卵巢子宫内膜异位症异位和在位内膜组织中孕激素受体亚型的表达及意义.doc

卵巢子宫内膜异位症异位和在位内膜组织中孕激素受体亚型的表达及意义【摘要】目的研究子宫内膜异位症组织中孕激素受体亚型的表达，探讨其在内膜异位症发生、发展和治疗中的意义。方法选取2005年15月山东大学齐鲁医院妇产科22例卵巢子宫内膜异位囊肿的囊壁组织，6例同时行子宫切除术患者的在位内膜组织和13例正常内膜组织，采用RT-PCR技术对孕激素受体(PR-A+B)和孕激素受体B亚型(PR-B)的基因表达进行半定量研究。结果巧克力囊肿组织中PR-A+B和PR-B mRNA表达显著低于正常内膜组织和子宫内膜异位症(EM)患者在位内膜组织(P001)；巧克力囊肿组织中PR-BPR-A+B mRNA的比值低于正常子宫内膜组织PR-BPR。A+B mRNA的比值，差异有显著性(P001)。结论PR-A+B和PR-BPR-A+B mRNA的比值降低可能与EM发生、发展及治疗中“孕激素耐受”相关。 【关键词】 卵巢子宫内膜异位症受体孕酮子宫内膜异位症(endometriosis，EM)的治疗是非常棘手的问题。虽然孕激素类药物能缓解EM症状，但常见孕激素抵抗而影响其疗效。孕激素通过与靶细胞上的受体(receptor)结合发挥生物学作用，细胞核中存在分子质量不同的孕激素受体亚型：PR-A和PR-B。本实验采用RT-PCR技术检测卵巢巧克力囊肿患者异位和在位内膜以及正常子宫内膜组织中两种孕激素受体亚型的基因表达(PR-A mR-NA、PR-B mRNA)，探讨孕激素受体亚型在于宫内膜异位症发病中的作用，为临床治疗的药物选择提供理论依据。1 资料与方法11 资料来源 选取2005年15月山东大学齐鲁医院经腹或腹腔镜下卵巢子宫内膜异位囊肿剥除的患者22例(其中6例为卵巢子宫内膜异位囊肿合并子宫腺肌病，同时行子宫切除术)为研究组，其中增生期10例，分泌期12例；年龄平均35岁(2750岁)。选取同期来院进行健康查体或不明原因不孕患者13例作为对照组，增生期5例，分泌期8例；年龄平均33岁(2446岁)。所有入选病例入院前3个月内均未服用激素类药物；未患子宫内膜肿瘤、卵巢恶性肿瘤、功能失调性子宫出血及乳腺肿瘤等与激素水平密切相关的疾病。研究组于手术切除30min内取巧克力囊肿壁，合并子宫腺肌病行子宫切除术者同时取其在位于宫内膜；对照组于官腔镜检查时取少许子宫内膜，立即放入冰盒中并于10min内转移至-80冰箱中保存备用。所有组织标本都经病理证实为卵巢子宫内膜异位囊肿或正常内膜。12 研究方法1.2.1 组织总RNA提取 用1%DEPC水溶液浸泡所有一次性实验器材，按照TrizoL试剂使用说明，采用一步法提取组织总RNA，立即使用或-80保存备用。紫外分光光度计测定RNA浓度和纯度。1.2.2 逆转录 按照试剂盒说明进行逆转录合成cDNA，反应体系如下：RNA l L(0.5g)、5×buffer4L、DTT2L、4xdNTP2L、OLigodT18 L、M-MLV逆转录酶1L、DEPC处理水10L(共20L)；反应条件为37 60min、95 5min、4冷却后进行PCR反应或-20保存备用。1.2.3 PCR扩增 反应体系共20L，包括10×buffer 2L、25Mm Mgcl2 1.6L、4×dNTP 0.4L、Taq酶0.4L、上下游引物各1L、cDNA0.8L、超纯水12.8L；反应条件为:95预变性5min后，按下述循环进行PCR扩增：94变性30s，56退火30s，72延伸45s，扩增35个循环，72延伸7min。引物设计：由于PR-A和PR-B由同一基因编码，两者的区别在于PR-B的N.末端较PR-A多164个氨基酸，PR-A没有自己独特的基因序列，根据两者共同序列设计引物，即PR-A+B(上游5′-TGGAAGAAAT-GACTGCATCG。3’下游5′-TAGGGCTTGGCTTTCATITG-3’)；根据PR-B特有序列设计引物，即PR-B(上游5′-ACACCTTGCCTGAAGTITCG-3′下游5′-CTGTCCTITrCT-GGGGGACT-3′)，两者扩增片段长度均为196 bp1。以β-actin作为内参照，上游引物5′-AGCGAGCATC-CCCCAAAGTT-5′下游引物5′GGGCACGAAGGCTCAT-CATT-3′，扩增片段长度为285 bP。1.2.4 凝胶电泳 取扩增产物(PR-A+B或PR-B)5L，与5L-actin产物及l L 6xbuffer(上样缓冲液)混合均匀后于1.8的琼脂糖凝胶(含0.5mgml澳化乙啶)上电泳，60min后置紫外灯下观察并拍照，用捷达801专业数码凝胶成像与分析系统扫描后测定光密度值，将PR-A+B(或PR-B)β-aetin比值作为PR-A+B(或PR-B)表达水平的相对参数。1.2.5 统计分析 各组间表达串的差异显著性用χ2检验判断，均数的差异显著性用方差分析和q检验判断，以P0.05为差异有显著性。2 结果2.1 PR-A+B在正常子宫内膜、研究组在位及异位于宫内膜组织表达 PR-A+BmRNA表达于所有被检组织中。比较正常子宫内膜、研究组在位及异位于宫内膜组织中PR-A+BmRNA的表达(见表1)，结果发现：研究组异位子宫内膜组织PR-A+BmRNA的表达(0.0900.017)显著低于正常子宫内膜组织(0.8340.109)和研究组在位子宫内膜组织中PR-A+BmRNA的表达(0.8040.157)，与后两者比较差异均有非常显著性(P0.05)，表明在异位子宫内膜组织中总孕激素受体表达量减少。表1 各种内膜组织中PR-A+BmRNA、PR-BmRNA的表达(略)2.2 PR-B在正常子宫内膜、研究组在位及异位子宫内膜组织表达13例正常内膜组织和6例研究组在位内膜组织均有PR-B mRNA表达，表达率100%（13/13、6/6），22例卵巢子宫内膜异位囊肿患者的异位内膜组织中有20例表达PR-B mRNA，2例未见表达，表达率90.9%（20/22），与前两者差异无显著性（P0.05）。研究组异位子宫内膜PR-B mRNA（0.0370.009）的表达低于正常子宫内膜（0.6290.090）和研究组在位子宫内膜组织（0.6390.156）的表达，与后两者比较差异均有非常显著性（P0.05），见表1。2.3 研究组异位内膜组织PR-B/PR-A+B mRNA的比值（0.4210.029）低于在位内膜组织（0.7890.014）和正常子宫内膜组织（0.7560.027）PR-B/PR-A+B mRNA的比值，与后两者比较差异有非常显著性（P0.05）。见表1。3 讨论Mylonas等3的研究表明，正常子宫内膜组织中PR-A和PR-B共表达，并随月经周期呈现周期性变化，增生期持续上升，增生晚期达到峰值，分泌期减少，分泌晚期和增生早期只有少量表达。关于子宫内膜异位症患者异位于宫内膜组织中PR-A和PR-B表达的研究，不同学者得出了不同结论：Atria?用免疫沉淀、Westren杂交法检测18例EM患者的异位及同期在位内膜中PR-A和PR-B蛋白，结果表明在位内膜中有17例表达PR-B蛋白，且于排卵前期表达增强；而PR-A蛋白在所有在位内膜均有表达，但相比较弱，无周期性变化。在异位内膜中，PR-A全部表达，而PR-B蛋白无1例表达，与在位内膜相比较，PR-A表达强度较弱，且也无周期变化。另用RNA酶保护测定法检测8例患者在位及异位内膜PR转录子表达，结果证实全部在位内膜均有PR-A、PR-B转录于表达，而异位内膜仅表达PR-A转录子，分析可能在异位内膜中无PR-B转录子，因为EM内膜仅有PR的抑制型亚型PR-A，而无活动型亚型PR-B，孕激素治疗作用可能通过与PR-B蛋白结合而作用于异位内膜，致使临床显示部分患者孕激素治疗无效。Misao等4用RT-PCR方法研究14例异位内膜PR亚型表达状况，发现其中8例PR-BmRNA与PR-A+B mRNA的比率增高，与在位内膜相比较，差异有非常显著性；无论增殖期或分泌期，异位内膜均高于在位内膜。虽然研究方法和具体结论有差异，但都发现异位内膜组织中PR-A和(或)PR-B的表达较正常内膜减弱且周期性变化紊乱，表明异位内膜对激素调节的反应性不如在位内膜好。本研究结果显示，内异症患者异位内膜PR-A+B和PR-BmRNA表达明显低于在位内膜，表明异位内膜不同于在位内膜，提示异位内膜和在位内上减少的PR以PR-B减少为主，而PR-A变化较小，可能是由于异位内膜组织中存在影响PR不同启动于选择的因素，使其相对较多的选择PR-A启动子进行转录，其具体分子机制有待于进一步研究证实。体外实验研究表明：PR-B转录活性较强，PR-A是PR的抑制性亚型，能抑制PR-B和ER、AR等甾体激素受体的转录活性5，而PR-B则无此作用。最近，有学者通过敲除小鼠PR-A或PR-B基因，建立了研究PR-A或PR-B基因功能的动物模型6，进一步证实了体外实验结论，同时证实PR-A和PR-B的表达具有组织和细胞特异性，对于卵巢和子宫的发育来说，敲除PR-A基因造成的畸形比敲除PR-B基因严重的多，而且证实PR-A的表达能抑制子宫内膜细胞的增殖。总PR减少以PR-B减少为主导致孕激素对抗高雌激素的能力降低，而相对较高的PR-A能进一步抑制PR-B活性，使其本身抑制雌激素受体活性和子宫内膜细胞增殖的作用难以体现，形成临床常见的孕激素不敏感现象，在内异症的发展中起作用。本研究结果显示，研究组在位内膜PR-A+B和PR-BmRNA的表达及两者比值与正常对照组差异无显著性，表明异位内膜与在位内膜PR-A+B和PR，BmRNA含量的不同，可能与腹腔局部微环境性激素的水平不同有关。但由于本研究中所取病例组在位内膜有限，并且均为卵巢子宫内膜异位囊肿合并子宫腺肌病患者，所以全面客观的评价研究组在位内膜PR-A和PR-BmRNA的表达尚需进一步研究。【参考文献】 1Ishibashi H,Suzuki S,et al.Sex steroid hormone re-ceptors in human thymomaJ.Clin Endocrinol Metab,2003,88(5):2309-23172Mylonas I,Jeschke U,Shabani N,et al.Immunohistoehemieal analysis of estrogen receptor alpha,estrogen receptor beta and progesterone receptor in normal human endometriumJ.Acta Histochem,2004,106(3):245-2523Attia GR,Zeitoun K,Edwards D,et al.Progesterone receptorisform A but not B is expressed in endometriosisJ.J Clin Endocrinol Metab,2000,85(8):2897-29024Misao R，Nakanishi Y,Fujimoto J,et al.Expression of sex hormone-binding globulin exon splicing variant messenger ribonucleic acid in human ovarian endometriosisJ.Fertil Steril，1998,69(2):324-3285Bain DL,Franden MA,McManaman JL,et al.The N-terminal region of human progesterone B-receptors:biophysical and bio-chemical comparison to A-receptorsJ.J Biol Chem,2001,276(26)23825-238316McDonnell DP,Goldman ME.RU486 exets anti-estrogenic an-tivities through a novel progesterone receptor:a form-mediated mechanismJ.J Biol Chem,1994,269(16):11945-119497Wen DX,Xu YF,Mais DE K，et al,The A and B isoforms of the