（微生物学专业论文）d氨基酸氧化酶基因的诱导表达及酶工程的研究.pdf

摘要 摘要 本文剩用乳糖代替i p t g 作为诱导剂 对含有d 一氨基酸氧化酶 d a a o 基 因的重组大肠杆菌b l 2 1 d e 3 p w y 中的d a a o 进行诱导表达 通过摇瓶发酵 初步研究了乳糖浓度 菌体浓度 诱导温度 诱导时间对d a a o 表达的影响 结 果表明 当菌浓o d 6 0 0 达1 0 左右 乳糖浓度为l o g l 2 8 下诱导约6 h 摇瓶发 酵得到的d a a o 酶活高达2 4 0 0 u l 在5 l 自控式发酵罐上进行表达时 对其高密 度发酵的诱导温度进行了进一步优化 分别在2 3 2 5 2 8 3 2 和3 7 下进行乳糖诱导表达 通过p h 控制 葡萄糖消耗结束后 开始降温并分两次补 加乳糖进行诱导 在2 8 乳糖浓度1 诱导发酵约2 2 h 酶活最高达3 7 8 4 3 2 u l 菌浓 o d 6 0 0 达2 7 4 4 并且利用本实验室自制的金属螫合载体e p i 一3 0 一a r g i d a c 0 2 对这种带有6 个组氨酸的重组d 氨基酸氧化酶 d a a o 进行一步分离纯化 其纯化倍数为 1 0 倍 酶活回收率达3 8 3 5 s d s p a g e 显示为单一条带 纯酶液经环氧载体 e u p e r g i tc 固定化处理后 其最适反应温度提高到4 0 c 最适反应p h 向碱性偏 移 固定化酶对温度和p h 的稳定性提高 表观米氏常数增大 固定化酶活力回 收达到4 2 4 4 关键词 d 一氨基酸氧化酶 诱导表达 分离 纯化 固定化 a b s t r a c t a b s t r a c t r h eu s eo fi a c t o s ea sl n d u c e rs u b s t i t u t ei p t gf o re x p r e s s i o no fd a m i n oa c i d o x i d a s eg e n e d a a o i nt h er e c o m b i n a n te s c h e r i c h i ac o l i b l 2 1 d e 3 p w y 1 1 1 e i n f l u e n c e ss u c h 髂l a c t o s ec o n c e n t r a t i o n c e l ld e n s i t y t h et i m eo fi n d u c t i o n t h e i n d u c t i o nt e m p e r a t u r eo i le x p r e s s i o no ft h er e e o m b i n a mp r o t e i nw e r ei n v e s t i g a t e di n s h a k i n gf l a s k u n d e rt h ec o n d i t i o no ft h eo p t i c a ld e n s i t ya t6 0 0 h m r e a c h e da b o u t1 0 l a c t o s ec o n c e n t r a t i o nw a s1 0 9p e rl i t e r i n d u c e d6 ha t2 8 c t h ed a a oe n z y m e a c t i v i t yr e a c h e du pt o2 4 0 0 up e rl i t e r i n5 lf e r m e n t e r a n di n d u c t e dw i t hl a c t o s ea s i n d u c e ri n2 3 2 5 2 8 3 2 3 7 f o re x p r e s s i o nt oe s t a b l i s ht h eo p t i m u m i n d u c t e dt e m p e r a t u r ea c c o r d i n gt ot h ed a a oe n z y m ea c t i v i t yi nd i f f e r e n t t e m p e r a t u r e a d d e dt w ot i m e sl a c t o s a n du n d e rt h ec o n d i t i o no fl a c t o s ec o n c e n t r a t i o n w a sa i n d u c t e da b o u t2 2 ha t2 8 t h ed a a 0e n z y m ea c t i v i t yr e a c h e du pt o 3 7 8 4 3 2 u l c e l ld e n s i t y o d 6 0 0 r e a c h e dt o2 7 4 4 1 1 1 er e c o m b i n a n th i s t a g g e dd a a ow a so n e s t e pp u r i f i e db y 棚n i t yr e s i n e p i 一3 0 一a r g i d a c o t h ep u r i f i c a t i o nw a st e nf o l d sa n dt h ea c t i v i t yy i e l d w a s3 8 3 5 t h ed a a op r o t e i nw a sa n a l y z e db ys d s p a g et og e tm o r ep u 一 羚d a a o t h ei m m o b i l i z e dd a a oo l le u p e r g i tce x h i b i t e da ne n h a n c e m e n to f s t a b i l i t ya g a i n s tt h e r m a la n dp hi n a c t i v a t i o na sa ni n c r e a s e i n gi nt h ea p p a r e a m i c h a e l i s e o n s t a n t k i n t h ea c t i v r yy i e l do fi m m o b i l i z e dd a a ow a sa b o u t4 2 4 4 k e yw o r d s d a m i n oa c i do x i d a s e i n d u c t i o ne x p r e s s i o n s e p a r a t i o n p u r i f i c a t i o n i m n l o b i l i z a t i o n i i 第一章绪论 文中缩写 d a a o 7 a c a g l 7 a c a a c d a m i n oa c i do x i d a s e d 氨基酸氧化酶 7 a m i n o c e p h a l o s p o r a n i ca c i d 7 a c a 7 一氨基头孢烷酸 g l u t a r y l 7 a m i n o c e p h a l o s p o r a n i ea c i d 戊二酰一7 氨基头孢烷酸 i m m o b i l i z e dm e t a l c h e l a t e da f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y 固定化金属亲和层析 学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果 据我所知 除了文中特别加以标注和致谢的地 方外 论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果 也不包含 为获得直昌太堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料 与 我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确 的说明并表示谢意 学位论文作者签名 手写 3 j 4 每签字日期 扣1 年j 月 1 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解直昌盍堂有关保留 使用学位论文 的规定 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁 盘 允许论文被查阅和借阅 本人授权直昌盔堂可以将学位论文的全 部或部分内容编入有关数据库进行检索 可以采用影印 缩印或扫描 等复制手段保存 汇编本学位论文 同时授权中国科学技术信息研究 所将本学位论文收录到 中国学位论文全文数据库 并通过网络向 社会公众提供信息服务 保密的学位论文在解密后适用本授权书 学位论文作者签名 号4 乓 签字日期 1 0 年陋月u 日 导师签名 乏瑟 签字日期 7 年f 1 月协日 第一章绪论 第一章绪论 1 1d 氨基酸氧化酶的研究进展 d 氨基酸氧化酶 d a m i n oa c i do x i d a s e o x i d o r e d u c t a s e d a a o e c l 4 3 3 是一种以黄素腺嘌呤 f a d 为辅基的典型蛋白酶类 属于结构选择性催化剂 能够氧化d 型氨基酸中氨基基团脱氨生成相应的旷酮酸 因此 可被广泛用于d r 氨基酸的定性定量分析 生物传感器 l 一氨基酸和a 一酮酸的生产 l 然而 d a a o 更重要的价值是应用于两步法生产7 氨基头孢烷酸 7 a r n i n o c e p h a l o s p o r a n i ca c i d 7 a c a 1 2 1 被用于头孢菌素c c p c 的d a 氨基已二酰基侧链的氧化脱氨的第 一步反应 7 一氨基头孢烷酸是医药工业生产半合成头孢菌素抗生素的重要中间体 目前 主要用化学法和酶法生产7 a c a 化学法存在工艺复杂 成本高等问题 而且还 会严重污染环境 而酶法生产7 a c a 可以简化生产过程 例如 发酵得到的头孢 菌素c 不需要结晶就可以直接用于酶解反应 提高产品收率 降低成本和减少 污染 因此近年来人们着力开展酶法生产7 a c a 的研究 1 1 1d 氨基酸氧化酶的来源及其在自然界的分布 早期研究认为d 氨基酸氧化酶只是存在于真核生物细胞中 随着细菌基因 组测序和基因注释研究深入 人们发现某些细菌中有d a a o 早在6 0 多年前k r c b s 等首次在猪肾脏中发现酶的活性1 3 随着对d a a o 研究的迸展 结果表明d a a o 不仅存在鱼 猪 昆虫 鸟类和哺乳动物的肝 肾 脑等组织器官中 也存在 于藻类 c h l o r e l l av u l g a r i s 真菌 c e p h a l o s p o r i u ma c r e m o n i u m f u s a r i u m s o l a n i 酵母菌 c a n d i d at r o p i c a l i s t r i g o n o p s i sv a r i a b i l i s r h o d o t o r u l ag r a c i l i s 和细 菌 s t r e p t o m y c e sa v e r m i t i l i s m y c o b a c t e r i u mm b e r c u l o s i s a g r o b a c t e r i u m t u m e f a c i e n sc 5 8 等微生物中 见表1 1 2 第一章绪论 哺乳动物 藻类 真菌 酵母 细菌 p i g m o u s e r a b b i t c h l o r e l l av u l g a r i s c e p h a l o s p o r i u ma c r e m o n i u m n e u r o s p o r ac r a n s a f u s a r i u m 舢 o l a n i f o x y s p o r u m a s p e r g i l l u ss p 0 2 0 c a n d i d at r o p i c a l i s c b o i d i n i i t r i g o n o p s i sv a r i a b i l i s r h o d o t o r u l ag r a c i l i s r h o d o s p o r i d i u mt o r u l o i d e a l c a l i g e n e sd e n i t r i f y c a l 对不同来源的d 氨基酸氧化酶的序列分析表明 它们之问存在着一定程度 的同源性 种属越近 同源性越高 但在生化特性上存在明显差别 例如 哺 乳动物的d 氨基酸氧化酶与辅基f a d 的结合比较松散 辅基易于丢失而使d a a o 丧失活力 在底物利用方面 动物来源的d a a 0 对头孢菌素c 的氧化脱氨活力较 低 比较而言 某些酵母产生的d a a o 与f a d 有较强的结合度以及对c p c 侧链的 较高催化活性 4 1 1 2d 氨基酸氧化酶的生理功短及生物学特性 1 1 2 1 生理功能 d a a o 广泛分布于自然界中 在许多真核生物中都己发现了d a a o 包括酵 母 真菌 昆虫 两栖类 爬行类 鸟类和哺乳动物中 5 1 虽然d a a o 还未被很 好的分离出来 但有关d a a o 活性的研究已有一些新的报导 d a a o 存在于微生 物尤其是酵母中 这与它们可利用d 一氨基酸进行生长有关i d 一氨基酸在形成细 菌细胞壁的过程中也起了重要作用 它是构成肽聚糖和跑壁酸的戍分 因此 微生物和它们的一些产物是动物体内d 一氨基酸的重要来源 例如动物肠内的细 菌虽然不是很重要 但是外源d 一氨基酸的主要来源 然而 认为d 氨基酸在其 他环境下很少存在 有关高等动物体内内源d 一氨基酸的报导也非常少 而且多 集中于无脊椎动物 但是在核糖体调控蛋白质合成过程中d 氨基酸也不能被利 用 最近研究发现 d 一氨基酸在高等动物体内含量很少 但事实上 在组织细 艴 特别是肾脏和肝脏中 d a a o 被分离表达 除大鼠脑中的d 一丝氨酸外消旋酶 1 第一章绪论 能将l 型异构体转化为d 氨基酸外 其他动物体内还未发现有外消旋酶能将l 型异构体转化成d 型 因此 在高等动物体内的d a a o 生理等作用仍不是很清楚 虽然在体内代谢中 d a a o 能有效的作用于d 一氨基酸 但是在体内它应该不只是 起到代谢d 氨基酸的作用 然而 提高分析方法将有助于大大提高探索到一些 微量的d 氨基酸 g 气相色谱 g c 和高压液相色谱能够分离到d 氨基酸和l 型异构体 有助于提高d 氨基酸的代谢 1 9 8 7 年 p r e s t o n 利用d a a o 酶化验方法证明在海洋无脊椎动物组织中普遍存 在着d 氨基酸 在二腮吻沙蚕 g l y c e r ad i b r a n c h i a t e 中d 氨基酸的含量最高 最高达4 4 m m l l 而且还发现了一个特异的d 氨基酸传导系统 它能维持和累积 胞内游离的d 氨基酸 研究证明这些d 氨基酸有益于细胞代谢 不久后在哺乳 动物组织中发现了大量的d 氨基酸 例如 d a n i e l l o 等 1 1 认为在一些动物中 机体内的d a a o 和d 天门冬氨酸氧化酶 d a s p o 可以代谢外源的d 氨基酸 并产 生n h 和h 2 0 2 这和体外发生的反应是相同的 他们还发现d 一氨基酸与这两种氧 化酶之问的逆相关 推测出如果d 氨基酸不进行代谢产生堆积 可能会引起组 织的破坏 因此 他们认为动物机体内的d a a o 和d a s p o 可以代谢外源的d 一氨 基酸 对内源的d 氨基酸则起到一种解毒剂的作用 使得它们在机体生长过程 中不会发生积聚 在哺乳动物体内 天门冬氨酸和丝氨酸都发生着外消旋作用 随着时间的推移 它们外消旋产物的堆积会对机体起毒害作用 在生长过程中 食用微生物发酵和高酸度处理的食物也会提高体内d 氨基酸的含量f 1 2 l 在动物体内 d a a o 能作为解毒剂氧化外源的d 氨基酸 而在大鼠脑中d a a o 和内源d 丝氨酸之间存在着一种微妙的关系 在大鼠 老鼠和公牛的脑中已 发现了高浓度的d 一丝氨酸 1 3 d 4 l 近年来 对于大鼠大脑中游离d 丝氨酸的起源 和它所起的作用进行了广泛的研究 大脑中d 丝氨酸很有可能来源于食物的饮 用 因为d 一氨基酸和它的l 一异构体一样可以自由的通过血一脑屏障 之后与d a a o 发生反应 还有一种假设认为 大脑中的d 氨基酸是因为脑中l 广氨基酸发生 外消旋自发产生的 j 之后从大鼠脑中分离 克隆出一种特异性d 丝氨酸消旋 酶 证实了这种假设i lo l 1 9 9 5 年 s h e l l 等f f 8 哜 用高度特异性抗体将d 丝氨酸定位于大鼠前脑的多极 神经胶质中 d 一丝氨酸集中于n 甲基一d 天门冬氨酸 n m d a 附近的星细胞灰 质中 它作为内源配体与甘氨酸识别位点的感应器相连 d 丝氨酸的免疫定位 不仅与n m d a 的连接位点相关 而且与存在d a a o 的活性逆相关 d a a o 的位置 4 第一章绪论 与d 一丝氨酸几乎相反 实际i d a a o 集中于后脑和小脑的星细胞中 1 9 却 最近的 研究证实 d 丝氨酸在脑中起了神经传导的作用 d 从o 则起到了特殊的作用 在脑中负责控sf j d 一丝氨酸的含量 l 在治疗精神分裂症患者的安定药中加入了 d 一丝氨酸 正是利用了d a a o 和d 丝氨酸这种相互关系1 2 l 虽然这样减弱了 d a a o 代谢d 一氨基酸 但d a a o 活性也与一些疾病有关 特别是在患有慢性肾病 人中 他们血浆中d 苯丙氨酸和d 酪氨酸含量明显比健康人的高 2 2 1 1 2 2 生物学特性 尽管d a a o 广泛的存在于哺乳动物与真核生物中f 19 但大多数d a a o 还无法 进行分离纯化并研究其特征 1 9 7 3 年 猪肾d 氨基酸氧化酶 p k d a a o 成为第 一个提取获德的纯化黄素蛋白 2 1 4 年后从纤细红酵母中获得了第二种纯化的 d 氨基酸氧化酶 r g d a a o 2 5 1 这是从微生物中首次纯化得到黄素蛋白 之 后从三角酵母中分离得到了d 一氨基酸氧化酶 t v d a a o 并进行了特性研究 2 近几年来 d a a o 作为黄素蛋白的一种 对其催化机理 动力学和活性位点等 系列特征都进行了深入的研究 d a a o 属于黄素蛋白脱氢酶和氧化酶类的一个亚 群 它们在催化机理和一系列特征方面有很多相似之处 在哺乳动物基因组中 d 氨基酸氧化酶基因只存在单一拷贝 p k d a a o 的互 i d n a c d n a 已经完全克隆出来 并进行了测序 包含了1 0 4 1 个碱基对的开 放式阅读框编码酶的3 4 7 个氨基酸 通过p c r 技术已经克隆 啪 r g d a a o 的c d n a 全酶也在大肠杆菌中进行表达 编码整个蛋白的编码区包含了1 1 0 4 个碱基对 1 9 9 8 年 r g d a a o 的基因组i 9 1 0 序完成 通过对比c d n a 和基因组序列 证明在其 中含有5 个内含子 2 7 通过基因克隆 编码t v d a a o 的基因也分离出来网 它的 全酶包括了3 5 6 个氨基酸 在t v d a a o 的基因组中含有一个内含子 1 1 3d 氨基酸氧化酶的结构特性 p k d a a o 全酶包含了3 4 7 个氨基酸而且非共价结合了一个分子的f a d 分子 量为3 9 6 k d a f a d 脱辅基酶蛋白复合物的解离常数是2 2 x 1 0 7 2 9 在液体环境中 p k d a a o 全酶 脱辅基蛋白或苯甲酸盐复合物 i 9 1 是以二聚体甚至多聚体的 形式存在的 因为低聚体形式影响反应的活性 不同的d a a o 序列 包括d a s p o 中有6 个区域具有同源性 3 0 t 见图1 2 区域i 和i i i 同辅酶的结合有关 区域i 都含有保守序y j j g x g x x g l3 1 1 区域i i 和v 则包含了酶活性中心的氨基酸残 基 区域 是由s e r l y s 或者h i s l e u 构成的中止序列 弛 通过化学修饰法检测酶 5 第一章绪论 活性中心氨基酸残基的数量并对所有已知d a a o 序列进行比较 证明酶的活性中 心是由3 个氨基酸构成的 分别是t y r 2 2 4 t y r 2 2 8 丰 a r 9 2 8 3 3 0 哺乳动物的d a a o 有6 3 的相似度 表明了它们在功能和进化方面的相关性 以三种已知的含有 d a a o 基因的微生物纤细红酵母 尼g r a c i l i s 变异三角酵母 t v a r i a b i l i s 和镰 孢菌 f u s a r i u ms o l a n i d 为例 它们之间的相似性只有1 8 酵母的d a a o 和哺 乳动物的相似性达到了3 0 对s t r e p t o m y c e sc o e l i c o l o r 和s c h i z o s a c c h a r o m y c e s p o m b e 的同源蛋自序列进行比对 发现这两个同源序列的d a a o 与r g d a a o 的相 似性为3 0 而运两种蛋白缺失的生化特征并不能表明它们在功能上与d a a o 相 似或相关 r g d a a o 全酶二聚体的分子量为8 0 k d a 每个亚基包含3 6 8 个氨基酸并非共 价结合了一分子的f a d 分子量约为4 0 k d a 3 3 i 这种二聚体是非常稳定的 它与 酶的浓度无关 在该酶的s e r 3 0 8 l y s 3 2 1 所组成的结构里 含有一个其它d 氨基 酸氧化酶所不具有的带正电荷的额外片段 3 0 1 这个片段吐l g l y 3 1 3 a r 9 3 1 8 组成 极易被蛋白酶酶解 限制性蛋白水解酶r g d a a o 能生成一个单节显性 有缺口 的被缩短了的只有3 8 k d a 的活性酶 它含有两个多肽 分子量分别为3 4 k d a 和 5 k d a t 3 4 l g i y 3 1 3 a r 9 3 1 8 片段对于维持二聚体的稳定性是十分必要的 对于t v d a a o 的分子量 不同的文献给出的数据存在一定差别 p o l l e g i o n i 等 2 6 1 纯化得到n d a a 0 认为这个酶是个无糖基化的二聚体 每摩尔单位非共 价结合了一分子的f a d 分子量大约为3 8 k d a t 3 5 但将该t v d a a o 进行s d s 凝胶 电泳 得到的分子量为3 9 k d a 和之后s c h r a d e r 和a n d r e e s e n 得到的全酶的分子量 1 7 0 k d a 可能是四聚体 还是有很大不同的p 研究者认为这可能与蛋白的浓 度有关 因为在低蛋白浓度时 p k d a a o 的特异活性明显增加 有趣的是 利 用电融合方法测得t v d a a o 的等电点为5 1 3 7 然而p k d a a o 和r g d a a o 有两三 个不同的等电点 p k d a a o 的等电点分别为7 0 和7 2 而r g d a a o 的等电点则分 别为7 8 7 4 和7 2 1 1 4 d 氨基酸氧化酶的热稳定性和p h 稳定性 将p k d a a o r g d a a o 的重组酶以及t v d a a o 天然酶分别在不同温度下保温 3 0m i n 后比较残余酶活力 发现天然酶t v d a a o 热稳定性最好 3 8 1 p h 值变化对 d a a o 的稳定性影响较大 4 0 当p h 8 0 降到7 5 时 r g d a a o 的半衰期只有8h 而在相同时间内t v d a a o 活力只下降了1 0 t 3 9 6 第一章绪论 单聚体p k d a a o 二聚体的r g d a a o 和t v d a a o 在失活过程中存在不同机 制 p k d a a o 失活与酶浓度没有关系 当r g d a a o 的酶浓度从0 1 5 m g m l 下降到 0 0 5 m g m l 时 该酶半衰期从8 h 变成4 5 m i n 3 9 通过蛋白质工程技术将r g d a a o 突变成单体时 结果该酶热稳定性大幅降低 t m 值下降了5 6 c j 同样 t v d a a o 热稳定性也与酶浓度相关 在2 0 2 2 c p h 8 0 条件下 几 天内t v d a a o 活力会丧失 当温度上升至5 2 6 0 c 时 随着时间增加 t v d a a o 失活速率呈指数上升 3 9 l 7 第一章绪论 8 第一章绪论 图1 2 不同来源的d a a o 结构序列比较 f i g 1 2c o m p a r i s o no f t h ep r i m a r y s t r u c t u r eo f d a a o sf r o ms i g n i f i c a t i v es o u r c e s a l l l i s t e dd a a o s e x c e p tt h o s ef r o ms c o e t i c o l o ra n df r o ms p o m b e h a v eb e e n c h a r a c t e r i z e d r e d i d e n t i t y b l u e h i g hs i m i l a r i t y g r e e n l o ws i m i l a r i t y b l a c k d i f f e r e n c e 1 1 5d 氨基酸氧化酶的催化机理 d 一氨基酸氧化酶可氧化氨基酸的氨基生成相应的酮酸和氨 这一反应必须 在f a d 的参与下进行 反应过程分为三个步骤 r c h n h 2c o o h e f a d r c n h c o o h e f a d h 2 1 e f a d h 2 0 2 e f a d h 2 0 2 2 r c n h c o o h h 2 0 r c o c 0 0 h n h 3 3 反应 1 为不完全还原反应 d 一氨基酸脱氧成为相应的亚氨基酸 并与还原性的 f a d 结合 这一步是整个反应中唯一的酶促反应 反应 2 中 在有分子氧存在 的条件下 还原性的f a d 重新被氧化 并将氧转化成为过氧化氢 反应 3 q h 亚氨基酸在没有酶的情况下水解成为n 一酮酸和氨 2 引 但当体内有过氧化氢存在 时 c c 酮酸发生脱羧产生相应的酸 人们对d 氨基酸氧化酶催化机理的认识水平是随着对该酶的生理生化和结 构方面的研究而逐渐深入的 1 9 8 0 年前后 m a s s e y t 4 1 l 采l m i o r a r t 4 2 等分别提出了 碳负离子机制 c a r b a n i o n m e c h a n i s m 和 协同机制 c o n c e r t e d m e c h a n i s m 但都尚难对d a a o 确切的催化反应机制做出结论 不过有研究者提出d a a o 对 d 氨基酸的氧化脱氨反应机制可能随着氨基酸所带侧链的不同而异 4 3 1 当以中 性侧链 尤其是疏水侧链的d 氨基酸为底物时 d a a o 的催化效率最高 该酶催 化极性侧链或芳香环侧链的d 氨基酸脱氨效率比较低 d a a o 对带正电荷侧链的 d 一氨基酸呈现更低的催化效率 1 1 6d 氨基酸氧化酶的底物特异性 不同来源的d a a o 有着自己的特异性底物 为了方便比较 以过氧化氢酶和 邻联二茴香胺结合产生的过氧化氢的量测定d a a o 活力1 4 4 t v d a a o 的最适底 物是d v a l r g d a a o 的最适底物是d m e t p k d a a o 的最适底物d p r o l i n e t 4 4 1 而来自c b o i d i n i i 的d a a o 最适底物是d a l a 4 5 1 比较不同来源的d a a o 发现t v d a a o 对c p c 有较高亲和性 这样更适合 7 a c a 酶法生产的工业应用 在3 7 c p h8 0 0 2 1m l v l 氧气条件下 以d p h e 9 第一章绪论 d m e t c p c 和d a l a 作为底物测定n d a a 0 的k m 值分别是0 2 0 2 9 o 8 3 和6 5 m m 舶 表1 3 表1 3 不同来源的d a a o 性质差别 t a b i e l 3c h a r a c t e r i s t i c so f d a a of r o md i f f e r e n ts o u r c e s 参数pkdaaor g d a a o t v d a a o 单亚基氨基酸数量3 4 7 3 6 83 5 6 亚基分子量 k d a3 9 64 0 03 9 3 等电点 p i 7 0 7 27 2 7 4 7 8 5 1 活性状态单体 f a d 同源二聚体 2 f a d同源二聚体 2 f a d f a d 分离常数 k d m2 2 x 1 0 7 2 1 0 8 1 1 7 三角酵母的d 氨基酸氧化酶 虽然d 氨基酸氧化酶大量存在于哺乳动物中肝 肾等器官中 早期也曾以 猪肾为材料进行酶的提取 并用于 酮酸的制备 但随着d a a o 在两步酶法生产 7 一氨基头孢烷酸工艺中的应用 近年来 人们更加关注微生物产酶的研究 1 1 7 1 生长和产酶 先后被研究的d a a o 产酶微生物有变异三角酵母 t r i g o n o p s isv a r i a b i l i s 纤细红酵母 r h o d o t o n d a g r a c i l i s 胶粘红酵母 r h o d o t o r u l a g l u t i n i s 假丝酵母 c a n d i d a 在所有这些被研究的微生物中 d 一氨基酸氧化酶的合成均与培养基 中添加的诱导物的诱导作用直接相关 常用的诱导物是d 甲硫氨酸和d 丙氨酸 b e r g 等 4 7 l 发现d 丙氨酸可使d a a o 产量增加5 6 倍 h o m e r 等为提高三角酵母的 d a a o 产酶水平 曾对一些诱导物做过筛选 4 引 发现尽管d 丙氨酸常被使用 但分别将n 氨甲酰基 d 丙氨酸 n 乙酰基 d 一色氨酸和n 氨甲酰基一d 廿氨基丁 酸加入到培养基中时 这三种化合物诱导d a a o 的产量比d 丙氨酸分别高出4 2 倍 2 1 倍 1 5 倍 r h g r a c i l i s 的d 氨基酸氧化酶的合成 亦需要有耽丙氨酸的 诱导 4 9 有关诱导物对d a a o 产量的诱导机制 迄今还未得到阐明 和所有微生物发酵一样 不同的d a a o 产酶菌株有各自最优化的产酶发酵条 件 由于不同研究者测定d 氨基酸氧化酶所用的反应底物不一样 因此 各实 验室所得d a a o 的确切产值缺乏可比性 h u h e r 等进行三角酵母发酵时 添加1 8 d l 甲硫氨酸 细胞生物量达到2 2 0 9 l 1 湿重 以c p c 为反应底物 高效液相色 谱法对转化反应进行检测 d a a o 的活力单位为7 0 0 0 ur l o 1 0 第一章绪论 1 1 7 2 分离纯化 1 p h e n y l s e p h a r o s ec l 4 b 和d e a e c e l l u l o s ed e 5 2 两步疏水色谱柱分离d a a o 不论d 一氨基酸氧化酶本身的生物化学特性研究 还是酶的实际应用均需对 酶蛋白进行提取和不同程度的纯化 s z w a j e e r 等t 5 0 曾用比较简便的方法对三角酵 母的d 一氨基酸氧化酶提取和纯化做过实验室研究 所用三角酵母湿细胞3 2g 细 胞经干冰冻融 离心获得的无细胞上清液 在5 0 加热1 0 m i n 以沉淀除去部分蛋 白 再经硫酸铵 3 0 5 8 沉淀和0 1t o o l l n a a cp h 值4 6 下透析1 2h 的等电点 沉淀 即可获得电泳纯的d a a o 酶溶液 样品被纯化3 9 倍 比活力5 9u m 9 1 得率4 0 d e s h p a n d e 等则在上述纯化得到硫酸铵沉淀后 改用p h e n y l s e p h a r o s ec l 4 b 和d e a e c e l l u l o s e d e 5 2 两步疏水色谱柱分离 使d a a o t l 活力达至t 2 3 8u m g 1 总收率3 0 2 亲和柱层析纯化d 氨基酸氧化酶 在d 氨基酸氧化酶的n 端接上6 个h i s 就可采用h i s t a g 柱一步纯化d 氨基 酸氧化酶 1 9 7 8 年 h o c h u l i 等在目标蛋白质的末端接上六聚组氨酸多肽成功得 到纯化的重组蛋白质 此后六个组氨酸标记广泛用于重组蛋白质的纯化 尤其 是近年来 原核生物表达的重组蛋白质已有5 0 以上都是末端接上六聚组氨酸多 肽被纯化出来 5 1 f a n t i n a t o 等在大肠杆菌中表达了来源于r h g r a c i l i s 的d 一氨基酸 氧化酶 并且在n 端接上了6 个h i s 表达的d a a o 蛋白都以全酶形式存在 辅基 f a d 与原酶结合得很紧密 采用金属螫合物柱层析分离d a a o 是一个高效方法 能很好地去除杂酶 避免在c p c 转化反应中产生副反应 提高c p c 转化为 g i 7 a c a 的转化率 3 6 1 固定化金属螯合物柱层析是基于蛋白质表面氨基酸与固定化会属离子的亲 和力不同对蛋白质进行的分离 出于蛋白质表面裸露氨基酸的残基不同 其与 金属离子的亲和力就有差别 过渡金属离子能与电子供体氮 硫 氧等原子以 配位键结合 金属离子上没有配对的电子是电子供体的配位点 在溶液中被水 分子或阴离子占据 当蛋白质表面氨基酸残基与金属离子的结合力比水分子或 阴离子更强时 则蛋白质取代它们与金属离子形成复合物 从而使生物分子被 吸附 1 1 8d 一氨基酸氧化酶的基因克隆和序列分析 第一章绪论 由于d 一氨基酸氧化酶的重要应用价值 推动了该酶的分子生物学研究 自 1 9 8 7 年克隆猪肾d 氨基酸氧化酶基因以来 人 兔 鼠等哺乳动物的d a a o 基因 相继被克隆 一些被用于d l 氨基酸拆分 一酮酸和7 一a c a 酶法生产的低等真核 生物的d 氨基酸氧化酶基因也先后被分离鉴定 其中链孢霉的d a a o 基因最早克 隆获得 近三年来 先后完成了变异三角酵母 纤细红酵母 胶粘红酵母 博 依丁假丝酵母的d a a o 基因克隆和序列分析 对低等真核生物d 氨基酸氧化酶基因进行分析 发现都存在有内含子性质 的d n a 序列 这是真核基因的典型结构 l i a o 等晡2 j 从胶粘红酵母克隆得到的 d a a o 基因含有3 个内含子序列 长度为5 6 1 0 9 b p 这些内含子在数量和大小上 都与真菌结构基因的特点相一致 遵循g t a t 法则可以形成套索结构的链孢霉 共有序列 虽然在变异三角酵母d a a o 基因的5 端起始密码子下游第2 2 个碱基丌 始 存在一个4 2 b p 的内含子状序列 但是并不遵循酵母结构基因的外显子和内 含子连接部位序列应有的g t a t 法则 也缺乏剪切内含子时形成套索结构所必 需的结构元件 即链孢霉共有序列 因此 变异三角酵母的d a a o 基因中的这一 内含子状序列是非典型的 哺乳动物的d a a o 基因中也发现有内含子序列 1 2d 氨基酸氧化酶基因的表达 鉴于d 一氨基酸氧化酶基因在生物工程中的良好应用前景 研究者不仅对几 种微生物的d a a o 基因进行了克隆 测序等分子生物学研究 而且考察了这些基 因在不同表达系统中的表达 以寻找构建理想的基因工程菌 实现d 氨基酸氧 化酶基因的高效表达和酶的有效生产 1 2 1 大肠杆菌 e s c h e r i c h i ac o l i 基因工程技术在实践中最主要的应用是生产其它方法无法获得的物质 如 人体胰岛素 在基因工程技术出现之前无法大量得到 而现在人们利用基因工 程技术可以大量获得 目前工业生产中使用最多的工程菌为大肠杆菌 利用大 肠杆菌生产蛋白质的基本过程是先将目的基因插入到合适的质粒中 再将质粒 转化至大肠杆菌中 培养大肠杆菌 将目的蛋白从大肠杆菌中提取出来 大肠杆菌中重组基因的表达方式有组成型表达和诱导型表达 组成型表达 无需诱导即可表达 但是由于外源蛋白过早表达而导致菌体的正常生长受到影 响 很难达到高密度发酵 诱导型表达有温度诱导和化学诱导 温度诱导3 4 h 即可达到最大表达量 菌体也基本上停止生长 利用l a c 启动子用口t g 诱导8 l o h 1 2 第一章绪论 菌体还在生长 故化学诱导比温度诱导更易达到高密度发酵 1 9 8 8 年 m o l l a 等从纤细红酵母克隆获得编码d 一氨基酸氧化酶的1 2k bc d n a 后 将其插入到表达载体p t 7 7 的多克隆位点的e c o ri 的酶切位置上 得到重组 质 立 p t 7 d a a o d a a o 编码基因的表达黄于t 7 r n a 聚合酶启动子的控制下 这 一重组质粒转化大肠杆菌宿主b l 2 1 d e 3 p l y s s 后 在最适条件下的产酶水平为 2 3 0 0 u l 发酵液 1 5 3 1 近几年 清华大学罗晖等f 5 4 从三角酵母中提取总r n a 反转录后进行p c r 扩增 得到d a a 0 基因 并将其克隆到大肠杆菌表达载体p e t 一2 8 a 经筛选得到 重组b l 2 1 d e 3 p e t d a a o 对重组大肠杆菌中的d 一氨基酸氧化酶进行透导表 达 结果表明 在2 8 c 菌浓 o d 6 0 0 1 0 i p t g 浓度1 m m o l l 时 d a a o 酶活最 高达2 3 3u m l 表达产物在大肠杆菌内有三种归宿 第一种是形成稳定的天然构象 可溶 且有活性 不易被降解 第二 蛋白可溶 但构象为非天然状态 易被胞内的 各种蛋白酶降解 第三 多肽链间彼此聚集形成不可溶的包含体 并且有蛋白 酶抗性 所以根据不同需要在研究过程中选择那一条途径非常重要 它对下游 工艺起决定性作用 1 2 2 巴斯德毕赤酵母 p i c h i a p a s t o r i s 酵母菌也常被用于异源真核基因的表达 但尚未见到利用三角酵母和红酵 母作为外源基因表达的宿主细胞 2 0 世纪8 0 年代i n v i t r o g e n 公司成功开发的p i c h i ap a s t o r i s 甲醇酵母表达系统为 一种真核表达系统 能在甲醇为唯一碳源的培养基上生长 它含有独特的醇氧 化酶基因的启动子 用甲醇可严格地调控表达外源基因 甲醇能诱导其表达甲 醇代谢所需的酶 如a o x 二羟丙酮合成酶 d h a s 和过氧化氢酶 c a t a l a s e 表达的a o x 和d h a s 的含量甚至可达到总细胞蛋白的6 0 8 0 而以葡萄糖 甘 油或乙醇为碳源时 a o x 几乎不表达 a o x 的合成是在转录水平调控的 其基 因启动子为诱导型 大多毕赤酵母表达宿主菌是通过野生型石油酵母y 11 4 3 0 进行突变改造而来 的 宿主菌在组氨酸脱氢酶基因 h i s 4 处有一突变 用于转化后筛选重组菌株 目前主要有3 种表达宿主菌 它们之间的区别在于a o x1 个或2 个基因的缺失 而造成对甲醇利用能力高低的变化 最常用的宿主菌为g s l1 5 h i s 4 它含a o x 1 3 第一章绪论 1 和a o x2 基因 在含甲醇的培养基上以野生型速率生长 k m 7 1 宿主菌的a o xl 己被酿酒酵母的a r g 4 所代替 因此只有依赖a o x 2 基因合成a o x 在甲醇中低 速度生长 第3 种宿主菌m c l 0 0 3 的2 个a o x 基因都被去除 不能在含甲醇的培养 基土生长 上述宿主菌经过进一步改造 还可缛到其他衔尘的宿主菌 目前已 有十几种不同的基因型 s m d l l 6 3 h i s 4p e p 4p r b l s m d l l 6 5 h i s 4p r 鲫和 s m d l l 6 8 h i s 4p e p 4 是最近开发的一类蛋白酶缺失的宿主菌 可减少表达外源 蛋白的降解阀 w e i s s 等 5 5 利用蛋白酶缺陷型菌株表达5 一h t 5 a 受体蛋白 蛋白表 达量成倍增加 外源基因以不同拷贝数整合到毕赤酵母基因组d n a 中 可稳定复制 不易 丢失 外源基因通常插入到57 a o x 和3 a o x 因而在控制下表达 为了提高重 缨蕴的稳定性 巴斯德毕赤酵母表达载体通过基因置换或基因插入 同源重组 整合到宿主染色体基因组座位上 基因插入未破坏宿主的a o x 称m u t m e t h a n o l u t i l i z a t i o nf a s t 基因置换使a o x 结构基因被外源基因表达盒所替换 因而使宿 主失去大部分利用甲醇的能力 称m u t m e t h a n o lu t i l i z a t i o ns l o w 毕赤酵母中存在一种被称为微体的细胞器 其中大量合成过氧化物酶 因 此称为过氧化物酶体 甲醇代谢的第一步就是在过氧化物酶体中进行的 见图 1 4 这样可以避免甲醇在a o x 催化下产生的h 2 0 2 对细胞的毒害 合成的蛋白 质贮存于微体率 可免受蛋自酶的降解 亦不会对细腱产生毒害 c h 3 0 h 图1 4 巴斯德毕赤酵母甲醇利用途径 f i g 1 4t h ep a t ho f m e t h a n o lu t i l i z e di np i c h i a p a s t o r i s p g a p 三磷酸甘油醛脱氢酶启动子 是最近在巴斯德毕赤酵母中克隆到的一 1 4 第一章绪论 个组成型启动子 在它控制下的基因表达率比甲醇诱导下的以p o x 启动的产量 更高1 5 引 由于该组成型启动予不需甲醇诱导 发酵工艺更简单 产量更高 所 以成为替代p a o x 的最有潜力的启动子 复旦大学的冯美卿等1