用8。 子宫内膜息肉在临床常见，其癌变率为0.89%9,实验发现在子宫内膜息肉中有少量p21ras的表达，这说明在子宫内膜息肉中有癌基因Kras的激活，Kras基因可能参与子宫内膜癌的早期发生，子宫内膜息肉可能是子宫内膜癌的高危因素。3.2 MTS1/p16基因突变/缺失与子宫内膜癌发生发展的关系 p16基因又称多重抑癌基因1（mulitiple tumor suppressor1,MTS1），由2个内含子（intron）和3个外显子(exon)组成编码的蛋白质，分子量为15.845KD。p16蛋白通过与CDK4特异性结合而使其失活，阻止细胞进入G1/S期，对细胞周期起反向调节作用，抑制细胞的分裂与增殖10。p16基因表达异常时，p16蛋白合成障碍导致细胞增殖失控11。通常发现肿瘤细胞系的p16基因缺失率在50%以上，其缺失在维持肿瘤恶性表现及细胞永生性方面起重要作用12。本实验发现子宫内膜癌p16蛋白阳性表达显著低于子宫内膜良性病变，其表达与肿瘤组织学分级呈负相关，并且p16蛋白表达阴性者，子宫内膜癌细胞分化差。这与国内徐苗厚13利用免疫组化研究p16蛋白在50例子宫内膜癌表达情况的结论相一致。用PCR技术对13例免疫组化p16蛋白表达阴性内膜癌进行外显子1扩增，7例扩增阴性；息肉与不典型增生阳性，表明p16基因外显子1纯合子缺失可能是p16蛋白表达降低的机制之一，与内膜癌的发生有密切关系，而且p16基因缺失与组织分级严重程度有一定关系，可成为预测病情进展的指标之一。这与国内周晓春等11的报告相一致。 ras基因与cyclin有相互作用关系，Kras基因激活导致细胞周期紊乱，p16为细胞周期依赖性激酶的抑制剂，野生型可抑制细胞的分裂，抗突变型Kras，抑制肿瘤细胞的生长；p16基因表达异常时，p16蛋白合成障碍导致细胞增殖失控，与Kras起协同作用，维持肿瘤细胞的永生性。 我们认为Kras激活与p16基因突变/缺失导致细胞增殖失控，进而发生癌变，是内膜癌发生发展的一个重要环节；Kras基因与p16基因表达相反，可能有协同作用，子宫内膜癌中p16基因外显子1纯合子缺失可能是p16蛋白表达降低的机制之一；Kras表达与细胞分化呈正相关，MTS1基因产物表达降低与肿瘤分化呈负相关，推测Kras阳性而p16阴性者预后差；动态观测内膜增生组织中的p21ras表达阳性者，对子宫内膜癌的早期发现可能有积极意义。子宫内膜癌及癌前病变中Kras基因与MTS1/p16基因的表达及意义有待进一步研究。【参考文献】 1Fujino T, RisingerJI, CollinsNK.etal .Allesotypeof endometrial carcinomaJ.Cancer Res, 1994,54(16):42944298.2Kamb A,Cruis NA,weaverFeldhaus J, et al. 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