微米中药功能衬材：活血及促进骨折愈合的作用.doc

www.CRTER.org曾庆，等. 微米中药功能衬材：活血及促进骨折愈合的作用微米中药功能衬材：活血及促进骨折愈合的作用曾 庆1，黄国志1，梁东辉2，邓虹珠3，易延逵3 (南方医科大学附属珠江医院，1康复医学科，2中医科，广东省广州市 510282；3南方医科大学中医药学院，广东省广州市 510515)引用本文：曾庆，黄国志，梁东辉，邓虹珠，易延逵. 微米中药功能衬材：活血及促进骨折愈合的作用J.中国组织工程研究，2016，20(38):5678-5683.DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.38.008 ORCID: 0000-0002-6873-0005(黄国志)文章快速阅读：微米中药功能衬材促进骨折愈合曾庆，女，1983年生，湖南省双峰县人，汉族，在职博士，主治医师，主要从事康复医学临床工作。 通讯作者：黄国志，博士，主任医师，教授，博士生导师，南方医科大学附属珠江医院康复医学科，广东省广州市 510282 中图分类号:R318文献标识码:A文章编号:2095-4344(2016)38-05678-06稿件接受：2016-06-30结果表明：微米中药功能衬材能够活血化瘀，改善微循环，促进成骨细胞增生，并进而促进骨折愈合于造模前和造模后第2，4，6周行全血高切黏度、全血中切黏度、全血低切黏度和血浆黏度检测；造模后第6周末处死兔，取桡骨标本进行组织学观察微米组：外敷微米中药功能衬材(微米三七粉混合骨碎补、红花等药物的有效成分)后加石膏外固定；中药对照组：外敷普通中药功能衬材(普通三七粉)后加石膏外固定；衬材对照组：外敷普通衬材(无菌脱脂棉)后加石膏外固定模型对照组：不予任何治疗取新西兰兔24只造成右侧桡骨骨折模型后随机分组文题释义：微米中药：是指采用现代高科技与传统炮制技术和制剂技术相结合而研制的，能保持传统中药固有药效学物质基础的粒度为微米级(平均直径15 m)的新型中药。微米化后的中药因不涉及对原子或分子结构层面上的干预和操作，故药物原有属性、药效特征和功能主治保持不变。同时由于制得的颗粒比表面积增大，能有效增进药物有效成分的溶出，提高药物的生物利用度。超微粉碎技术：是借助对物料的冲击、碰撞、剪切、研磨、摩擦、分散等手段能把原料加工成微米甚至纳米级的微粉，可使植物细胞破壁率达到90%以上，细胞内有效成分得到充分暴露。超微粉碎技术也可提高药物的靶向性，有助于控制药物在体内的分布等。摘要背景：课题组研制出一种新型医用骨科外固定材料微米中药功能衬材，并证实该衬材具有促进碱性磷酸酶分泌，降低血钙，升高血磷和钙磷乘积，促进骨痂形成的作用。目的：进一步验证微米中药功能衬材促进骨折愈合的疗效。方法：取新西兰兔24只，造成右侧桡骨骨折模型后随机分组，微米组外敷微米中药功能衬材(微米三七粉混合骨碎补、红花等药物的有效成分)后加石膏外固定，中药对照组外敷普通中药功能衬材(普通三七粉)后加石膏外固定，衬材对照组外敷普通衬材(无菌脱脂棉)后加石膏外固定，模型对照组不予任何治疗。于造模前和造模后第2，4，6周行全血高切黏度、全血中切黏度、全血低切黏度和血浆黏度检测；造模后第6周末处死兔，取桡骨标本进行组织学观察。结果与结论：血液流变学指标：微米组全血高切黏度、全血中切黏度、全血低切黏度和血浆黏度均低于同时期其余对照组，造模后第4，6周与模型对照组比较差异有显著性意义(P 0.05或0.01)；组织形态学观察：微米组可见大量成骨细胞，编织骨开始塑形，骨髓腔再通；中药对照组可见编织骨、软骨细胞和软骨内成骨共存，断端内、外骨痂相连，骨髓腔未再通；衬材对照组和模型对照组断端内、外骨痂大多尚未相连，骨髓腔未再通；结果表明：微米中药功能衬材能够活血化瘀，改善微循环，促进成骨细胞增生，并进而促进骨折愈合。关键词：生物材料；骨生物材料；微米中药；功能衬材；骨折；骨折愈合 主题词：中草药；骨折；组织工程基金资助：广东省科技计划项目(2006B35802005)3 P.O.Box 1200,Shenyang 110004 Zeng Qing, Studying for doctorate, Attending physician, Department of Rehabilitation Medicine, Affiliated Zhujiang Hospital of Southern Medical University, Guangzhou 510282, Guangdong Province, ChinaCorresponding author: Huang Guo-zhi, M.D., Professor, Doctoral supervisor, Chief physician, Department of Rehabilitation Medicine, Affiliated Zhujiang Hospital of Southern Medical University, Guangzhou 510282, Guangdong Province, ChinaMicron traditional Chinese medicine functional lining material: activating blood circulation and promoting fracture healingZeng Qing1, Huang Guo-zhi1, Liang Dong-hui2, Deng Hong-zhu3, Yi Yan-kui3 (1Department of Rehabilitation Medicine, 2Department of Chinese Medicine, Affiliated Zhujiang Hospital of Southern Medical University, Guangzhou 510282, Guangdong Province, China; 3School of Chinese Traditional Medicine, Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China)AbstractBACKGROUND: As a new self-synthetized medical orthopedic fixation material, micron traditional Chinese medicine functional lining material can promote the secretion of alkaline phosphatase and callus formation, decrease serum calcium level, as well as increase serum phosphorus level and calcium-phosphorus product. OBJECTIVE: To further verify the therapeutic effect of micron traditional Chinese medicine functional lining material on fracture healing. METHODS: Twenty-four New Zealand rabbits were selected to prepare models of right radial fracture, and then were randomly allocated into four groups: rabbits in micron group were treated with micron traditional Chinese medicine functional lining material (micron Panax notoginseng powder mixed with active ingredients of Davallia divaricata and Carthamus tinctoriousplus) plus plaster external fixation; those in traditional Chinese medicine control group treated with ordinary Chinese medicine functional material plus plaster external fixation; those in lining material control group treated with ordinary lining material (sterile degreasing cotton) plus plaster external fixation; those in model control group received no treatment. The whole blood viscosity at high/middle/low shear rates and plasma viscosity were detected at 2, 4 and 6 weeks before and after modeling. Additionally, rabbits in each group were killed at 6 weeks after modeling, and radial samples were removed for histological observation. RESULTS AND CONCLUSION: The whole blood viscosity at high/middle/low shear rates and plasma viscosity in the micron group were all lower than those in the other three groups in the same period, and had significant differences from those in the model control group at 4 and 6 weeks after modeling (P 0.05 or 0.01). A large number of osteoblasts could be found, woven bone began to form and the bone marrow cavity was recanalized in the micron group; in the traditional Chinese medicine group, woven bone, chondrocytes and endochondral ossification coexisted and there was a connection between calluses inside and outside of the broken end, but the bone marrow cavity was not recanalized. In contrast, neither connection between calluses inside and outside of the broken end, nor recanalized bone marrow cavity appeared in the lining material and model control groups. In conclusion, micron traditional Chinese medicine functional lining material can promote fracture healing by improving microcirculation and accelerating osteoblast proliferation.Subject headings: Drugs, Chinese Herbal; fractures, Bone; Tissue EngineeringFunding: the Science and Technology Program of Guangdong Province, No. 2006B35802005Cite this article: Zeng Q, Huang GZ, Liang DH, Deng HZ, Yi YK. Micron traditional Chinese medicine functional lining material: activating blood circulation and promoting fracture healing. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2016;20(38):5678-5683.5679ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH0 引言 Introduction骨折愈合是一个极为复杂的过程，虽然认为有自然愈合的倾向，但诸多实验和临床研究均证明，其愈合过程确实存在各种影响因素和快与慢的问题。5%-10%的骨折由于各种原因发生延迟愈合或不愈合1，传统中药治疗骨折的外用制剂多为普通硬膏、软膏、油膏等，缺少现代化的中药透皮给药系统，药物吸收较差，工艺简单，需多次重复使用，影响骨折外固定，达不到理想的治疗效果。研究结合骨折治疗的3大原则复位、固定及功能锻炼，将微纳米技术引入骨折治疗中，研制出一种新型医用骨科外固定材料微米中药功能衬材，前期实验研究已证实该衬材具有促进碱性磷酸酶分泌，降低血钙，升高血磷和钙磷乘积，促进骨痂形成的作用2。血液流变学指标可反映骨折后的瘀血程度，常作为评估骨折治疗效果的检测指标之一。而组织形态学观察是目前能够从微观角度尽可能客观地观察骨折愈合情况的较好标准。为了进一步验证微米中药功能衬材促进骨折愈合的疗效和探讨其治疗机制，实验将从血液流变学和组织形态学方面进行观察。雌性新西兰家兔体内雌激素水平相对雄性新西兰家兔要高，雌激素可促进骨中钙的沉积，青春期在雌激素影响下可使骨骺闭合；绝经期后由于雌激素缺乏而发生骨质疏松，所以为了尽量减少雌激素对实验观察的干扰，课题组选择了雄性新西兰家兔作为实验对象。1 材料和方法 Materials and methods 1.1 设计 对比观察动物实验。1.2 时间及地点 实验于2009年1至8月在南方医科大学珠江医院药剂科实验室、南方医科大学中医药学院实验室及华南理工大学材料学院实验室完成。1.3 材料 实验动物：普通级雄性新西兰兔，体质量2.0- 2.5 kg，南方医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK粤2006-0015。功能衬材：微米中药功能衬材：自制衬材，采用惰性气氛保护的高能球磨法制备微米三七粉，混合骨碎补、红花等药物的有效成分经浓缩、干燥、粉碎后所得的干膏粉，加入冰片等制备成药膏，均匀混吸于弹性无菌脱脂棉纱中制成。普通中药功能衬材：自制衬材，采用普通粉碎的三七粉，其余制备方法与微米中药功能衬材相同。普通功能衬材：自制衬材，由无菌脱脂棉纱制成。主要试剂与仪器：注射用青霉素钠(华北制药股份有限公司)；戊巴比妥钠(上海行知化工厂)；QM-3SP4J行星式高能球磨机(南京大学仪器厂)；Philips XL-30 FEG扫描电镜仪(PHILIPS，荷兰)；ZL9000血流变分析仪(北京众驰伟业科技发展有限公司)；手持牙科钻(海浦东金环医疗用品有限公司)。1.4 实验方法1.4.1 衬材的制作微米中药功能衬材：主要中药成分为三七、骨碎补、冰片等。制备过程为：消瘀接骨散所用药物有三七、骨碎补、冰片等，全部从广东和翔制药有限公司购买，经万能粉碎机粉碎后过150目筛，备用；将消瘀接骨散中除三七和冰片外的其余药物用醇提法提取有效成分，浓缩干燥后得干膏，粉碎得干膏粉；采用惰性气氛保护的高能球磨装置系统制备微米三七粉：将三七粉与磨球一起装入球磨罐中，抽真空，充入0.1 MPa的氩气作为保护气氛。设球粉比为151，高能球磨机的转速为200 r/min，球磨半小时，停机冷却半小时；在干膏粉中加入冰片和微米三七粉末，混合均匀，加入1.5%二甲基亚砜，得到药膏，利用纺织工业的重整技术，使中药药膏成分均匀地混吸于弹性无菌脱脂棉纱中，制作成微米中药功能衬材。普通中药功能衬材：主要中药成分为三七、骨碎补、冰片等。制备过程为：消瘀接骨散所用药物有三七、骨碎补、冰片等，全部从广东和翔制药有限公司购买，经万能粉碎机粉碎后过150目筛，备用；将消瘀接骨散中除三七和冰片外的其余药物用醇提法提取有效成分，浓缩干燥后得干膏，粉碎得干膏粉；在干膏粉中加入冰片和微米三七粉末，混合均匀，加入1.5%二甲基亚砜，得到药膏，利用纺织工业的重整技术，使中药药膏成分均匀地混吸于弹性无菌脱脂棉纱中制，作成普通中药功能衬材。1.4.2 造模及分组 采用柴本甫等3造模方法，用戊巴比妥钠30 mg/kg耳缘静脉麻醉家兔后，备皮，消毒，铺巾，在右侧前肢中下段前内侧作纵形切口，用牙科电钻在桡骨中段作3 mm缺损，保留尺骨完整，手术切口部位滴入0.1 mL(4104 U)青霉素，然后缝合皮肤。术后给予青霉素40104 U/d，连续肌肉注射3 d。将造模后的24只普通级雄性新西兰兔随机分为4组：微米组、中药对照组、衬材对照组和模型对照组，每组6只。微米组给予外敷微米中药功能衬材后加石膏外固定，中药对照组给予外敷普通中药功能衬材后加石膏外固定，衬材对照组给予外敷普通衬材(无中药)后加石膏外固定，模型对照组不予任何治疗。每周换1次衬材，连续观察6周。1.5 主要观察指标 血液流变学指标检测：于造模前和造模后第2，4，6周，分别经兔耳缘静脉采血5 mL，装入抗凝管。检测于25 条件下，由专人操作，在ZL9000血流变分析仪上分别测定全血高切黏度(200/S)，全血中切黏度(30/S)，全血低切黏度(1/S)和血浆黏度。 组织形态学观察：于造模后第6周末用空气栓塞法将所有家兔处死，立即锐性解剖出完整桡骨，以骨折断端为中心0.5 cm为取样部位，用体积分数10%甲醛溶液固定脱钙、脱水透明、石蜡包埋，连续切片，厚度为5 m，行苏木精-伊红染色，光学显微镜下观察骨折区修复情况。1.6 统计学分析 数据由第一作者采用SPSS 13.0软件完成统计处理。结果采用s表示，数据间差异性比较采用单因素方差分析。2 结果 Results 2.1 实验动物数量分析 24只兔均进入结果分析。2.2 微米三七粉的制备和检测结果 经检测发现，球磨8 h后三七粉由大颗粒形貌转化成层片状，片层厚度1.0-2.0 m，大颗粒粒径在10 m左右，达到微米要求。图1为原始三七粉和球磨8 h后得到的微米三七粉的扫描电镜图。B A图1 原始三七粉和微米三七粉的扫描电镜图Figure 1 Scanning electron micrographs of original Panax notoginseng powder and micron-Panax notoginseng powder图注：图中A为原始三七粉，为大颗粒形貌；B为微米三七粉，层片状，片层厚度1.0-2.0 m，大颗粒粒径在10 m左右，达到微米要求。2.3 微米中药功能衬材对骨折兔血液流变学指标的影响 全血低切黏度：微米组骨折后各个时期全血低切黏度均低于同时期其余对照组，造模后第2周时，微米组与模型对照组、中药对照组比较差异有显著性意义(P=0)；造模后第4周时，微米组与模型对照组、中药对照组比较差异有显著性意义(P=0)；造模后第6周时，微米组与模型对照组、中药对照组比较差异有显著性意义(P=0，P=0.001)，见表1。全血中切黏度：微米组骨折后各个时期全血中切黏度均低于同时期其余对照组，造模后第4周时，微米组和模型对照组比较差异有显著性意义(P=0)；造模后第6周时，微米组和模型对照组比较差异有显著性意义(P=0)，见表2。全血高切黏度：微米组骨折后各个时期全血高切黏度均低于同时期其余对照组，造模后第2周时，微米组和模型对照组比较差异有显著性意义(P=0.017)；造模后第4周时，微米组和模型对照组比较差异有显著性意义(P=0)；造模后第6周时，微米组和模型对照组比较差异有显著性意义(P=0)，见表3。血浆黏度：微米组骨折后各个时期血浆黏度均低于同时期其余对照组，造模后第2周时，微米组和模型对照组比较差异有显著性意义(P=0)；造模后第4周时，微米组和模型对照组比较差异有显著性意义(P=0)，微米组与中药对照组比较差异有显著性意义(P=0.001)；造模后第6周时，微米组和模型对照组比较差异有显著性意义(P=0)，微米组与中药对照组比较差异有显著性意义(P=0.036)，见表4。2.4 微米中药功能衬材对骨折兔组织形态学的影响 造模后第6周时，微米组骨折端骨小梁均已互相连接、融合，骨小梁肥厚，小梁间血管扩张，数目较多，软骨内成骨完成，可见大量成骨细胞，编织骨开始塑形，骨髓腔再通；中药对照组可见编织骨、软骨细胞和软骨内成骨共存，断端内、外骨痂相连，骨髓腔未再通；衬材对照组和模型对照组有软骨细胞生成和软骨内成骨，并见少量编织骨，断端内、外骨痂大多尚未相连，骨髓腔未再通，见图2。骨小梁较细，小梁间血管较少，骨痂外周有大量增生的纤维组织包裹，说明局部血液供应欠佳。3 讨论 Discussion“消瘀接骨散”本着“血不活则骨不接”、“瘀不去则骨不连”、“肾实则骨有生气”的理论，以三七活血化瘀药为君药，以骨碎补等补肾壮骨药为臣药，其对骨折的疗效在多年的临床实践中已得到验证。课题组使用的微米中药功能衬材是在“消瘀接骨散”的基础上，结合惰性气氛保护的高能球磨法研制而成。微米中药是指采用现代高科技与传统炮制技术和制剂技术相结合而研制的，能保持传统中药固有药效学物质基础的粒度为微米级(平均直径15 m)的新型中药。超微粉碎技术是借助对物料的冲击、碰撞、剪切、研磨、摩擦、分散等手段能把原料加工成微米甚至纳米级的微粉，可使植物细胞破壁率达到90%以上，细胞内有效成分得到充分暴露6。微米化后的中药因不涉及对原子或分子结构层面上的干预和操作，故药物原有属性、药效特征和功能主治保持不变7-8。同时由于制得的颗粒比表面积增大，能有效增进药物有效成分的溶出，提高药物的生物利用度9。和普通级别三七粉相比，三七经超微粉碎后粒径变小，比表面积增大，生物利用度显著提高，吸收效果更好5，10。其次超微粉碎技术也可提高药物的靶向性，有助于控制药物在体内的分布等8。3.1 微米中药功能衬材能活血化瘀，改善微循环 骨折后的血液流变学异常和出现的微循环障碍，是影响骨折愈合的重要机制之一11。骨折创伤有瘀血现象存在，骨折后动物的瘀血程度可反映于血液流变学指标。血液流变学性质的异常直接影响局部血液灌注和骨组织代谢，不利于骨折愈合12。血液流变学指标中，血浆黏度及全血黏度可反映血液黏滞性和浓稠性。实验结果提示微米中药功能衬材在骨折早期能够活血化瘀，改善局部血液供应，加快血肿机化。微米组几乎所有指标均低于对照组，造模后第4， 5683ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH表1 各组造模后不同时间点全血低切黏度的比较 (s，n=6，mPas)Table 1 Comparison of the whole blood viscosity at low shear rate among groups at different time points after modeling表注：与微米组比较，aP 0.01；与中药对照组比较，bP 0.05，cP 0.01。表注：与微米组比较，aP 0.05，bP 0.01；与中药对照组比较，cP 0.01。组别造模前造模后第2周造模后第4周造模后第6周微米组3.290.323.760.343.600.363.420.30中药对照组3.260.304.010.313.790.343.650.38衬材对照组3.320.454.320.37b4.400.35bc4.670.19bc模型对照组3.280.434.260.31a4.470.29bc4.560.28bc表3 各组造模后不同时间点全血高切黏度的比较 (s，n=6，mPas)Table 3 Comparison of the whole blood viscosity at high shear rate among groups at different time points after modeling时间微米组中药对照组衬材对照组模型对照组造模前12.950.6113.010.5712.930.6012.970.54造模后第2周13.240.6314.920.44a15.950.67ac15.800.49ab造模后第4周13.300.5316.330.58a17.260.57ab17.470.64ac造模后第6周12.870.5614.460.79a18.890.70ac18.680.59ac表2 各组造模后不同时间点全血中切黏度的比较 (s，n=6，mPas)Table 2 Comparison of the whole blood viscosity at middle shear rate among groups at different time points after modeling组别造模前造模后第2周造模后第4周造模后第6周微米组1.330.081.580.131.420.051.350.11中药对照组1.310.071.720.081.660.16b1.500.13a衬材对照组1.340.111.970.12bd2.080.09bd2.200.11bd模型对照组1.300.101.910.14bc2.030.11bd2.240.12bd表注：与微米组比较，aP 0.05，bP 0.01；与中药对照组比较， cP 0.05，dP 0.01。表注：与微米组比较，aP 0.05，bP 0.01；与中药对照组比较， cP 0.01。表4 各组造模后不同时间点血浆黏度的比较 (s，n=6，mPas)Table 4 Comparison of the plasma viscosity among groups at different time points after modeling组别造模前造模后第2周造模后第4周造模后第6周微米组4.130.274.720.384.480.454.210.50中药对照组00.404.750.374.540.44衬材对照组4.150.285.230.34a5.690.40bc6.150.26bc模型对照组10.305.580.32bc6.060.22bcABCD图2 各组造模后第6周桡骨组织形态学比较(苏木精-伊红染色，100)Figure 2 Comparison of radial histological observation among groups at 6 weeks after modeling (hematoxylin-eosin staining, x100)图注：图中A为微米组，骨折端骨小梁均已互相连接、融合，软骨内成骨完成，可见大量成骨细胞，编织骨开始塑形，骨髓腔再通；B为中药对照组，可见编织骨、软骨细胞和软骨内成骨共存，断端内、外骨痂相连，骨髓腔未再通；C为衬材对照组；D为模型对照组，衬材对照组和模型对照组有软骨细胞生成和软骨内成骨，并见少量编织骨，断端内、外骨痂大多尚未相连，骨髓腔未再通。第6周最为明显，全血低切黏度、全血中切黏度、全血高切黏度和血浆黏度与同时期其余对照组相比均低(P 0.05)；组织形态学显示，微米组于6周时骨小梁间血管扩张，数目较多。据此，推测微米中药功能衬材在骨折愈合的中后期不但能增加血管数量，而且扩张血管，增加血流量、降低全血黏度和血浆粘度，改善微循环，为骨折愈合奠定了良好的基础。微米中药功能衬材中包含三七、红花等药材，其中三七可抗血小板聚集，降低全血黏度和红细胞聚集程度；红花可降低全血黏度，防止静脉血栓形成13。由实验可以看出，应用微米中药功能衬材后，骨折兔的全血黏度和血浆黏度均明显降低，说明微米中药功能衬材能够更好地改善血液流变性，使血液浓、黏、聚、凝程度减轻。众所周知，骨折后血液黏度增高，微循环血流缓慢，组织氧饱和度下降，在骨折愈合过程中，易形成软骨骨痂，延长愈合时间。而微米中药功能衬材可通过降低血液黏度，改善微循环血流状态，防止较大血肿形成，及时预防和消除凝血块，缩小无菌性炎症范围，缩小软骨骨化范围；同时，通过改善局部血液供应，加速血液循环，改善血管壁的通透性，有利于离子交换，有效动员邻近部位的钙沉积在骨折部位14，以促进骨折愈合。3.2微米中药功能衬材能促进成骨细胞增生 骨折愈合可分为血肿形成、纤维性骨痂形成、骨性骨痂形成和骨的改建4个依次交替演进的过程。不同的组织、细胞出现常常表示某一阶段的开始。根据光镜观察结果可以看出，造模后第6周时，微米组已开始出现骨折的断端连接，多数家兔周围骨痂开始改建，进入骨折愈合的第4阶段；模型对照组骨折断端内外骨痂多数尚未连接，骨髓腔未通。显而易见，微米中药功能衬材更加具有促进骨折愈合的作用。众所周知，成骨细胞对骨折愈合有着重要的作用。组织形态学显示，造模后第6周时微米组成骨细胞增生活跃，细胞核大，核仁较清晰，染色质丰富，此时的细胞质中核糖核酸含量增加，功能活跃，产生蛋白的能力较强，有助于基质形成以及钙化进行；模型对照组成骨细胞虽然增多，但排列不很紧密，说明功能不很活跃。提示微米中药功能衬材能够产生并激活成骨细胞，增强骨再生能力。现代医学研究表明，局部毛细血管可供应营养物质，促进成骨细胞生长发育，增强功能，同时血管内皮细胞可转变为成骨细胞，由此可见，成骨细胞激活早、增生快与微米中药功能衬材的活血化瘀、毛细血管