（材料学专业论文）生物催化葡甘聚糖的可控降解反应和转酯化反应的研究.pdf

摘要 摘要 本研究利用生物催化法，对我国特有的植物可再生资源魔芋葡甘聚糖 ( k g m ) 进行可控降解反应和转酯化反应的研究，可望为制备具有独特的生物、 药理和表面活性的葡甘聚糖衍生物提供理论和实验依据，从而开辟天然合成高分 子改性和可再生资源利用的环境友好新途径。 通过测定来自诺卡氏菌形放线菌的b 甘露聚糖酶m a n n a n a s ei i 、来自黑曲霉 菌的d 葡聚糖酶f i n i z y m 以及和美酵素h e m i c e l l 在不同条件( p h 、温度) 的水介质 中的酶活力，确定它们的最适温度分别为7 0 、6 0 和5 0 。c ，最适p h 分别为8 0 、 5 0 和7 0 。综合考虑各种因素，确定在分别用这三种酶以及来自嗜碱芽孢杆菌的 b 甘露聚糖酶m a n n a n a s ei 作生物催化剂时，在反应温度为3 0 、反应介质为各 个酶的最适p h 、底物k g m 的浓度为1 0 的条件下实旌酶催化k g m 的降解反应。 在此反应条件下，比较分析了在不同酶的催化作用下，在6 0 m i n 反应时间内，k g m 降解反应体系的表观粘度和降解产物的特性粘数随反应时闯下降的情况。它们具 有相同的变化趋势：在反应的初始阶段( 0 一1 0 或2 0m i n ) ，k g m 降解反应体系 的表观粘度和降解产物的特性粘数快速下降；随着反应时间的延长，这种下降趋 于平缓。对这4 种酶催化的k g m 降解反应的机制和动力学的分析表明：h e m i c e l l 的催化效率高，在酶底物用量比低至0 6 0 9m g g ( 相当于0 0 4 9u g ) 的情况下， 也能够催化k g m 的降解反应，是这4 种可用于催化k g m 可控降解的酶之中较适 宜的生物催化剂。这一反应不仅具有很高的经济性，而且反应过程易于控制。 以乙酸乙烯酯为酰基供体，研究了在非水介质中的生物催化k g m 的酯合成反 应。在相对简单的含微水的有机溶剂中生物催化k g m 的转酯化反应时，尝试采用 不同的酶作为生物催化剂，通过对转酯化反应产物的取代度的测定，综合评价了 所用酶的催化能力。实验结果表明：所选用的5 种脂肪酶l i p o z y m t l1 0 0 l 、l i p a s e t y p ev i i 、n o v o z y m4 3 5 、l i p a z y m e t l i m 、l i p o z y m e r l v li m 和蛋白酶a l c a l a s e 都具 有一定的催化k g m 转酯化反应的能力；有机溶剂甲酰胺、丙酮和氯仿是进行生物 催化k g m 转酯化反应的较好的溶剂，可以用于进一步的研究中。 对甲酰胺有机溶剂体系中的酶催化k g m 转酯化反应的研究发现，将k g m 预 先溶于热的甲酰胺后，反应体系中存在着甲酰胺与k g m 以及酰基供体与k g m 之 间的竞争反应，反应产物为末端含一c h 0 基团的k g m 衍生物和k g m 脂肪酸酯的 混合物。底物k g m 的分子量对它的生物催化转酯化反应有影响。底物分子量较低 者，反应较易进行，转酯化反应产物的取代度比底物分子量高者要高出o 1 。 本研究还对含有疏水性离子对的异辛烷体系中的生物催化k g m 转酯化反应 进行了初步的探索。 华南理工大学硕士学位论文 关键词：葡甘聚糖；生物催化；酶：可控降解；转酯化反应 a b s t r a c t a b s t r a c t s t u d i e so nt h ec o n t r o l l a b l e d e g r a d a t i o na n dt h et r a n s e s t e r i f i c a t i o no fk o n j a c g l u c o m a r m a n ( k g m ) ，ar e n e w a b l er e s o u r c ef r o mp l a n tg r o w i n gi nc h i n a ，w e r em a d e b ym e a n so fb i o c a t a l y s i s i ti se x p e c t e dt ol a yas o l i dt h e o r e t i c a la n de x p e r i m e n t a l f o u n d a t i o nf o r p r e p a r i n g k g md e r i v a t i v e s p o s s e s s i n gu n i q u eb i o l o g i c a l ， p h a r m a c o l o g i c a la n d s u r f a c ea c t i v i t y , t h u so p e n i n gan e w e n v i r o n m e n t a l l yf r i e n d l yw a y t ot h em o d i f i c a t i o no f n a t u r a l s y n t h e t i cp o l y m e r sa n dt h eu t i l i t yo f r e n e w a b l e r e s o u r c e s t h e e n z y m ea c t i v i t y o fb m a n n a n a s ef r o m n o c a r d i o f o r ma n c t i n o m y c e t e s ( m a n n a n a s ei i ) ，b g l u c a n a s ef i n i z y ma n dac o m p o u n de n z y m eh e m i c e l lw e r e m e a s u r e du n d e rd i f f e r e n tc o n d i t i o n s0 h ，t e m p e r a t u r e ) t h er e s u l t ss h o wt h a tt h e o p t i m u mp h f o rm a n n a n a s e i i ，f i n i z y m a n dh e m i c e l la r e 8 0 ，5 0 a n d 7 0 ， r e s p e c t i v e l y , a n d t h eo p t i m u mr e a c t i o nt e m p e r a t u r ef o rt h e ma l e7 0 c 、6 0 。ca n d5 0 ，r e s p e c t i v e l y b a s e d o nc o m p r e h e n s i v e l y c o n s i d e r i n gv a r i o u sf a c t o r sc o n c e r n e d i t w a sd e c i d e dt h a tt h ed e g r a d a t i o no fk g m c a t a l y z e db yt h e s ee n z y m e sa n da n o t h e rb m a n n a n a s ef r o ma l k a l i p h i l i c b a c i l l u ss p ( m a r m a n a s e i ) w e r ec o n d u c t e di nt h e a q u e o u sm e d i u mw i t ht h eo p t i m u mp hf o re a c ho ft h eu s e de n z y m e s ，a n d1 0w t s u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o na t3 0 。c t h e c h a n g e si nt h ea p p a r e n tv i s c o s i t yo f t h er e a c t i o n s y s t e ma n d i nt h ei n t r i n s i c v i s c o s i t yo fd e g r a d e dk g ms a m p l e si nt h ec o u r s eo f r e a c t i o n ( 6 0m i n ) w e r ei n v e s t i g a t e d t h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t ss h o wt h a tt h ea p p a r e n t v i s c o s i t yo fr e a c t i o ns y s t e ma n dt h ei n t r i n s i cv i s c o s i t yo fd e g r a d e dk 、g ms a m p l e s d e c r e a s e sr a p i d l yi nt h ei n i t i a ls t a g eo ft h er e a c t i o n a n dt h e nl e v e l so 置a c c o r d i n gt o t h e a n a l y s i s o ft h em e c h a n i s ma n dk i n e t i c so fd e g r a d a t i o no fk g m c a t a l y z e db y d i f f e r e n t e n z y m e s ，i t i si n d i c a t e dt h a th e m i c e l l p o s s e s s e st h eh i g h e s ta c t i v i t yo f c a t a l y z i n gt h ed e g r a d a t i o no fk g m w h e n t h ee n z y m e s u b s t r a t er a t i oi sa sl o wa s 0 6 0 9m g g ( i e 0 0 4 9u g ) ，h e m i c e l li sa l s oa b l et oc a t a l y z et h ed e g r a d a t i o no f k g m t h ed e g r a d a t i o no fk g m c a t a l y z e db yh e m i c e l li sn o to n l ye c o n o m i c a l l yf a v o r a b l e ， b u ta l s oe a s i l yc o n t r o l l e d t h eb i o c a t a l y z e dt r a n s e s t e r i f i c a t i o no fk g mi nan o n - a q u e o u sm e d i u mw a s i n v e s t i g a t e du s i n gv i n y la c e t a t ea saa c y l a t i n gr e a g e n t t h ec a t a l y z i n ga c t i v i t i e so f d i f f e r e n te n z y m e sw e r ee s t i m a t e db ym e a s u r i n gt h ed s ( d e g r e eo f s u b s t i t u t i o n ) o f t h e t r a n s e s t e r i f i c a t i o np r o d u c t so fk g m c a t a l y z e du s i n gd i f f e r e n te n z y m e sa sab i o c a t a l y s t ， r e s p e c t i v e l y , w h i c hw a sc a r r i e d o u ti n r e l a t i v e l ys i m p l eo r g a n i cs o l v e n tc o n t a i n i n g m i c r ow a t e r t h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t ss h o w e dt h a tt h el i p a s e s ( l i p o z y mt l1 0 0 l ， i i i 华南理工大学硕士学位论文 l i p a s et y p e ，n o v o z y m4 3 5 ，l i p a z y m et li m ，l i p o z y m er mi m ) a n dp r o t e a s e a l c a l a s eu s e di nt h i ss t u d yp o s s e s st h ea c t i v i t yt oc a t a l y z et h et m n s e s t e r i f i c a t i o no f k g mt os o m ee x t e n t i n a d d i t i o n ，o r g a n i c s o l v e n t sf o r m a m i d e ，a c e t o n ea n d c h l o r o f o r ma l er e l a t i v e l yb e t t e rs o l v e n t sf o rt h eb i o c a t a l y z e dt r a n s e s t e r i f i c a t i o no f k g m t h e y c a r lb e u s e di nt h ef u r t h e rs t u d y t h e b i o c a t a l y z e dt r a n s e s s t e r i f i c a t i o no f k g mi nf o r m a m i d ew a sf u r t h e rs t u d i e d b y p r e - d i s s o l v i n gk g m i nh o tf o r m a m i d e i ti sf o u n dt h a tt h e r ea r et w oc o m p e t i t i v e r e a c t i o n si nt h ep r o c e s so fr e a c t i o n ，t h er e a c t i o no fk g m 埘t hf o r m a m i d e ，a n dt h e r e a c t i o no fk g mw i t ha na c y l a t i n gr e a g e n t ，t h u sm a k i n gt h et r a n s e s t e r i f i c a t i o np r o d u c t o fk g mc o n s i s to fam i x t u r eo fk g md e r i v a t i v ew i t h - - c h o g r o u pa n d t h ea l i p h a l i c e s t e ro fk g m t h em o l e c u l a rw e i g h to fas u b s t r a t ek g mh a sa ni n f l u e n c eo nt h e t r a n s e s t e r i f i c a t i o n t h ed so ft h et r a n s e s t e r i f i c a t i o n p r o d u c t i s h i g h e r f o rt h e s u b s t r a t ew i t hl o w e rm o l e c u l a rw e i g h tt h a nt h a tw i t hh i g h e rm o l e c u l a rw e i g h t a p r e l i m i n a r yi n v e s t i g a t i o nw a sm a d e i n t ot h eb i o c a t a l y z e dt r a n s e s t e r i f i c a t i o no f k g mi nh y d r o p h o b i c i o n p a i r e di s o o c t a n es y s t e m k e yw o r d s ：k o n j a cg l u e o m a n n a n ，b i o c a t a l y s i s ，e n z y m e ， c o n t r o l l a b l e d e g r a d a t i o n ，t r a n s e s t e r i f i c a t i o n 华南理工大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所 取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任 何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡 献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的 法律后果由本人承担。 作者签名：李瑗捧 日期：2 0 0 4 年6 月2 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意 学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文 被查阅和借阅。本人授权华南理工大学可以将本学位论文的全部或部分内 容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存 和汇编本学位论文。 保密口，在年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 不保密口。 ( 请在以上相应方框内打“4 ”) 作者签名：秀锵 导师签名：李拯皇 日期：2 0 0 4 年6 月2 日 日期：2 0 0 4 年6 月2 目 第一章绪论 第一章绪论 聚多糖是非常丰富的生物质资源，其中魔芋葡甘聚糖( k o n j a cg l u c o m a n n a n 简称k g m ) 是我国和一些东南亚国家所特有的来自植物魔芋的天然聚多糖。 魔芋( a m o r p h o p h a l l u sk o n j a c ) 是天南星科魔芋属多年生草本植物，在我国的 种植历史已达2 0 0 0 年之久。早在我国六朝时代的诗蜀都赋的注释中，就已经 有了关于魔芋的描述和记载：“药翦，其根白，以灰汁煮即成冻，以苦酒淹食， 蜀人珍之”。一直以来，在我国和日本民间，魔芋主要用作食品和食品添加剂。另 外，它还具有一定的药用价值。除了史书记载的可治疗肿痛、咳嗽、解毒等功能 外，还能降低人体中血糖肝糖含量，调节脂肪代谢，具有减肥和抗肿瘤等作用。 随着对k g m 及其产品研究和应用的深入，发现k g m 及其衍生物具有许多 独特的理化性质和生理活性，在医药和预防医学、化工、纺织、石油钻探等领域 中都有很高的应用价值。另外，构成k g m 的单体单元葡萄糖和甘露糖上的羟基 都能够参与多种化学反应，如酯化、醚化、氧化以及交联等反应，得到的k g m 衍生物能够具有许多新的功能，如表面活性、螯合性及生物活性等，从而能大大 地开拓k g m 的应用领域。 酶作为化学反应的催化剂，具有许多化学催化剂所不具备的优点，多年来一 直受到科学工作者的广泛关注。尤其是在1 9 8 4 年以来，美国麻省理工学院的科学 家k l i b a n o v 等的一系列的关于酶在非水介质中具有催化活性的发现和总结t 2 ，3 1 ，为 酶学研究和应用带来了又一次革命性飞跃，使非水介质中的酶催化反应成为生物 化学和有机合成研究中一个迅速发展的领域。 在这一章中，拟对本工作所研究的对象k g m 的结构和理化性质、k g m 衍生 物的制备与应用前景、非水介质中的酶催化反应以及相关的国内外研究现状进行 综述，从而阐明本工作的研究背景与意义。 1 1 葡甘聚糖 与大多数来自植物的天然聚多糖一样，精制的k g m 呈白色粉末状，一般溶 于水，不溶于甲醇、乙醇、丙酮、乙醚等有机溶剂。利用这一性质可以制备k g m 精粉。一些学者对k g m 这一天然聚多糖的大分子结构、形态以及物理化学性质 进行了研究。以下将对这些结果作简要的介绍。 1 1 1 葡甘聚糖的大分子结构与形态 魔芋的主要成份是葡萄糖甘露聚糖，简称葡甘聚糖，在干魔芋块茎中的含量 华南理工大学硕士学位论文 高达6 0 8 0 f 4 。作为一种高分子量的水溶性非离子天然聚合物，葡甘聚糖的平 均分子量因产地、品种、加工方法以及原料储存时间的不同而不同，一般可达到 1 0 0 数量级。已有研究表明，k g m 是由d 葡萄糖( g ) 和阻甘露糖( m ) 按l ：1 6 或1 ：1 ，6 9 的摩尔比通过b 一1 ，4 一吡哺糖苷键结合而成的复合多糖【5 4 】。在其主链上甘露糖 的c 3 位鬣上往往存在着通过b l ，3 糖苷键结合的支链结构。此外，在k g m 大 分子链上约每6 2 0 个糖单元上有1 个乙酰基存在【6 ，8 1 。k g m 的结构如图1 1 所示。 mg 毋雀扒羚 gmg 图卜lk g m 的大分子结构 f i g u r ei - 1 t h em a c r o m o l e e u l a rs t m c t i l r eo f k g m k g m 含有大量羟基，会由于氢键的作用而产生结晶结构。它的结晶形态具有 甘露糖i 和甘露糖i i 两种结晶变体。天然的k g m 多为甘露糖i 型，也即脱水多晶 型，晶体中不存在水分子；经过碱处理的k g m 多为甘露糖i i 型，也即水合多晶型， 晶体中结合有水分子1 9 】。也有研究表明，高分子量的k g m 多以甘露糖i i 形态存在， 而低分子量的k g m 则多以甘露糖i 形态存在【l0 1 。这些结晶变体的形成和结构取决 于k g m 的大分子结构和制备条件( 温和、介质极性等) 。即使化学成分相同，不 同的聚集态结构也会对k g m 的性质产生不同的影响。 1 1 2 葡甘聚糖的理化性质 1 1 2 1 葡甘聚糖的溶液性质 k g m 的水溶液通常具有较高的粘度，并随着浓度的增加而升高。当k g m 水 溶液浓度高于7 、v t 时会形成液晶但其粘度并不会因此而降低。这可能是由于 k g m 溶液的凝胶化作用优于液晶相的形成，从而限制了有序结构的发展。同时， 在k g m 一水体系可观察到明显的剪切变稀现象。随着k g m 浓度的增加，特别是 当浓度高于7 ( w w ) 时，粘度对剪切速率的依赖性降低1 。 分子量高、水合能力强和不带电荷等特性决定了k o m 具有优良的增稠性能。 1 的k g m 水溶液的粘度可达到数十2 0 0p a s 。k g m 与常用的增稠剂黄原胶、 2 第一章绪论 瓜尔豆胶及海藻酸钠均可形成协同增稠效应，其中以黄原胶与k g m 之间的协同增 稠作用最为显著【】。同时，k g m 具有独特的凝胶性，在一定条件下可以形成热可 逆( 热不稳定) 凝胶和热不可逆( 热稳定) 凝胶。k g m 能与黄原胶、卡拉胶【1 5 】 等通过较强的协同作用而形成热可逆凝胶。少量的卡拉胶与k g m 复配即可得到高 强度的凝胶。这种热可逆凝胶，加热成为液体，冷至室温成为凝胶。用这种复配 胶液涂制成的凝胶薄膜性能十分理想i l “。另外，以k g m 为原料，添加5 1 0 的 增塑剂( 甘油或山梨糖醇) 、3 5 的补强剂( 海藻酸钠或明胶) 在微量碱的存 在下混炼制成粘稠状溶液后可流延成膜。这是一种可食性膜，且具有良好的耐水 性、耐热性、可生物降解性，以及较高的拉伸强度、断裂伸长率、耐折度和透明 度”19 1 。 1 1 2 2 葡甘聚糖的化学反应以及反应产物的特性和用途 葡甘聚糖在酸或p 甘露聚糖酶的催化作用下，连接糖单元的p 1 ，4 糖萤键会 发生断裂，从而使k g m 分子量降低。通过控制反应条件，可得到具有较低溶液粘 度的低分子量k g m ，或得到具有某种生物活性的寡糖。研究【2 0 】发现，无论是在酸 降解还是在酶促降解过程中，连接不同糖单元的糖苷键的断裂速率是不同的。这 造成了在k g m 降解反应初期，大量存在的较弱的b 一1 ，4 糖苷键迅速被切断，k g m 分子量下降速度较快；随着降解反应的进行，较易断裂的部位减少，k g m 分子量 的降低速度减慢，趋于平缓。 k g m 因分子链上大量存在的羟基使之可被视为一种多元醇而能参与多种化 学反应，如酯化、醚化、甲基化、羧甲基化、氧化、接枝和交联等反应。 k g m 能与各种无机酸或脂肪酸发生酯化反应。当以马来酸酐1 2 。2 2 1 、没食子酸 阻2 4 1 、磷酸氢二钠磷酸二氢钠2 5 1 以及三聚磷酸钠阻2 4 , 2 5 1 等作为酰基供体时，得 到的k g m 衍生物水溶液的粘度、稳定性、成膜性都较改性前的k g m 都有了很大 的改善。用长链脂肪酸如棕榈酸、月桂酸、辛酸和油酸作为酰基供体时，可得到 相应的k g m 脂肪酸酯衍生物。实验证明，在水包油乳液体系中。取代度在一定范 围内的葡甘聚糖长链脂肪酸酯显示出较好的乳化能力即使在高盐浓度和酸性情 况下，仍然具有好的乳化效果，可望用做可生物降解的高分子表面活性剂【”，”1 。 将k g m 经过一系列的处理，再与甲酰胺一氯磺酸磺化剂反应，可制备出低 聚k g m 硫酸酯类的衍生物。红外光谱和h 核磁共振光谱显示，这一衍生物具有 类肝素的结构，可望作为预防或治疗心脑血管疾病药物和有效成分而得到应用【2 8 ， 2 9 1 。 k g m 的酯化产物可根据其结构的不同而具有不同的物化性质和生物活性，能 被用作可生物降解的绿色化学品( 如：表面活性剂、抗菌试剂、絮凝剂、吸水剂、 重金属螯合物等) ，以及具有生物相容性或生理活性的外科敷料、药物缓释剂、固 定化酶载体、体内糖和胆固醇吸附剂等。特别是在人类健康f | 益受到重视的今天， 华南理工人学硕士学位论文 k g m 衍生物无疑在作为预防或治疗心脑血管疾病、糖尿病和增强免疫功能的临床 新药的应用方面具有极大的吸引力和研究价值。 以乙醇水溶液为介质，通过二步醚化法对k g m 分子中的羟基进行醚化制得 的k g m 醚化产物可用作印染工业中的印花糊料，其抱水性、成糊率、稳定性、印 染粘度指数、与化学物质的相容性以及粘度随浓度的变化规律等性能指标均与目 前最好的印花糊料海藻酸钠接近，可望取代资源日益萎缩的海藻酸钠用于印染工 业【3 0 1 。 用硫酸二甲酯与k g m 反应，可得到k g m 的甲基化衍生物。取代度在o 3 1 4 之间时，甲基化k g m 可溶于水，溶液均匀、粘度高且透明；当取代度为o 4 5 时， 甲基化k g m 的溶剂化作用最强，溶液的稳定性最好，其粘度在3 0 c 下可保持4 天而不改变3 ”。早期的研究者利用取代度为o 4 5 的甲基化k g m 的水溶液，研究 了【j 7 】与 缸的关系，得到了以下的关系式1 3 2 】： b 】一6 3 7 1 0 m 。o 7 4 ( 1 1 ) 我们的前期工作【33 j 则研究了o 0 5g d lk g m 溶液的 叮】与的关系，得到公式： m = 5 0 6 x 1 0 。m ，“7 5 4 ( 1 - 2 ) 这两个公式均符合聚合物的分子量与特性粘度的关系式r = k m 。，二者的口 值比较接近。 在乙醇溶液中，将k g m 与氯乙酸和氢氧化钠反应可得到羧甲基葡甘聚糖，其 水溶液具有高透明度。另外，先将k g m 悬浮在二甲基甲酰胺中2 4 小时，再悬浮 于6 0 氢氧化钠溶液中3 0 分钟后，将沉淀物过滤、压榨，随后置于氯乙酸一异 丙醇中于s 0 c 下搅拌反应3 小时后也可以得到羧甲基化葡甘聚糖。将羧甲基葡甘 聚糖用于果蔬涂膜保鲜已取得了良好的效果f 3 ”。 通过氧化制得的双羧基k g m 不仅具有很好的水溶性和生物可降解性，还具有 明显的免疫激励能力【3 ”，可望用于临床医学领域，为那些免疫能力低下的患者带 来福音。 对k g m 进行适当的接枝和交联，可制得具有良好的强度和力学性能，以及不 同粒度和膨胀度的珠状交联k g m ，并可用作凝胶过滤介质1 3 6 】。 综上所述，以我国特有的天然聚多糖k g m 为研究对象，可望制各出具有不 同性能用途的绿色化学品，这对于拓宽可再生资源的应用有着积极的意义。 1 1 3k g m 衍生物的制备方法 利用前面所述的葡甘聚糖的化学反应，可以制各出各种具有不同特性和用途 的葡甘聚糖衍生物。就葡甘聚糖衍生物的制备途径而言，根耀已发表的文献，均 4 第一章绪论 为传统的化学法制备。 由于聚多糖的大分子上含有许多可参与反应的羟基，通过传统的化学方法制 备聚多糖衍生物时，产物往往存在着多种可能的结构。为了得到具有稳定结构的 聚多糖改性产物，通常需要进行选择性的保护和解保护反应，此繁复的化学反应 步骤将阻碍其工业应用【37 1 。此外，用传统的化学改性法制备聚多糖衍生物时，往 往不得不消耗大量的能量以及比实际需要多得多的反应试剂和溶剂。这些不仅会 增加产品提纯的难度，而且可能引起健康和环境安全方面的忧虑。如果利用在小 分子化合物合成与转化中应用得日趋成熟的具有高效、高选择性和反应条件温和 等优点的生物催化法( 或称生物法) 制备聚多糖衍生物，则有可能弥补传统的化 学改性法固有的致命弱点，最大限度地抑制副反应的发生，较好地控制产物结构。 为了探索用生物催化法制备葡甘聚糖衍生物的可能性，有必要对可望用于制 备聚多糖的酯化衍生物的非水介质中的酶催化反应的特点、对酶活力、反应的选 择性、稳定性的影响及有机溶剂中酶催化活性和选择性的调控进行文献归纳及分 析。 1 1 4 国内外研究现状 由于k g m 资源的地域特性，国外以日本学者的研究较系统深入。日本学者早 在2 0 世纪4 0 5 0 年代，就开始对k g m 进行系统的理论和应用研究，开发出了一系 列保健品和其它可用于医疗、化工等行业的产品。目前，日本对k g m 及其衍生物 的开发已经进入了多学科、多行业与多种技术复合的研究阶段。此外，一些发达 国家的预防医学科学工作者对k g m 及其衍生物在预防心脑血管疾病以及糖尿病、 胆结石、十二指肠溃疡、肿瘤、肥胖症等疾病中的功能和机理进行了富有成效的 研究，肯定了k g m 及其衍生物的药用价值，展示了它们在医药( 如：用于帮助大 都市日益增加的高胆固醇、高血压、高血糖病入的治疗和康复) 方面颇具吸引力 的应用前景。 我国对k g m 的研究仅有1 0 余年历史。所涉及的研究领域与国外学者相似， 主要集中在k g m 的提取、结构分析与表征、食品学性质( 如流变性、增稠性、胶 凝性、成膜性等) 、物化性质( 包括溶液性质、凝胶行为、液晶行为等) 、作为食 品的加工方法、保健功能与药用价值、化学改性等方面。所开发的产品不多，档 次不高，主要用作食品添加剂，并以原料出口，附加值低。近年来，随着政府、 工业界和研究者对可再生资源的开发和利用目益重视，对k g m 的研究也日趋活 跃。其中，中科院成都生物所、华中农业大学、华南农业大学等单位都对k g m 进 行了研究。近年来，武汉大学的田炳寿等对k g m 的长链脂肪酸酯的常规化学法制 备以及产物的乳化性能进行了探讨1 2 “2 7 1 ，何东保等研究了k g m 与黄原胶的协同作 用及凝胶化性质3 8 1 ，张俐娜等则对k g m 与其它天然高分子的复配膜的性质和应 5 华南理工大学硕士学位论文 用进行了较为深入的研究 3 9 - 4 lj ；张迎庆、干信等用常规的化学法制备了k g m 低聚 糖的硫酸酯化衍生物f 2 8 卿。然而，无论是国内还是国外，都还未见到涉及生物催 化k g m 的改性反应的报道。 1 2 非水介质中的酶催化反应 从传统概念上讲，生物催化荆，包括酶、微生物细胞 4 2 】、动物细胞、植物细 胞及一些细胞器均是在水溶液环境中催化水溶性底物的转化。1 9 8 4 年，美国麻省 理工学院的科学家k l i b a n o v l 2 1 成功地实现了猪胰脂肪酶在9 9 的有机溶剂中催化 三丁酸甘油酯与醇之间的转酯化反应，并证实了酶在1 0 0 高温下，不仅能够在 有机溶剂中保持稳定，而且还显示出很高的催化转酯化反应的活力。k l i b a n o v 还 在s e i e n e e j = 发表的综述f 3 1 中明确指出，只要条件合适，酶可以在非生物体系的疏 水介质中催化天然或非天然的疏水性底物和产物的转化；酶不仅可以在水与有机 溶剂互溶体系，也可以在水与有机溶剂组成的双液相体系，甚至在仅含微量水或 几乎无水的有机溶剂中表现出催化活性。k l i b a n o v 的这一系列发现和总结为酶学 研究和应用带来了又一次革命性飞跃，并成为生物化学和有机合成研究中个迅 速发展的领域。 在随后的二十年中，酶在非水介质中催化反应的研究十分活跃。它们主要集 中在三个方面【4 3 】：第一，非水酶学基本理论的研究，它包括影响非水介质中酶催 化的主要因素以及非水介质中酶学性质；第二，通过对酶在非水介质中结构与功 能的研究，阐明非水介质中酶的催化机制。建立和完善非水酶学的基本理论；第 三，利用上述理论来指导非水介质中酶催化反应的应用。 1 2 1 非水介质酶催化反应的特征 2 0 多年来，关于有机相酶催化反应在生物工程领域的研究表明，在有机介质 中酶催化反应可以获得许多常规条件下所不具有的新特征和优势： 1 可进行水不溶性化合物酶催化转化，从而大大拓宽了使酶作用底物的范围： 2 ，改变反应的平衡点，使水溶液中不能发生的反应向所期望的方向进行，催化 水解反应的酶可催化合成反应的进行，如转酯、酯化、肽合成、氨解、酰基 交换和转硫酯等； 3 由于酶在有机溶剂中结构上“刚性”的增加，对底物的专一性，包括区域专 一性和对映体专一性均大大提高，从而使实现对酶催化选择性的有目的调控 成为可能： 4 酶的热稳定性大大提高： 5 由于酶不溶于大多数有机溶剂，反应后易于回收和重复利用； 6 第一章绪论 6 可避免长期反应中微生物的污染； 7 减少或防止由水引起的副反应； 8 可方便地利用对水分敏感的底物进行反应，如酸酐； 9 当使用挥发性溶剂作介质时，反应后的分离过程能耗降低。 正是有机介质中酶催化反应的这些特征和优势，使该领域在近2 0 年中一直是 有机化学和生物化学的研究重点，相关的文献也呈现爆炸性的增长。 有机相中酶催化反应的特征和优势，归根结底，是与非水介质中酶的结构与 性质与水介质中不同而引起的。 1 2 2 非水介质中酶的形态结构与性质 1 2 2 1非水介质中酶的形态和结构 酶溶于水而几乎不溶于有机溶剂，在有机溶剂中酶呈悬浮状态，反应所使用 的酶量不宜过多，否则酶容易形成聚集体。酶与底物的接触受到扩散速度的影响， 理论上质量传递会影响有机溶剂中酶的催化活性，消除这种不利因素的方法是强 化搅拌和使酶颗粒的直径尽可能小。反应过程中采用超声波处理反应体系会使酶 分散更好，从而增加酶反应速度【4 ”。另一影响酶与底物接触的因素是立体障碍， 由于冻干酶颗粒的一些活性中心被相邻的酶分子掩盖不能与底物接触，阻止酶分 子起催化作用，从而降低了酶的催化活性。固定化酶、交联酶晶体和反胶束酶等 不同形态，可以改善酶的分散性，减少扩散限制，有利于底物与酶的活性中心结 合从而加快催化反应速度。另外，为了使酶能在均相体系中反应，可以对酶进行 修饰以提高它在亲脂性有机溶剂中的溶解度，如水溶性大分子( p e g ) 共价修饰 酶和非共价修饰的高分子一酶复合物、表面活性剂一酶复合物以及微乳液中的酶 等。 按照热力学原理预测，球状蛋白质的构象在水溶液中是稳定的，在疏水环境 中是不稳定的。但是，近年来大量实验结果表明，酶悬浮于苯、环己烷等疏水性 有机溶剂中不变性，而且还能表现出催化活性。许多学者【4 5 4 6 j 对酶在水相与有机 相的结构进行了比较，实验证实了在有机相中酶能够保持其整体结构的完整性， 有机溶剂中酶的结构至少是酶活性部位的结构与水溶液中的结构是相同的。另外， 晶体结构实验数据也证实了在有机溶剂中酶蛋白能够保持三维结构和活性中心的 完整。这正是非水介质中酶的催化作用得以体现的重要原因之一【4 ”。 1 2 2 2 非水介质中酶学性质 虽然酶在有机溶剂中能够保持其整体结构及活性中心结构的完整，有机溶剂 在很大程度上也会影响酶的稳定性和酶的底物特异性。由于有机溶剂的存在，改 变了疏水相互作用的平衡，从而影响到酶的结合部位。另一方面，有机溶剂也会 7 华南理工大学硕士学能论文 改变底物存在状态。因此，酶和底物相结合的自由能就会受到影响，而这些至少 会部分地影响到有机溶剂中酶的稳定性、底物特异性、立体选择性、区域选择性 和化学选择性等酶学性质。 1 热力学稳定性 有机溶剂中酶的热稳定性和储存稳定性都比水溶液中高。k i b a n o v 和 v o l k l i n t 4 s l 认为有机溶剂中酶的热稳定性比水溶液中高的原因是由于在有机溶剂中 缺少使酶热失活的水分子，因此由水引起的酶分子中天冬酰胺、谷氨酰胺的脱氨 基作用，天冬氨酸肽键的水解，二硫键的破坏，半胱氨酸的氧化及脯氨酸和甘氨 酸的异构化等使蛋白质热失活的全过程难以进行。 2 底物特异性 和水溶液中的酶催化一样，酶在有机溶剂中对底物的化学结构和立体结构均 有严格的选择性。但是，由于酶与底物的结合能取决于酶与底物复合物的结合能 和酶、底物及溶齐q 相互作用能的差值，因此酶与底物的结合受到溶剂的影响。当 介质改变时，酶的底物专一性和催化效率会发生改变。另一方面，底物在反应介 质与酶活性中心之间分配的变化也是影响酶的底物专一性及其催化效率的因素之 一，而底物与介质的疏水性直接影响底物在两者之间的分配。 3 对映俸选择性 酶的对映体选择性是指酶识别外消旋化合物中某种构象对映体的能力，这种 选择性是由两种对映体的非对映异构体的自由能差别造成的。有机溶剂中酶对底 物的对映体选择性由于介质的亲( 疏) 水性的变化而发生改变。许多实验如1 表 明，疏水性强的有机溶剂中酶的立体选择性差。某些作者f 5 1 认为这是由于底物的 两种对映体把水分子从酶分子的疏水结合位点置换出来的能力不同。反应介质的 疏水性增大时，l 型底物置换水的过程在热力学上变得不利，使其反应活性降低 很多：而d 型异构体以不同的方式与酶活性中心结合这种结合方式只置换出少 量的水分子，当介质的疏水性增加时，其反应活性降低得不多，因此总的结果是 酶的立体选择性随介质疏水性增加而降低。 4 。位置选择性 有机溶剂中的酶催化还具有位置选择性，即酶能够选择性地催化底物中某个 区域的基团发生反应。目前对于酶在非水介质中的位置选择性研究得比较少。 k i i b a l l o v 【5 列用猪胰脂肪酶在无水吡啶中催化各种脂肪酸的三氯乙酯与单糖的酯交 换反应，实现了葡萄糖1 位羟基的选择性酰化。当不同来源的脂肪酶催化上述反 应时，选择性酰化羟基的位置不同。 5 化学键选择性 化学键的选择性也是非水介质中酶催化的一个显著特点。a s p e r g i l l u sn i n g e r 脂肪酶催化6 一氨基一1 一己醇的酰化反应时，羟基的酰化占绝对优势，这种选择 8 第一章绪论 性与传统的化学催化完全相反，这样就可以在不需基团保护的情况下合成氨基醇 的酯i ”】。为了实现对酶一底物复合物中间体的进攻，亲核基团应该不易形成氢键。 羟基基团易于形成氢键，因此不利于亲核进攻；氨基不易形成氢键，有利于亲核 进攻，则可以进行催化反应。 6 p h 记忆与p h 忘记 有机溶剂中的酶能够“记忆”它冷冻干燥或丙酮沉淀前所在缓冲溶液中的p h 。 z , a k s 等( 2 1 称这种现象为“p h 记忆”。他们认为在缓冲溶液中酶的解离状态取决于 环境因素，而在有机溶剂中不存在发生质子或去质子化的条件，当酶分子从水溶 液转移到有机溶剂中时，它保持了原有的离子化状态，环境因素不能改变酶的这 种解离状态，或者说酶在缓冲液中所处的p h 状态仍被保持在有机溶剂中。利用 酶的这种p h 记忆特性可以控制有机相中酶催化的最适p h 。 b l a c k w o o d s 4 在研究有机溶剂中酶的解离状态时，发现在微水有机溶剂中疏水 性的酸或碱与它们相应的盐所组成的混合物，可以作为有机相缓冲液，它们以中 性和离子对形式能够充分溶于有机相，而不能进入水或其它极性溶液，这两种存 在形式的比例控制着有机相中酶的解离状态，使酶完全忘记干燥前它所处的水溶 液的p h ，这就是酶的“p h 忘记”现象，它使得干燥前缓冲液的p h 值对微水有机 溶剂中酶活力几乎没有什么影响。 1 2 3 非水相酶催化体系中的水 酶催化反应是在环绕着酶分子表面的水层内进行的。所谓非水体系并不是绝 对无水的，而是一种含有微量水的有机溶剂体系( 通常，水含量 l = 。在这 种体系中，宏观上是有机溶剂，微观上是水体系。酶催化反应时，底物分子须先 从有机相进入水相，然后才能与酶形成底物一酶复合物，继而发生反应。酶蛋白 质分子表面含有大量带电基团和极性基团，在绝对无水条件下，这些带电基团因 相互作用而形成“锁定”的失活构象。加入适量水充当润滑剂可使酶的柔性增大， 维持酶的活性。生物反应体系中的水绝大多数( 9 8 ) 是作为真正的溶剂水( b u l k w a t e r ) ，而少部分的水紧密结合在酶分子的表面，并被称为结合水( b o u n dw a t e r ) 。 结合水的物理性质如熔点、热容