子宫内膜癌p16基因及蛋白表达.doc

子宫内膜癌p16基因及蛋白表达作者：陈桂黄,章兴凤,保芳,黄德年单位：1 226500 江苏如皋，如皋博爱医院妇产科2 226500 江苏如皋，如皋磨头中兴医院妇产科 3 226001 江苏南通，南通大学附属医院【关键词】 子宫内膜癌 p16基因 蛋白表达 子宫内膜癌是女性生殖系统的三大恶性肿瘤之一,近年来发病率呈上升趋势,威胁着妇女的身心健康。p16 基因又称多肿瘤抑制基因, 直接作用于细胞周期, 抑制细胞分裂。研究表明, p16 基因缺失、突变和甲基化与肿瘤的发生、发展有着密切的关系,预示着p16 基因在肿瘤发生发展过程中有重要的作用。笔者采用RT-PCR及免疫组化技术,分别对52例子宫内膜癌组织中p16基因及蛋白的表达进行了检测,探讨其与子宫内膜癌的关系。1 资料与方法1.1 一般资料 收集2006年6月—2008年6月在我院及南通大学附属医院住院手术,术后病理证实为子宫内膜癌的标本52例。正常子宫内膜组织为全切除的良性子宫疾病，其中增生期内膜11例,分泌期内膜12例。切下的标本分两份，一份立即置液氮速冻后，保存于-80保存备用，另一份做常规病理及免疫组织化学检查。1.2 器材 TRIZOL及DEPC购自上海华舜生物工程有限公司。RT-PCR一步法试剂盒购自晶美生物工程公司，其中逆转录酶AMV RT、Taq酶及dNTP均为FINNZYMES公司产品。ABC试剂盒为美国Vector公司产品,p16 兔抗人多克隆抗体为Santa Cruz 公司产品。1.3 引物设计与合成 从GenBank查取基因序列，以Primer5软件设计p16及内参β-actin的引物各一对，其序列分别为，p16：上游5- TCTGAGAAACCTCGGGAAAC-3，下游5- CGCAAGAAATGCCCACAT -3;β-actin：上游5- AAGTACTCCGTGTGGATCGG -3，下游5- ATGCTATCACCTCCCCTGTG -3。扩增片段大小分别为307bp和495bp。上述引物均由上海生工生物技术服务有限公司合成。1.4 RT-PCR实验 常规TRIZOL法提取组织总 RNA后，每管加入10×Reaction Buffer 5μl，50mM/L MgCl2 1.5μl，10mM/L的dNTP 1μl，RNA抑制剂1μl，10pmol/L的上下游引物各1μl，5u/μl的逆转录酶1μl，1u/μl 的Taq酶2μl以及模板RNA 1μg，最终加DEPC水至50μl。每对引物PCR的反应条件均相同，即各扩增管先置于55水浴逆转录40min后，直接置PCR扩增仪94变性45s，54退火45s，72延伸60s，40个循环后，再72延伸5min。1.5 常规病理及免疫组化检查 标本经10% 福尔马林固定,常规石蜡包埋,5μm连续切片,HE染色和免疫组化ABC方法染色。免疫组化以出现明显的棕色显色为阳性结果判断标准，切片中阳性细胞无或少于癌细胞总数的5%为阴性，阳性细胞占癌细胞总数的5%以上为阳性。1.6 统计学处理 采用两样本构成比(率) 比较的χ2检验,当理论频数小于5时,以Fisher’s确切概率法比较两样本构成比。2 结果2.1 p16基因表达结果 p16及内参β-actin的RT-PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳后，其结果表明引物有较好的特异性，只有一条产物带，且其大小与预先设计的相一致，如图1。p16基因在52例癌组织中仅25例呈阳性表达，阳性率48.1%，而其在正常子宫内膜组织中均表达，两组间比较差异有显著性(P<0.01);而与正常子宫内膜组织中p16的表达差异同样有显著性，如表1。2.2 p16蛋白表达结果 23例正常子宫内膜组织标本中p16蛋白表达均呈阳性，阳性细胞分布较广，阳性染色表现为较为粗大的棕黄或棕褐色颗粒分布于胞浆中。而子宫内膜癌组织中p16阳性染色明显减弱，52例子宫内膜癌组织标本中,p16蛋白的阳性表达率为42.3%(22/52),低于正常子宫内膜组织的100%,差异有显著性(P<0.01)。 图1 p16 PCR产物电泳检测结果M：DNA marker，1：仅β-actin表达，2：p16表达表1 p16基因及蛋白在子宫内膜癌及正常组织中的表达注：与正常子宫内膜组织比，*P<0.013 讨论p16 基因是 1994 年 Kamb 等1分离鉴定的一种新型抑癌基因，为细胞周期依赖性激酶(CDK)抑制蛋白，因其对多种肿瘤有抑制作用而被命名为多肿瘤抑制基因。p16 基因定位于人染色体 9p21 区域, 全长 8.5kb, 由2个内含子及3个外显子构成, 编码表达一个148个氨基酸残基的蛋白质。其功能蛋白能特异地抑制 CDK4/CDK6 的活性, 间接阻断处于分裂周期的细胞从G1期向S期转变, 抑制细胞增殖。当p16基因突变或缺失可导致细胞分裂、增殖，而导致肿瘤的形成和发展，研究发现大多数肿瘤都有 p16 基因的缺失或突变 2,3，p16 基因及其产物在许多人类原发肿瘤和细胞株发生缺失, 并导致肿瘤细胞无限制生长。Reed 等4认为p16 蛋白的缺失为肿瘤的浸润和转移提供选择性的生长优势。本组资料显示23例正常子宫内膜组织,其p16 基因及蛋白表达均呈阳性反应,而子宫内膜癌p16表达发生缺失。采用RT-PCR方法对p16基因在子宫内膜癌组织中的表达进行检测结果显示，52例子宫内膜癌标本中有27例p16基因无表达，缺失率为51.9%，免疫组化结果显示，30例标本无免疫组化染色,即p16蛋白表达缺失，缺失率为57.7%，p16蛋白表达的阴性率稍高于p16基因表达的阴性率,提示可能存在p16基因转录后调节障碍,使p16基因不翻译而呈现出功能失活的效应。 对p16 与子宫内膜腺癌之间关系的深入研究，将对揭示子宫内膜腺癌的发生、发展规律有着重要意义，对指导子宫内膜腺癌诊断、预防及治疗有着重要的意义。【参考文献】1 Kamb A, Grusis NA, Weaver-Feldhaus J, et al. A cell cycle regularor potentially involved in genesis of many tumor types. Science, 1994, 264(5157):436-440.2 Tsiambas E, Karameris A, Gourgiotis S,et al. Simultaneous deregulation of p16 and cyclin D1 genes in pancreatic ductal adenocarcinoma: a combined immunohistochemistry and image analysis study based on tissue microarrays. J Buon，2007,12(2):261-267.3 Yoo J, Jung JH, Lee MA，et al. Immunohistochemical analysis of non-small cell lung cancer: correlation with clinical parameters and prognosis. J Korean Med Sci,2007,22(2):318-325.4 Reed JA, Loganzo F, Shea CR,et al. Loss of expression of the p16/cyclin-dependent kinase inhibitor 2 tumor suppre