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光散射技术在蛋白质分析与纳米微粒表征中 的应用 分析化学专业硕士研究生张莉 指导教师黄承志教授 摘要 经过十多年的发展，共振光散射( r e s o n a n c el i g h ts c a t t e r i n g , e 【l s ) 技术已发展成为强有力的 分析和研究手段。但目前的研究主要集中于单波长测定的共振光散射光谱研究，与其它基于 本体溶液反映体系的光谱法一样存在干扰因素复杂，重现性差等缺点。因此发展新的r l s 方 法以及拓宽r l s 技术的应用范围具有重要的意义。本文主要进行了两方面的研究：在研究普 通共振光散射技术的分析应用基础上建立了散射，荧光比率分析法；光散射技术在碳纳米管研 究中的应用，具体研究内容如下： 一、共振光散射技术在酪氨酸分析中的应用及散射荧光比率分析法的建立： 1 基f 酪氨酸( t y r ) 与硝酸银之间的选择性作用，以银纳米粒子( a g n p s ) 为灵敏r l $ 探针， 建立了实际样品中t y r 定量检测的新方法，并进一步讨论了二者的反应机理以及实验条件的改 变对a g n p s 形成过程的影响。 氢氧化钠浓度为2 0 1 0 m o l f l ，t y r 分子中的酚羟基能够与硝酸银发生氧化还原反应， 在3 2 0 0 啪5 0 0 0 n m 范围内可以观察到强烈增强的r l s 信号。其最大散射峰位于3 8 2 0 n m 。 在此波长下，增强的共振光散射强度( 趣l s ) 与一定t y r 浓度具有线性关系。据此建立了痕量 t y r 的共振光散射分析方法。当硝酸银的浓度为2 0 1 0 4m o l l ，线性范围0 8 1 2 0g m o f l ， 检出限2 1 1 0 7m o l l ，将方法用于实际样品测定，结果灵敏可靠。 2 利用r l s 技术灵敏度高和荧光分析法选择性较好的特点，以常见的有机染料曙红 y ( e o s i ny ，e o 与生物大分子h s a 作用体系为例，建立了共振光散射和荧光比率分析法，并通 过化学反虑动力学和热力学相关常数的计算，讨论了体系中散射颗粒动态变化对体系总体表 观r l s 强度的影响。 两南大学硕士学位论文摘要 p h2 3 0 时，有机荧光小分子e y 与人血清白蛋白( i - t s a ) 通过作用导致e y 自身在3 0 2 0a m 处的r l s 信号的显著增强，5 4 4 0n n 处的荧光强度减弱。同时这两波k 处信号强度的比值 伍0 2o 一毋“o 。) 与一定浓度的h s a 具有线性关系。据此建立了在较宽的动态范围内测定痕量 h s a 的散射荧光比率法( l i g h ts c a t t e r i n g f l u o r e s c e n c er a t i o m e t r y , l s f l ) 。当e y 浓度同定在1 0 i 矿m o l l ，可以检测到o o i 4 8 0m g l 范围内含量的h s a ，检出限为o 5 0 峙，l ，相应的结 合常数为1 4 3 l 旷l m o l 、结合位点数为i 0 2 。热力学参数证明二者之间同时存在着静电作 用和疏水作用，导致了e y 在h s a 分子上的聚集从而使r l s 信号增强，而自身荧光淬灭。结 果表明散射成光比率法与传统的单波长r l s 法相比，具有更强的抗外界干扰能力。方法用 于测定人血清实际样品所的结果与考马斯亮蓝染色法( c b bg - 2 5 0 ) - - 致。 二，初步试验了碳纳米管在对苯二胺中的分散程度，并研究了银纳米微粒在碳纳米管表 面的生长情况，得到最佳条件下复合微粒的共振光散射、荧光以及吸收强度。实验发现，溶 液的酸度与形成复合微粒的粒子大小和数目有密切关系，而碳纳米管微粒的多少对复合物的 形成影响不大本工作表明，碳纳米管作为共振光散射技术的研究对象，开辟了其新的应用 范围。对于微粒生长和聚集状态的研究，r l s 技术仍不失为较好的分析手段。 i 研究对苯二胺( p p d ) 与单壁碳纳米管( s w c n t s ) 和多壁碳纳米管( m w c n t s ) 的作用过 程。通过对反应体系吸收光谱、r l s 光谱和荧光光谱以及粒度等多种表征手段的初步分析， 发现碳纳米管能够与芳香胺类试剂形成强的相互作用，并进一步提出它们相互反应机理。 2 研究羧基修饰的碳纳米管与银纳米粒子的相互作用和以m w c n t s 为模板的 a g - m w c n t s 纳米复合微粒( a g m t n p s ) 的生长情况。多壁碳纳米管经化学修饰后通过静电引 力吸附银纳米粒子使本体溶液的荧光、吸收以及散射信号显著增强，说明二者结合生成了金 属复合微粒。这对于金属基纳米复合材料以及纳米改性剂的深入研究具有深刻的意义。 关键词：共振光散射技术散射荧光比率法人血清白蛋白银纳米粒子碳纳米 管 i i 西南大学硕士学位论文a b s t r a c t a p p l i c a t i o na n da n a l y s i so fl i g h tsc a t t e r i n g t e c h n i q u e i np r o t e i na n d n a n o p a r t i c l e s a n a l y t i c a lc h e m i s t r ym a j o rp o s t g r a d u a t el iz h a n g s u p e r v i s o rp r o f e s s o rc h e n gz h ih u a n g a b s t r a c t l i g h ts c a t t e r i n gh a sb e e na p p l i e dw i d e l yt om a c r o m o l e c u l ep o l y m e rs c i e n c e s ，c o l l o i ds c i e n c e s , a n dl i f es c i e n c e sr e s e a r c hf i e l d s o v e rt e ny e a r so fd e v e l o p m e n t , r c s o u a u c el i g h ts c a t t e r i n g ( r l s ) h a sb e c o m eap o w e r f u la n dr o u t i n ea s s a y , w h i c hh a do f t e nb e e ne l i m i n a t e di na n a l y s i sa sak i n do f d i s t u r b e r h o w e v e r , a st h es a m ea so t h e rs p e c t r a lt e c h n i q u e i th a sb e e ne x i s t e ds o m ed i s a d v a n t a g ei n a q u e o u ss o l u t i o n , s u c ha si n t r i c a t ei n t e r f e r e n c e s ，p o o rr e p r o d u c i b i l i t y t oo v e r c o m et h e s ed m w b a c l 烙， w ed e v e l o pl i g h ts c a t t e r i n g f l u o r e s c e n c er a t i o m e t r y ( l s f l ) t oe x t e n dt h ea p p l i c a t i o ns c o p eo f r l s t e c h n i q u e ；i tw o u l du n d o u b t e d l ye n h a n c et h ep e r f o r m a n c eo fr l st e c h n i q u ei nt h ea f o r e m e n t i o n e d l i m i t a t i o n s t h em a i n l yc o n t e n to f t h i sc o n t r i b u t i o na r ea sf o l l o w s ： i r l st e c h n i q u ea p p l i e dt ot h ed e t e c t i o no f t y r o s i n ea n dt h ee s t a b l i s h m e n to f l s f l ： ( 1 ) b a s e do nt h e s e l e c t i v er e a c t i o nb e t w e e nt y r o s i n ea n ds i l v e rn i t r a t e ，an e wa n a l y s i sm e t h o do f t y r o s i n e i nc l i n i ci n j e c t i o n u s i n gs i l v e rn a n o p a r t i c l e s ( a g n p s ) 鹅r l sp r o b e t h er e a c t i o n m e c h a n i s ma n de f f e c to f c o n d i t i o no na g n p sa r ea l s oc o n s i d e r e d a tt h ep r e s e n to f 2 0 x1 0 m o l ls o d i u mh y d r o x i d e 。t h ep h e n o l i ch y d r o x i d ee x i s t e di nt y r o s i n e c o u l dd e o x i d i z es i l v e ri o n ，a n dm a k ei tt u mi n t oa g n p s a l lo f t h e s ei n d u c es i g n i f i c a n t l ye n h a n c e d r l ss i g n a l so v e rt h er a n g eo f3 2 0 0n n l - 5 0 0 0m nw i t ht h em a x i m u mp e a l 【l o c a t e da t3 8 2 0n m l i n e a rr e l a t i o n s h i p sa r ea c h i e v e db e t w e e nt h ee n h a n c e dr l si n t e n s i t y ( 觚l s ) a t3 8 2 0n ma n d t y r o s i n ec o n c e n t r a t i o ni nt h er a n g eo f0 8 1 2 0p m o l lw h e n2 0 1 0 4m o l f lo fs i l v e rn i t r a t ei s e m p l o y e d t h e3 0l i m i to fd e t e c t i o ni s2 1 1 0 “t o o l l ；t h es y n t h e t i cs a m p l e sa n dc o m m e r c i a l c o m b i n a t i o na m i n o p h e n o li n j e e t i o ni sa n a l y z e ds a t i s f a c t o r i l y 1 l i 西南大学硕十学何论文 a b s t r a c t ( 2 ) o na c c o u n to f t h ea g g r e g a t i o no f o r g a n i cd y ee y a n dh i g hs e n s i t i v i t yo f r l s t e c h n i q u e , w e d e a lw i t ht h el s f la n a l y t i c a lt e c h n i q u e ，b a s e do nt h er e a c t i o nb e t w e e ne ya n dh s a t h ek i n e t i c a n dt h e r m o d y n a m i cc o n s t a n t sa r ec a l c u l a t e dt o k e no fc h e m i c a lr e a c t i o n ，a n dt h e nl ss i g n a lc h a n g e i n f l u e n c eo f g r a n u l ei na q u e o u ss o l u t i o no na p p a r e n tl si n t e n s i t yi sd i s c u s s e d p h2 3 0 t h ee m i s s i o ni n t e n s i t i e sa t3 0 2 0n ma r ee n h a n c e dg r a d u a l l yw i t ht h ei n c r e a s eo f h u m a ns e l a l ma l b u m i n ( h s a ) ，w h i l et h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yo fe ya t5 4 4 0m ni sq u e n c h e d ，a n d t h er a t i oo f h 0 2 0 m 帆4 4 0 r i mi sd i r e c t l yl i n e a rw i t ht h ec o n c e n t r a t i o no f h s ao v e rt h er a n g eo f 0 o l 一 4 8 0m g 几a tr o o mt e m p e r a t u r e ，w i t hal i m i to fd e t e r m i n a t i o n ( 3 0 0 5 0p g ，l w h e ne yi sf i x e da t 1 0 1 0 一m o l l s ow ed e v e l o par a t i o m e t r yo f p r o t e i nb a s e do nb o t hr l sa n df l u o r e s c e n c es i g n a l s u s i n gt h ei n t e m e t i e no f e y w i t hh s aa sam o d e l t h eb i n d i n gn u m b e r ( n ) a n db i n d i n gc o n s t a n t ( j q j c o u l db ea v a i l a b l ew i t ht h ev a l u e so f1 0 2a n d1 4 3 l 旷l m 0 1 t h et h e r m o d y n a m i cp a r a m e t e r s n e g a t i v ee n t h a l p y 口胁a n dp o s i t i v ee n 仃o p yq 毋v a l u e si n d i c a t et h a tb o t he l e c t r o s t a t i ci n t e r a c t i o n s a n dh y d r o p b o b i cb o n dp l a yam a j o rr o l ei nt h e b i n d i n gr e a c t i o n i t h a sb e e nr e v e a l e dt h a t , e l e c t r o s t a t i ce f f e c tq u e n c h e dt h ef l u o r e s c e n c eo f e y ，a n da g g r e g a t e db e t w e e ne ya n dh s a ，l e a d i n g t ot h ef o r m a t i o no ft h e s t a b l e c o m p l e xe y - h s aa n dt h ee n h a n c e dl ss i g n a l s , w h e r e a st h e f l u o r e s c e n c e i n t e n s i t yo fe yw a sq u e n c h e d i th a s b e e n f o u n dt h a tt h i sm e t h o dt a k e so na d i s t i n g u i s h e ds e n s i t i v i t ya n dm o r ew i d e l yd e t e c t e dr a n g ef o rp r o t e i n sc o n t e n t , f o rt h er a t i oo fr l s a n df l u o r e s c e n c ec o u l de l i m i n a t eas e r i e so fi n t e r f e r e n c e s , c o m p a r e dt or o u t i n er l so rf l u o r e s c e n c e t e c h n i q u e t h em e t h o dw a su s e dt od e t e r m i n eh u m a ns e r u ms a m p l e sa n dt h er e s u l t sw e r ec o i n c i d e n t w i t ht h ec b bg - 2 5 0m e t h o d 2 w ed e a lw i t ht h ed i s p e r s ec h a r a c t e ro fc a r b o nn a n o t o b e s ( c n t s ) i np - p h e n y t e n e d i a m i n e ( p p d ) ，a sw e l la st h ep r o d u c ea n dg r o wu po f s i l v e rn a n o p a r t i c l e su p o nt h es u r f a c eo f c n r s ，t h u st h e s p e c t r o g r a mo fc o m p o u n d si n c l u d i n gr l s ，a b s o r p t i o n , a n df l u o r e s c e n c ec o u l db eo b t a i n e da tt h e o p t i m u mc o n d i t i o n s w et h i n kt h a t , i ti sa c i d i t yo f s o l u t i o nn o tt h ec n t sn u m b e ri st i e di nw i t ht h e s i z ea n da m o u n to fc o m p o u n d s i t si n d i c a t e dt h a tc h i t sh a st u r n e di n t oan o v e lo b j e c tt or l s t e c h n i q u e ，w h i c hh a sb e e nk i n do f m e a n si ns p e c kg r o w t ha n da g g r e g a t i o ni n v e s t i g a t i o n ( 1 ) t h ei n t e r a c t i o nr e s e a r c hb e t w e e np - p h e n y l e n e d i u m i n e ( p p d ) a n ds i n g l e - w a l l e dc a r b o n n a n o t u b e s ( s w c n t s ) a sw e l la sm u l t i w a l l e dc a r b o nn a n o t u b e s ( m w c n t s ) h a sb e e ni n v e s t i g a t e d h a v i n gb e e nt e s t e db yr l s ，f l u o r e s c e n c e ，u vs p e c t a n dg r a n u l a r i t ym e a s u r e m e n t s ，i tc o u l db e i v 西南大学硕十学位论文 a b s t r a c t f o u n dt h es t r o n gi n t e r a c t i o nb e t w e e nm w c n t sa n da r y l a m i n er e a g e n t ；f u r t h e r m o r e ，t h er e a c t i o n m e c h a n i s mh a sb e e nb r o u g h tf o r w a r d ( 2 ) t h er e a c t i o no fc a r b o x y l i em w c n t sa n ds i l v e rc o l l o i d so b t a i n e db yt h ed e o x i d i z e ds i l v e r i o n sa r e e x p e r i m e n t e d ，a n da l s om v e s t i g a t et h eg e n e r a t i o no fa g - m w c n t sn a n o p a r t i c u l a t e s ( a g m t n p s ) u s i n gt h em o d i f i e dm w c n t s t e m p l a t e s w h e na g e sh a v eb e e na d s o r b e di nt h e e l e c t r o n e g a t i v em w c n t sb ys t a t i ce f f e c t , t h ei n t e n s i t ys i g n a l so fs o l u t i o ni n c l u d i n gf l u o r e s c e n c e , a b s o r p t i o na n dr l ss p e c t r aa l es t r o n g e rv i s i b l yc o m p a r e dt ot h o s eo fa g e s i te x p l a i n st h e a p p e a r a n c eo fm e t a ln s n o p a r t i c u l a t e s ，a n dt h e nr e v e a l st h ei n v e s t i g a t i v es i g n i f i c a n c eo fm e t a l - b a s e d c o m p l e xn a n o - m a t e d a la n dr e v i s e - q u a l i t yn m t t e r k e y w o r d s ：r e s o n a n c el i g h ts c a t t e r i n gt e c h n i q u e ；l i g h ts c a t t e r i n g f l u o r e s c e n c e r a t i o m e t r y ；h u m a ns e r u ma l b u m i n ；s i l v e rn a n o p a r t i c l e s ；c a r b o nn a n o c u b e s v 西南大学硕十学伊论文缩弓符号对照表 缩写符号对照表 v i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得西南大学或其他教育机构的学 位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在 论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权西南大学研究生院可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进 行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：口不保密， 口保密期限至年月止) ；：。：。、： 学位论文作者签名： 签字日期：年月 日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址：邮编： 西南大学硕十学伊论文第一章绪论 第一章绪论 1 1 光散射理论简介 在光学中的定义，散射就是由于介质中存在的微小粒子( 异质体) 或者分子 对光的作用，使光束偏离原来的传播方向而向四周传播的现象。 散射是要有散射源( 即浑浊介质) 存在的情况下才会发生的。因此，当介质 不均匀，即有异质体存在，就会有散射现象。浑浊介质中的异质体的尺寸大于入 射光波长时的散射称t y n d a l l 散射。它的强度是与入射光波波长无关的。 另外，在非常纯粹的气体或液体中，也会发生光散射现象。这是由于分子的热运 动引起了介质密度的涨落而造成折射率不均匀的缘故。它的散射强度远远小于 t y n d a l l 教射，称之为分子散射。 实验证明，极微小异质体( 异质体尺寸远小于入射光波长) 产生的散射和分 子散射的散射规律与大颗粒异质体散射( t y n d a l l 散射) 不同，其散射强度是与入 射光的波长有关的，即散射强度与光波波长的四次方成反比，这就是r a y l e i g h 散 射定律。这类散射也称为r a y l e i g h 散射。 t y n d a l l 散射和r a y l e i g h 散射都是弹性散射( e l a s t i cs c a t t e r i n g ) 或称静态散射 ( s t a t i cs c a t t e r i n g ) 。弹性散射的散射光频率与入射光频率一样，散射前后光的颜色 不变。另外还有非弹性散射( i n e l a s t i cs c a t t e r i n g ) ，如布里渊散射( b r i l l o u i ns c a t t e r i n 9 1 和拉曼散射( r a m a ns c a t t e r i n g ) ，拉曼散射是鉴定分子结构的重要工具。非弹性散射 的散射光频率是与入射光不一样的，即发生了频率位移。 当r a y l e i g h 散射位于异质体的吸收带中或者附近时，由于电子吸收电磁波的 频率与散射光色频率相同，电子因发生共振而强烈吸收散射光的能量继而再次发 生散射，这时的散射就称为共振光散射( r e s o n a n c el i g h ts c a t t e r i n g ，r l s ) 。共振光散 射光谱并非单纯的共振瑞利散射( r e s o n a n c er a y l e i g hs c a t t e r i n g ，r r s ) ，还有动态光 散射、d y n d a l l 散射及荧光等信号。 1 2 光散射技术的新发展与应用研究 自共振光散射技术首次应用于生物大分子的定量测定 i , 2 1 以来，经过十多年的 发展，已经广泛地应用于核醚3 - 2 7 、蛋白质 2 s - 3 2 1 、生化药物3 3 啦l 、金属离子 4 3 - 5 2 1 、 表面活性剂 5 3 , 5 4 l 、纳米粒子 5 5 - 5 8 l 、血液细胞1 5 9 - 6 1 l 与细菌1 6 2 ，6 3 】等的分析检测。目前， 基于光散射技术建立起来的新的研究方法主要有：( 1 ) 全内反射共振光散射光谱技 术，用于核酸 6 4 1 、黄连烈6 5 1 以及蛋白质【6 6 明的灵敏检测；( 2 ) 后向共振光散射技 术，用于核酸【6 8 】、蛋白质1 6 9 1 分析；( 3 ) 流动注射共振光散射( f i a r l s ) 联用技术应 舶南大学硕十学伊论文第一章绪论 用于蛋白1 7 0 1 的高效测定；( 4 ) 共振光散射成像分析技术，用于四环素【7 1 l 、卟啉聚集 体【翻、蛋白质【7 3 】和d n a 7 4 1 检测。 然而，随着r l s 技术的进一步发展，它的缺点也逐渐暴露出来：( 1 ) r l s 光谱 与其它基于本体溶液反应体系的光谱法一样存在干扰因素复杂的问题。因为许多 无法量化因素的存在，如入射光强度、溶液实际浓度、体系p h 值、离子强度、温 度、介质极性等，导致信号不稳定，重现性差，限制了不稳定分析试剂在r l s 技 术上的应用。( 2 ) 基于单波长测定的r l s 技术受仪器条件、电源电压等外界因素 影响较大。因此非常有必要发展一些新的技术来克服以上缺点，进一步完善光散 射技术，并拓宽其应用范围。 t e i s n 等首次提出选择性测定钙离子的荧光比率探针【7 5 宿，比率法由于在消 除常规干扰方面【徭8 0 l 具有明显的优势，因而在数据处理和定量分析方面受到研究 者的偏爱。近年来，人们在比率探针的研究与合成方面取得了很大的进展，多种 具有良好选择性和较高灵敏度的指示剂相继出现，双波长比率法也随之产生，并 广泛用于纳米粒子剐、金属离子1 5 2 罐5 1 、核酸蜘、葡萄糖【8 s 8 虮、p h 嗍、氧气含量 t g l 9 2 1 、以及生物聚合药物【9 3 叫的分析测定。目前建立的比率分析方法主要有： ( 1 ) 基于荧光比率探针的荧光比率法：探针f u r a - 2 、i n d o 1 和s t d i n 9 5 l 用于测 定人体细胞中的游离钙，以及响应灵敏的铅指示剂嗍、银指示刘籽l 、铜指示剂8 2 】 和测定人体中锌离子浓度的锌指示剂等隅3 1 。其中f u r a - 2 已在很多细胞系统和应用 中使用，尤其是在显微成像技术方面，避免了不均匀染色和光致漂白的干扰；i n d o 1 与f u r a - 2 一样，比率法避免了不均匀染色，细胞或组织厚度和光致退色的相关问 题，已经在流式细胞研究中广泛使用。 ( 2 ) 基于共振光散射比率探针的双波长r l s 比率法：h y a m i n e1 6 2 2 用于d n a 测赳明；阳离子卟啉【9 3 1 和j a n u sg r e e nb l u e 9 4 l 用于肝素的分析以及修饰金胶作为探 针检测葡萄糖8 8 ，盼i 。 ( 3 ) 基于两波长的吸光值之比的吸收比率法( 比率色谱法) ：在多通道检测技术 中用于质量控制，如：药物的纯度控制，成分复杂的中药分析等；偶氮胂i 作为 比色试剂测定血清钙【9 7 】。 1 3 纳米微粒 最早提出纳米尺度上科学和技术问题的是著名物理学家、诺贝尔奖获得者理 查德费恩曼。2 0 世纪8 0 年代初，纳米科技研究的重要仪器一扫描隧道显微镜 ( s t m ) 、原子力显微镜( a f m ) 等微观表征和操纵技术的出现，对纳米科技的发展起 到了积极的促进作用。 研究人员发现，当组成材料的晶体细到只有几纳米，就会展现出令人感兴趣 2 西南大学硕十学伊论文第一苹绪论 的特异性能，比如强度、硬度提高，熔点降低，催化活性增强，电阻增大等。纳 米科技的出现，无疑是现代科学的重大突破，它在材料科学、凝聚态物理学、机 械制造、信息科学、电子技术、生物遗传、高分子化学以及国防和空自j 技术等众 多领域都有广阔的应用前景【9 s 】。 碳纳米管由于特殊的结构所表现出的奇异力学、电学和磁学性质使得人们对 它的制备提纯与规模化生产1 9 9 - 1 0 2 1 、物理几何结构“0 3 1 、化学修饰【1 0 4 噜产生了极大 的兴趣【1 0 5 。1 0 3 】，并在表面工程技术”0 9 1 、场发射器件 1 l o 、储氢材料1 1 】、锂离子电 池1 1 1 2 1 、超级电容器【1 1 3 1 、超强复合材料【乒1 1 引、金属纳米光纤】、复合催化刘1 她1 2 1 】 以及生物传感器【1 2 2 ，1 2 3 】方面开展了广泛的研究。 l 固相萃取吸附剂“矧 碳纳米管比表面积较大，具有较强吸附能力，在固相萃取领域有着广泛的应 用前景。目前已有文献报道碳纳米管对有机化合物、金属离子f 1 2 5 1 和有机金属化合 物【1 2 6 肄环境污染物均具较高的富集能力碳纳米管不仅对目标化合物具有较高的 富集能力，有效地提高了分析方法的灵敏度，而且具有很好的重复使用性能，基 于这种特点，碳纳米管已成为可供选择的环境样品中污染物的优异预富集固相萃 取材料之一。基于碳纳米管的新型吸附装置的开发也逐渐成为此领域中的研究热 点。 2 修饰电极 碳纳米管具有良好的导电性、化学稳定性以及极高的机械强度，比表面积较 大，易于在修饰电极中引入多种官能团，是一种可用于制备修饰电极和电化学传 感器的优良材料。将碳纳米管对传统电极进行修饰可以降低氧化过电势，增加峰 电流，改善分析性能，提高方法选择性和灵敏度【1 2 , 1 2 引，因此，近年来碳纳米管作 为修饰电极材料已广泛应用于分析化学领域。 3 碳纳米管传感器【1 2 9 】 随着研究的深入，碳纳米管传感器必将有更广阔的发展空间。制造只能用显 微镜才能看到的电路，将传感器与集成电路的结合可用来制造便宜的用于测量天 然气泄漏或其它环境灾难的传感器【1 3 0 1 。将碳纳米管分割成较短的片段，这样产生 的碳纳米管可以应用于体积小到足以在不导致免疫反应的情况下穿过细胞的生物 医学传感器【1 3 1 1 。碳纳米管具有理想的吸收与发散光波的特性。利用这一新特性， 未来可望使单分子传感器变成现实【1 3 2 1 。碳纳米管薄膜结合电力学特征可用于开发 检测微应力的传感器【1 3 3 1 。上述传感器都不能有效检测有机气体，期望开发出有机 气体传感器及下一代神经传感器【h 4 1 。开发传感器阵列，有助于与微机结合实现智 能化控制。 4 碳纳米管平面显示器 两南大学硕十学伊论文 第一章绪论 碳纳米管的场发射机理及应用：场发射理论认为，根据量子力学的隧道效应， 当势垒厚度为无限大时，能量低于势垒的电子都不能逸出，当壁垒厚度为有限值 时，电子则以有限几率逸出，电子波函数指数随着渗入势垒的厚度下降。当t = 0 k 时，在费米能级e v 以上无电子，在e f 以下则有大量电子，位于该能级的电子能 穿过势垒，其穿透几率即使d , n l o 一，所形成的电流也是很大的。电场之所以能使 发射增大，是因为势垒以上根本没有电子，作用在于使势垒变窄，因而电子的透 射几率大大增加。 碳纳米管的微观结构特性使其较以往的场致发射阴极有三个优势：大的长径 比和纳米级顶端、良好的导电特性、电子逸出功低( 大的表面比) 。场发射显示器 ( f e d ) 一直是真空微电子领域的一个重要分支。碳纳米管冷阴极的出现，为显示技 术提供了新的突破点。碳纳米管作为f e d 冷阴极已显示出它所具有的在平面显示器 领域的巨大应用潜能。 5 储氢性能 碳纳米管独特的品格排列结构以及较大的比表面积，其储氢能力将远远高于 传统的储氢材料。研究发现，氢分子在碳纳米管上的吸附行为主要发生在碳纳米 管的内表面，且影响因素较多，如碳纳米管结构、温度等，因此改变上述条件会 对碳纳米管的储氢性能产生重要影响。除此以外，通过掺杂等方法改变碳纳米管 表面性能可以提高碳纳米管在常温条件下的储氢能力。在碳纳米管中分别掺入纳 米金属粒子能大大提高氢分子在碳纳米管管壁上的吸附速率和吸附量，这种现象 可以通过“s p i l l o v e r ”机理进行解释，即掺杂在碳纳米管管壁中的纳米金属粒子具 有将游离的氢分子“挤入”碳纳米管中的能力。因此纳米金属粒子种类和用量的 选择对碳纳米管储氢能力的影响至关重要。 另外，有关纳米合成材料的研究包括：以无机物模板进行的纳米或亚微米材 料的合成；以合成高聚物为模板进行的纳米或亚微米材料的合成；以天然大分子 为模板进行的纳米材料合成等。 目前，主要表征手段有透射电镜、扫描电镜、原子力显微镜、近红外光谱、 拉曼光谱、高效液相色谱、毛细管电泳仪等1 3 5 d 朔。 1 4 本文主要内容及意义 以上提到的各种比率法都是对于同种性质的光谱而言，譬如选择两个适当波 长处吸收光强度、共振散射光强度或荧光强度的比值。在此基础上本文提出散射 荧光比率法，由同时获得的光散射强度与荧光强度进行比值用于血清中h s a 的定 量分析，从而建立一种新的检测方法。碳纳米管作为共振光散射技术的研究对象， 开辟了其新的应用范围，而且对于微粒生长和聚集状态的研究，r l s 技术仍不失 4 西南大学硕十学位论文第一章绪论 为较好的分析手段。本文主要研究内容如下： ( 1 ) 基于酪氨酸( t y 0 与硝酸银之间的选择性作用，以银纳米粒子( a g n p s ) 为灵 敏r l s 探针，建立检测实际样品中酪氨酸的新方法。该方法灵敏度高，选择性好， 结果表明可用于复方氨基酸注射液中酪氨酸的灵敏测定。 ( 2 ) 利用r l s 技术灵敏度高和荧光分析法选择性较好的优点，建立散射荧光 比率分析法研究有机染料e o s i ny ( e 与生物大分子h s a 的相互作用。通过化学 反应动力学和热力学相关常数的计算，讨论了体系中散射颗粒动态变化对体系总 体表观r l s 强度的影响。与常见的生化药物分析方法( 分光光度法、荧光光度法、 r l s 法) 相比，基于双波长测定的比率法受外界干扰影响明显要小，结果更可靠。 ( 3 ) 研究碳纳米管与有机小分子以及金属纳米粒子的作用过程。碳纳米管能够 与芳香胺类试剂形成强的相互作用，经化学修饰后通过静电引力吸附银纳米粒子， 使本体溶液的共振光散射信号以及荧光信号显著增强，说明二者结合形成金属复 合微粒。这对于金属基纳米复合材料以及纳米改性剂的深入研究具有深刻的意义。 另外，还研究银纳米微粒在碳纳米管表面的生长情况，得到最佳条件下复合微粒 的共振光散射、荧光以及吸收强度。溶液的酸度能够影响形成复合微粒的大小， 而碳纳米管微粒的数目对复合物的形成影响不大。 两南大学硕七学伊论文第二_ ：章光散射技术在蛋向质检测方面的研究 第二章光散射技术在蛋白质检测方面的应用 2 1 共振光散射技术对酪氨酸的分析研究 氨基酸是蛋白质的基本结构单位和生物代谢过程中的重要物质，氨基酸分析 技术对蛋白质化学、生物化学和整个生命科学研究以及产品开发、质量控制和生 产管理等具有重要意义。 酪氨酸是人体的必需的是一种芳香族氨基酸，亦是2 0 种用来合成蛋白质的氨 基酸之一。它不能由动物的身体制造，必须要通过进食来摄取。它与人体的中央 神经系统功能有非常重要的关系，又是人体许多其它荷尔蒙的先驱物质。它常被 用来治疗精神病、忧郁症、甲状腺机能降低，也可以解除经痛风、湿骨痛及偏头 痛，有助于细胞长久保持年轻化，提高身体的免疫力。因此酪氨酸含量的测定【1 】 对于临床医学和制药具有重要的意义。 目前测定酪氨酸的方法主要有吸光光度法f 2 ，3 1 ，荧光光度法 4 - s ，高效液相色谱 法【9 ，1 们，差示脉冲伏安法【1 l 】，流动注射化学发光法【1 2 i ，试剂显色法【1 3 1 ，高效毛细 管电泳1 1 4 】等，这些方法有的费时，有的干扰大，有的测定灵敏度低。 纳米技术很早就渗透到了生物医学分析领域，同时关于金【1 5 1 或银纳米粒子的 合成方法 1 6 - 1 9 】、光学特性2 0 - 2 2 1 及应用 2 3 - 2 6 1 的研究也不断深入。在细胞组织研究中 普遍使用胶体金标记【2 7 】、银增强的细胞染色、细胞分离和免疫法【2 8 ，2 9 1 等手段。 审o h 旦审o 一审o 卫氧 。 酷氪醴结柯式 r 一c h z c 7 h - - 目c 图1 酪氨酸分子结构与反应机理 弱碱性溶液中酪氨酸可以还原硝酸银( 结构式及反应原理如图1 所示) ，生成均 一的银纳米粒子( a g n p s ) ，最大散射峰位于3 8 2 0 啪f 3 0 3 ，据此建立测定痕量酪氨 酸的r l s 分析法。 1 实验部分 1 1 仪器与试剂 6 西南大学硕七学位论文第二章光散射技术在蛋白质检测方面的研究 酪氨酸储备溶液：直接称取0 0 9 1g 酪氨酸( 中国医药集团上海化学试剂公司) 晶体粉末，溶解于二次蒸馏水中，转移溶液至1 0 0 0m l 容量瓶中，以二次蒸馏水稀 释至刻度，摇匀。配制成浓度为5 0 1 0 4 m o l l 的储备液，置于冰箱中备