细胞工程实验报告-鲍文英.doc

细胞工程实验报告 所在学院： 生命科学学院 年级专业：09生物科学（1）班 授课老师： 刘亚军 本 科 生： 鲍文英 学 号： 09122014 2011年12月烟草叶片组织培养实验一 实验前准备(2011.10.17)1、实验目的 了解植物离体培养所用培养基的配制方法。2、实验过程相关材料的准备：烟草叶片、实验药品、冰箱、天平、纯水器、酸度计、常用培养基配制用玻璃仪器及分装设备、酒精灯、镊子、解剖刀、口罩、封口膜；培养基母液的配制：在准备室中将MS培养基中的各种成分，按原量的20倍或200倍分别称量，定容配成培养基母液，灭菌后冷却，于冰箱中保存。这样每次使用时，按比例量取并加水稀释，制成诱芽培养液或生根培养基，培养基成分见表1；诱导愈伤组织培养基的配制：按表1取母液配制MS培养基（煮沸后用酸度计调pH5.8-6.0），再向其中加NAA(0.2mg/L)和6-BA(2mg/L),即为诱导愈伤组织培养基，分装、灭菌后备用；无菌操作室的消毒灭菌：用过氧乙酸熏蒸灭菌，操作前开紫外灯照射30min。3、注意事项趁热分装，以免培养基凝固无法转移；在使用提前配制的母液时，轻轻摇动盛放母液的瓶子，如果发现瓶中有沉淀、悬浮物或被微生物污染，应立即淘汰这种母液，重新进行配制； 按顺序移取培养基母液，必须用所量取的母液将量筒或移液管润洗2次。 实验二 外植体的消毒灭菌(2011.10.18)1、实验目的 了解外植体消毒原理，掌握操作过程。2、实验原理 酒精是最常用的表面消毒剂，以70%75%酒精杀菌效果最好；升汞可以与带负电荷的蛋白质结合，使蛋白质变性，从而杀死菌体。3、实验过程 打开无菌操作台紫外灯照射30min；将用水洗净的烟草叶片放在超净工作台上的培养皿中，用解剖刀切取若干长约1cm，宽约1cm的外植体；将上述外植体置于0.1%氯化汞溶液中约十分钟，期间需要不断的摇动，然后在75%的乙醇中清洗约20s。4、注意事项用酒精对植物材料浸泡时应严格控制时间；升汞对环境危害大，使用后应做好回收工作。实验三 愈伤组织的诱导(2011.10.18)1、实验目的 运用植物的快繁技术诱导愈伤组织,熟练掌握无菌操作。2、实验原理 本实验以及下面两个实验的理论依据是植物细胞的全能性。离体植物组织在人工诱导条件下去分化，失去其特有结构与功能变成具有未分化细胞特征，恢复到分化组织状态，形成愈伤组织，经过再分化形成具芽和根的完整植株。3、实验过程 接种前开无菌操作台紫外灯照射30min；戴上口罩，取已配制和灭菌过的培养基两瓶、灭菌的培养皿一副于无菌操作台上，向培养皿中倒入一定量的水，用于冷却镊子和解剖刀，用酒精棉球擦拭手和台面；在酒精灯火焰边取消毒的外植体于培养基上，每瓶1-3个，瓶口和封口膜适当靠近火焰灭菌后封住瓶口，贴上标签；将接种过外植体的培养瓶放在光照培养室内，培养温度为25+1，光照强度2000-3000LX，时间12h/d，每三到四天观察一次。4、实验结果与分析 接种后没有被细菌及霉菌污染，愈伤组织生长状况良好。5、注意事项操作时不能离开火焰附近，手尽量不要经过放置外植体的培养皿上方；消毒灭菌后的外植体应立即接种培养；在接种过程中要经常灼烧接种器械，防止交叉污染；实验后将工作台面清理干净，各种仪器工具洗净归位。实验四 芽的诱导(2011. 11.13)1、实验目的 掌握植物离体无性繁殖诱导不定芽的原理与方法，熟练无菌操作。2、实验过程 取实验一中的母液配制MS培养基（煮沸后用酸度计调pH5.8-6.0），再向其中加NAA(0.2mg/L)和6-BA(2mg/L),即为诱导出芽培养基，分装、灭菌后备用；转接前开无菌操作台紫外灯照射30min；戴上口罩，从光照培养室中取出长有愈伤组织的锥形瓶，和灭菌的培养皿、两瓶培养基一起置于无菌操作台上，向培养皿中倒入一定量的水，用酒精棉球擦拭手和台面；在酒精灯火焰旁，用镊子取出愈伤组织放在未装水的培养皿中，切成小块，转接到新培养瓶中，每瓶1-3块，瓶口和封口膜适当靠近火焰灭菌后封住瓶口，贴上标签；将转接了愈伤组织的培养瓶放在光照培养室内，培养温度为25+1，光照强度2000-3000LX，时间12h/d，定时观察芽的诱导。3、实验结果与分析 转接后没有被细菌及霉菌污染，待出芽组织生长状况良好，发出新芽并有明显的生长。4、注意事项转接时，宜将愈伤组织的切口处置于培养基界面上；操作时不能离开火焰附近，手尽量不要经过放置外植体的培养皿上方；在接种过程中要经常灼烧接种器械，防止交叉污染；实验后将工作台面清理干净，各种仪器工具洗净归位。 实验五 根的诱导(2011.12.6)1、实验目的 了解植物快繁技术中诱导生根培养基的配制，掌握操作技术，熟练无菌操作。2、实验过程取实验一中的母液配制MS培养基（煮沸后用酸度计调pH5.8-6.0），再向其中加NAA(0.2mg/L),即为诱导生根培养基，分装、灭菌后备用；转接前开无菌操作台紫外灯照射30min；戴上口罩，从光照培养室中取出长有出芽组织的培养瓶，和灭菌的培养皿、两瓶培养基一起置于无菌操作台上，向培养皿中倒入一定量的水，用酒精棉球擦拭手和台面；在酒精灯火焰旁，用镊子取出出芽组织放在未装水的培养皿中，小心切取带有芽的组织，转接到新培养瓶中，每瓶1-3颗，瓶口和封口膜适当靠近火焰灭菌后封住瓶口，贴上标签；将转接了芽组织的培养瓶放在光照培养室内，培养温度为25+1，光照强度2000-3000LX，时间12h/d，定时观察根的诱导。3、实验结果与分析 转接后没有被细菌及霉菌污染，待生根组织生长状况良好，不定芽生长旺盛，诱导出的根呈乳白色，长1cm-2cm，所配制培养基适合生根培养。4、注意事项切取芽组织时，谨慎操作，以免损伤不定芽；操作时不能离开火焰附近，手尽量不要经过放置外植体的培养皿上方；在接种过程中要经常灼烧接种器械，防止交叉污染；实验后将工作台面清理干净，各种仪器工具洗净归位。实验感悟 经过这次细胞工程实验课的学习，我了解到植物组织培养过程中需要注意的众多关键实验操作，同时也深刻意识到前期准备工作的重要性，在已经成熟的植物组织离体快繁技术的理论和实践指导下，运用先进的实验设施和设备条件，保持强烈的无菌意识，只要实验材料准备充分，我们的实验结果会在很大程度上符合理论结果。表1 MS培养基配方大量元素母液（20）定容500mL肌醇母液（200）定容100mLNH4NO3(g/L)16.50肌醇2gKNO319.00铁盐母液（200）定容100mL（分别溶）CaCl22H2O3.32FeSO47H2O556mgMgSO47H2O3.70Na2-EDTA2H2O746mgKH2PO4 1.70激素母液微量元素母液（200）定容500mLNAA(0.2mg/L)先少量95%乙醇引溶，后加水定容KI (mg/L)836-BA(2mg/L)先少量浓盐酸引溶，后加水定容H3BO3620培养基配制（1L）MnSO44H2O1960大量元素50mL定容到1LZnSO47H2O8