青蒿琥酯联合甲氨蝶呤对类风湿关节炎滑膜细胞增殖和凋亡的影响.pdf

药物研究 2 0 1 0 年第1 9 卷第l 3 期 青蒿琥酯联合甲氨蝶呤对类风湿关节炎滑膜细胞增殖和凋亡的影响 李燕 周京国 张勇 1 中国人 民解放军第4 5 2医院风湿免疫科 四川 成都6 1 0 0 2 1 2 川北医学院附属 医院 四川 南充6 3 7 0 0 0 3 成都经济技术学校 四川 成都6 1 0 1 0 6 摘要 目的 观察不同浓度的青蒿琥酯 A R T 和甲氨蝶呤 M T X 对类风湿关节炎 R A 滑膜细胞增殖和凋亡的影响 方法 收集 R A关节 液标本 2 5例 体外分离培养滑膜细胞 以生长良好的 3 5代滑膜细胞进行试验 调整细胞浓度 分为对照组和不同质量浓度 A R T组 M T X组 用四甲基偶 氮唑盐 比色法测 定不同质 量浓度的 M T X和 A R T单独或联合作 用于滑膜 细胞 对滑膜细胞增殖的影响 用流式细胞 术检测不 同质量浓度 的 MT X和 A R T单独或联合作 用于滑膜细胞对 滑膜 细胞 凋亡的影响 结果 A R T对 滑膜 细胞 的增殖具有显著的抑 制作用 A R T质量浓度在 3 1 2 5 5 0 I x g m L范围内均可抑制 R A滑膜细胞生长 且抑制作用随质量浓度增大而增强 具有剂量依赖性 A R T 1 2 5 g m L MT X 2 0 g m L组的抑制作 用最强 与其他药物组 比较 P 0 0 5 各药物作用于滑膜 细胞 2 4 h后 早期凋亡细胞率与 对照组 比较 有显著差异 P 0 0 5 A R T质量浓度在 3 1 2 5 2 5 g mL范围 内作用于滑膜细胞 2 4 h后 早期 凋亡细胞率与未用 A R T处 理 的对照组比较 有显著差异 P 0 0 5 并呈剂量依赖性 3 A R T的质量浓度达到 5 0 g m L时 早期 凋亡细胞率降低 坏死细胞 率却升 高 P 0 0 5 A R T 1 2 5 g m L M T X 5 g m L组的 早期 凋亡 细胞率较 其他 药物 组显 著升 高 P 0 0 5 而坏死 细胞 率却较低 P 0 0 5 结论 A R T和 M T X单独或联合作用均可显著抑制 R A滑膜细胞的增 殖 诱导其凋亡 关键词 类风湿关节炎 滑膜细胞 增殖 凋 亡 青蒿琥酯 甲氨蝶 呤 中图分类号 R 9 6 5 R 9 7 1 1 文献标识码 A 文章编号 1 0 0 6 4 9 3 1 2 0 1 0 1 3 0 0 1 6 0 3 Effe c t o f Di ffe r e n t Co n c e n t r a t i o n s o f Ar t e s u n a t e a n d Me t h o t r e x a t e o n S y n o v i o c y t e s o f Rh e u ma t o i d Ar t h r i t i s L i Y a n Z h o u J i n g g u o z Zh a n g Y o n f J D e p a r t m e n t o f R h e u ma t is m a n d I m mu n o l o g y 4 5 2 Ho s p i t a l of P L A C h e n g d u S ic h u a n C h i n a 6 1 0 0 2 1 2 0 S i c h u a n Me d i c a l C o l l e g e N a n c h o n g S ic h u a n C h i n a 6 3 7 0 0 0 3 C h e n g d u E c o n o m i c a nd T e c h n ic a l C o l l e g e C h e n g d u S w h u a n C h i n a 6 1 0 1 0 6 A b s t r a d O b j e c t i v e T o c o m p a r e t h e e f f e c t s o f d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s o f a r t e s u n a t e A R T a n d m e t h o t r e x a t e MT X O H t h e p r o l i f e r a t i o n a n d a p o p t o s i s o f fi b r o b l a s t l i k e s y n o v i o c y t e s F L S Me t h o d s 2 5 s a m p l e s o f j o i n t fl u i d i n r h e u m a t o i d a r t h r i t i s w e r e c o l l e c t e d F L S w e r e i s o l a t e d a n d c u h u r e d i n v i t r o F L S we r e i n c u b a t e d w i t h d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s o f ART a n d MT X r e s p e c t i v e l y o r c o mb i n e d f o r 2 4 h MT I wa s a p pl i e d t o de t e c t t h e i n hi b i t i o n r a t i o o n t h e g r o wt h o f FL S FLS we r e i n c u b a t e d wi t h 3 1 2 5 5 0 g mL ART for 2 4 h a nd i n c u ba t e d wi t h l 2 5 I g mL ART 2 0 g mL MT X 5 L g mL MTX ART 2 0 Ix g mL MTX ART 5 g mL MT X f o r 2 4 h Th e flo w c y t o me t r y wa s a p pl i e d t o d e t e c t t h e a pep t o s i s o f F L S Re s u l t s ART and MT X h a d t h e d i f f e r e n t e f f e c t s o n F L S p r o l i f e r a t i o n t h e d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s o f ART a n d M T X p r e s e n t e d r e m a r k a b l e i n h i b i t o r y a c t i o n o n F L S p r o l i f e r a t i o n c o m p a ri n g w i t h t h e c o n t r o l l e d gro u p s P 0 0 5 a n d t h e i n h i b i t i o n r a t i o o f AR T a p p e a r e d t o b e i n a d o s a g e d e p e n d e n t ma n n e r a t t h e c o n c e n t r a t i o n r a n g i n g f r o m 3 1 2 5 5 0 W g mL Wh i l e A RT 1 2 5 g mL 2 0 g m L MT X p r e s e n t e d t h e m o s t s i g n i fi c a n t l y i n h i b i t o r y a c t i o n o n F L S p r o l i f e r a t i o n c o m p a r i n g w i t h o t h e r g r o u p s P 0 0 5 T o m a k e t h e d i ff e r e n t e f f e c t s o n F L S a p o p t o s i s t h e d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s o f AR T an d MT X w e r e f o u n d t o p r o mo t e a p o p t o s i s o n F I S T h e a p o p t o s i s rat i o o f F L S w a s m a r k e d l y i n c r e a s e d c o m p are d w i t h t h e c o n t r o l l e d g r o u p P 0 0 5 Mo r e o v e r A R T a p p e a r e d t o b e i n a d o s a g e d e p e n d e n t ma n n e r a t t h e c o n c e n t r a t i o n ran g i n g f r o m 3 1 2 5 2 5 g mL wh i l e t h e a p o p t o s i s e f f e c t o f AR T 1 2 5 g g mL MT X 5 x g mL w e r e a pp e a r e d s i gn i fi c a n t l y Con c l u s i o n The e ffe c t s o f ART a n d MTX a r e r e ma r k a b l e o n t he pa t i e n t s wi t h r h e uma t o i d a rth ritis T he me c ha n i s m o f a c t i o n ma y b e r e a l i z e d t h r o u g h i n hi b i t i ng FL S p r o l i f e r a t i o n an d a d v a n c i n g F LS a p o p t o s i s Ke y wo r ds r h e uma t o i d a r t h r i t i s s y n o v i o c y t e s p r o l i f e r a t i o n a p o p t o s i s me t h o t r e x a t e a r t e s u n a t e 青蒿 的有效成分青蒿素 的还原产物双氢青蒿素可以合成青蒿 琥酯 a r t e s u n a t e A R T 和蒿 甲醚两种衍生物 其 中 A R T具有抗疟 抗血管增 生 抗炎 抗肿瘤及广泛 的免疫调节作用 甲氨蝶呤 M T X 是目前使用较为广泛的改善病情的抗风湿药 D MA R D 之一 为了 进一步明确 A R T和 MT X对类 风湿关节炎 r h e u ma t o i d a r t h ri t i s R A 的作用靶点 评价两者在 R A治疗中的作用和地位 笔者着重探讨 了不 同质量浓 度的 A R T和 M T X对 R A滑 膜细胞 的影响 对 A R T 和 MT X抑制滑膜细胞增殖和诱导 R A滑膜细胞凋亡的规律进行 了 体外观察 现报道如下 1 资料与方法 1 1 实验材料 选取 2 0 0 7年 3月至 1 O月在川j E 医学院附属医院风湿科就诊 且有膝关节积液的R A患者 2 5例 其中男 8 例 女 l 7例 年龄 2 0 6 7岁 平均 4 1 岁 病程 6月至 l 8年 平均 7 4年 所有患者的诊断 均符合美国风湿病学会 1 9 8 7年的 R A诊断标准 且近 1 月内未用 l 6 过 D M A R D和激素 胎 牛血 清 杭州 四季青 生物工 程材料 有限公 司 青蒿琥酯注射液 桂林南药股份有 限公司 规格为 6 0 m g 支 甲氨蝶 呤注射液 浙江万马药业有限公司 规 格为 5 mg 支 胰蛋 白酶 S i g m a 公 司 四甲基偶 氮唑盐 M T I 上 海吉泰生物科技有限 公 司 二 甲基亚 砜 D MS O 成都市联 合化工 试剂研究所 D ME M 培养基 G i b c o B R L公司 A n n e x i n V F I T C试剂盒 广州市长瑞 生物技术有 限公 司 3 M型 C O 恒温 培养箱 B X 7 1 型倒置相差显 微镜 B e n c h m ark型酶标仪 H F S A F E一1 2 0型超净工作 台 牛堡 氏计 数板 F A C S C al i b u r 流式 细 胞仪 美 国 B e c t o n D i c k i n s o n公 司 Q L一9 0 0 1 型快速平板振荡器 1 2 方法 1 2 1 滑膜细胞 的分 离与培养 无菌抽 取关节液 3 0 m L左 右 肝 素抗 凝 抽取关节液前 预先 按摩关节局部数次 将关节液以 1 0 0 0 r m i n离心 1 0 m i n 弃上清 液 H a n k s 液洗 细胞 3次 加入含 2 0 胎牛血 清的 D ME M培养液 中国药业 C h i n a P h a r ma c e u t i c a l s 2 0 1 0年第 l 9卷第 1 3 期 含青霉素 1 0 0 U m L 链霉 素 1 0 0 g m L 置细胞于无 菌培养瓶 中 5 C O z 饱 和湿度培养箱 中培养 2 3 d分别换液 1 次 即可除 去未贴壁的单个核细胞及红细胞 培养 2 3 d后 可见树突状及成 纤维状滑膜细胞生长 并混有大量巨噬细胞 经消化 传代后 得到 纯化的滑膜细胞 将 3 5代滑膜细胞 用于实验 不同的实验采用 不 同的细胞浓度和培养器皿 每天观察细胞 生长情况 1 2 2 NT r法测定 药物对滑膜细胞增殖 的抑制作用 取对数生长期细胞 按细胞浓度为 1 X 1 o 5 m L每孑 L 接种 1 0 0 L 于 9 6孑 L 培养板 3 4 h细胞贴壁 后补液至 2 0 0 L 培养 2 4 h后 吸弃悬浮细胞 每孑 L 分别加入 3 1 2 5 6 2 5 1 2 5 2 5 5 0 g m L的 A R T 5 g mL的 M T X 2 0 g m L的 M T X 1 2 5 g m L的 A R T 5 g m L的 M T X 1 2 5 m L的 A R T 2 0 g m L的 N T X 共 9个 组 分别 处理 滑膜 细胞 4 8 h 各 组设 3个复孔 另设对照组加 入不 含药物 的 D ME N培养液 终止培养前 4 h 小 心吸弃细胞上清液 每 孔加入 2 0 LM T I 和不含胎牛血清的 D ME M 1 8 0 在 3 7 条件 下继续孵育 4 h后吸弃培养液 每孔加入 1 5 0 D MS O 在平板振 荡仪上振荡 1 0 m i n使结晶物充 分溶解 在酶标仪上测定 5 7 0 n m波 长处各孔 的吸光度值 以每组 3个 孔的均值 作为结果 计算抑制 率 抑制率 对照组吸光度值 一 药物组吸光度值 对照组吸光度 值 1 0 0 重复 4次 结果用 s 表示 1 2 3 流式细胞术检测滑膜细胞凋亡率 取 对数生长期细胞 按细胞浓度为 2 X 1 0 mL每孔接种 1 m L 于 6 孑 L 培养板 3 4 h细胞贴壁后补液至 2m L 培养 2 4 h后 吸弃 悬浮细胞 每孔分别加入 3 1 2 5 6 2 5 1 2 5 2 5 5 0 g m L的 A R T 5 g m L的 M T X 2 0 g m L的 M T X 1 2 5 g m L的 A R T 5 g m L 的 MT X 1 2 5 g m L的 A R T 2 0 g m L的 MT X 共 9个 组 分 别处理滑膜 细胞 2 4 h 吸弃 上清液 收集 细胞 重悬 于离心 管 中 1 5 0 0 r ra i n离心 5 ra i n 用 缓 冲液悬 浮细胞 制备 细胞悬液 向悬 液 中加 入 5 A n n e x i n V F I T C和 1 0 碘化 丙啶 P I 混 匀 室 温避光孵育 5 m i n 流式细胞仪检测细胞凋亡率 重复 4次 结果用 s 表示 1 3统计学处理 用S P S S 1 1 5 统计软件分析 计量资料以均数 标准差 s 表示 选择双侧 P 0 0 5作为检验水准 采用单因素方差分析 2 结果 2 1 不同质量浓度药物对 R A滑膜细胞 生长 的影响 由表 1 可 见 不 同质量浓 度的 A R T处理滑膜细胞 2 4 h后 随 着质量浓度的增高 其 抑制作用增强 并存在着一定 的量效 关系 与对照组 比较 各药物组对滑膜细胞 的增殖均有显著 的抑制作用 其中N T X 2 0 g m L A R T 1 2 5 g mL 组较其他药物组对滑膜细 胞 的抑制作用最强 P 0 0 5 表 1 不同质量浓度 药物组对 R A滑膜细胞 生长 的影响 中国药业 C h i n a P h a r ma c e u t i c a l s 药物研究 2 2 各药物组诱导 R A滑膜 细胞凋亡情况 A n n e x i n V F I T C细胞 凋亡检 测试剂盒 能使早期 凋亡细胞 与 A n n e x i n V荧光标 记物 特异性结 合 P I 染 色则从 中 区分 出坏死细 胞 根据 阴性对照所设定的荧光正常界限 将滑膜细胞分为正 常活 细胞 荧光双 阴性 细胞 又称活细胞 A n n e x i n 一 P I 一 左下象 限 早 期凋 亡 细胞 A n n e x i n P I 一 右下 象 限 坏 死细 胞 A n n e x i n P l 右 上 象 限 由 图 1和表 2可 见 A R T在 3 1 2 5 2 5 g m L范围时 随剂量增加 早期凋亡细胞率逐渐升 高 与对照组 比较有显著差异 F 1 6 9 3 8 5 P 0 O 5 当 A R T达到 5 0 g m L时 早期凋亡细胞率反而降低 而坏死细胞率却升高 A 对 照 组 B AR T3 1 2 5 g mL C A R T6 2 5 g m L D ART 1 2 5 g mL E ART 2 5 g mL F ART 5 0 g mL 图 1 不同质量浓度 A R T处理滑膜细胞2 4 h 流式图像 表 2 不同质量浓度 A R T作用滑膜细胞 2 4 h后的早期凋亡率 5 组别 早期凋亡率 组别 早期凋亡率 对照组 o 9 2 0 2 8 AR T1 2 5 g mL组31 9 5 2 7 0 ART 3 1 2 5 g mL组 6 3 1 0 5 9 AR T2 5 g mL组 5 3 1 3 1 2 4 ART6 2 5 g mL组 l 6 5 7 0 5 2 AR T 5 0 g mL组 3 0 9 9 1 9 1 注 与对照组比较 P 0 0 5 不同质量浓度的药物分别处理 R A滑膜细胞 2 4 h后 用流式 细 胞术 定量 分 析 活细 胞 早期 凋亡 细胞和坏死 细胞 的百 分 率 转化 为几 率 单 位表示 由图 2和表 3结 果可 见 对 照组 活 细胞 率 最高 MT X 5 g m L A R T 1 2 5 g m L组 早 期 凋 亡 细胞率最高 与对照组比较 有显 著差异 F 7 1 4 4 3 5 P O 0 5 M T X 2 0 g mL A R T1 2 5 g m L组的坏死 图2 各药物组滑膜细胞凋亡情况 表 3 各用药组与对照组的早期凋亡细胞 坏死细胞和活细胞百分比 注 与时照组比较 P 0 0 5 1 7 药物研究 细胞率最高 与对照组细胞 比较有显著差异 F 3 8 6 9 0 3 P O 0 5 3 讨论 R A的基 本病理改变为滑膜炎 关节的活动性炎症 导致滑膜细 胞的过度增殖 滑膜细胞表达各种炎症 因子 和趋化 因子 分泌基质 金属蛋 白酶 花生 四烯 酸代 谢产物等 募集炎症细胞 触发炎症应 答 导致软骨 和骨质破坏 因此 滑膜细胞 的过度增 殖对血管翳形 成和进行性软骨 骨质的侵蚀发挥重要作用 滑膜细胞增殖失 控和凋亡抑制是 R A发生的主要原因 过度增殖源于凋亡的相对不 足 3 J 因此 抑制滑膜细胞增殖 诱导滑膜细胞凋亡是治疗 R A的主要 策略之一f 4 l o R A滑膜细胞 凋亡可受多种凋亡相关蛋白 细胞因子及 药物的调控 并通过相关 信号传导途径来实现 目前发现调控凋亡 的基因大体可分为凋亡促进基因 如野生型 P 5 3 F a s 和 B a x等 和 凋亡抑 制基 因 如 B c l 一 2 突变型 P 5 3 C i u n等 两者共 同调节 细胞的凋亡 调控凋亡的信号传导途径主要有线粒体途径和死亡 受体途径 A R T是一种新型 的抗炎免疫调 节剂 既往 的研 究 已证明其可 抑制细胞生长 赵君宁等 发现 A R T能显著抑制 胃癌 细胞 的生长 且呈明显的量效 和时效关 系 来丽娜等 用不 同浓度 A R T作用大 鼠肝星状细胞时发现 A R T能阻止细胞从 G 期向 S期进行 造成 G 期细胞堆积 阻止 D N A合成 和复制 起 到抑制肝星状细胞增殖 的作用 从而 减少胶原 纤维在 肝脏 内的沉积 杜 志峰等 研究 发 现 A R T可显著抑制体外培养的 R A滑膜细胞的生长 具有明显的 量 效关系 某些剂量具 有一定 的时效关 系 同时 A R T能诱 导 R A 成纤维样滑膜细胞 fi b r o b l a s t l i k e s y n o v i o c y t e s F L S 产生 白细胞介 素并影响其信号转导 降低 I L一1 B I L一6和 I L一 8的水平 另一 方 面 由于 A R T诱 导 R A滑膜细胞凋亡过程 中最显著 的变化 是细 胞内线粒体途径被激活 而B c l 一 2家族蛋白为该通路最重要的调 控因子 l 因此 A R T通过降低 F L S的 B c l 一2基因表达和 N F K B 的蛋 白表达 提高 B a x 基 因表达 1 从 而在一定程度上促进 F L S凋 亡和减少促炎细胞因子表达 起到减轻 F L S增生的作用 1 以缓 解 R A滑膜炎 的症状 M T X是 目前 国际上公认 的具 有抗炎和免疫 抑制作用的慢作用抗风湿药 其作用机制是抑制二氢叶酸还原酶 和甲酰基转移酶 的活性 抑制 C C I 5 T N F I L一1 I L 6水平 提 高 I L一1 O水平 而具 有抗 炎作用l l 2 属细胞周期特异性药 物 主 要作用于 S期 对 G S转换 期有延缓作用 1 研 究发现 不 同 浓度 的 M T X均 能抑 制滑膜 细胞的增殖 具有 剂量依赖性1 1 6 且对 R A滑膜细胞 C D 6 8 一 细胞表达 R A N K L的抑制作用更 为显著m 滑膜细胞 的取材 方法 一般 分为滑膜组织 切取法 直 接抽取关 节液法等 本试验采取直接抽取关节液法 R A患者滑膜组织充血 水肿 生成大量关节液 穿刺前局部按摩促进 滑膜细胞脱落 可得 到一定量 的短 时间内脱落的具有活力 的滑膜 细胞 且不存在 生物 学性状上的差异 还避免 给患者带来附加损害 细胞体外培养的方 法可以使细胞处于人为的环境 从而简化了影响因素 但是仍要考 虑到体外培养的细胞与所处环境有很大关系 因此不能将体外培 养的结果简单地等同于细胞在体内的实际情况 2 1 根据沈靖南等 1 提出的标准 细胞抑制率大于5 0 为重度抑 制 3 0 5 0 为 中度抑制 1 0 一 2 0 为 轻度 抑制 小于 1 0 为 不抑制 本 研究结 果显示 3 1 2 5 I x g m L的 A R T对 R A滑 膜细胞 已有轻度抑制作用 抑制率为 1 7 随着质量浓度的增大 抑制作 用逐步增强 A R T与 M T X联用后 对滑膜细胞的抑制作用较单用 A R T或 M T X更 强 A R T在 3 1 2 5 2 5 p g m L范 围内作用 于滑膜 细胞后 所诱导的早期凋亡细胞率呈剂量依赖性 当A R T剂量达到 5 0 g r n L时 早期凋亡细胞率降低 而坏死细胞率升高 这可能与 1 8 2 0 1 0年第 l 9卷第 l 3 期 A R T的细胞毒性有关 当 A R T 1 2 5 I g m L与 MT X 5 g m L联用 时 细胞的早期凋亡率最高 坏死细胞率却较低 提示中等剂量 A R T联 合小剂量 MT X可以最 大限度地诱导滑膜细胞凋亡 且细胞 毒性较 小 这对于 临床上治疗 R A是一个 较好 的思路 目前 A R T 与凋亡的量效关系及凋亡的调控机制尚待进一步研究 作者简介 李燕 1 9 7 0一 女 四川简阳人 硕士研 究生 主治医 师 研 究方 向为风湿病 的基础和临床研 究 电子信 箱 l i e r j i e 1 9 9 8 1 2 6 c o m 周京 国 1 9 6 4一 男 四川南充人 硕士研究生 留 日归国 学者 主要从事血 液病和风 湿病 的研 究 本 文通讯作 者 电子信 箱 i g z h o u n s mc e d u c n 参考文献 f 1 F i r e s t e i n GS I n v a s i v e fi b r o b l a s t l i k e s y n o v i o e y t e s i n r h e u m a t o i d a r t h r i t i s p a s s i v e r e s p o n d e r o r t r a n s f o r m e d a g g r e s s o r s J A r t h r i t i s R h e u m 1 9 9 6 3 9 1 1 1 7 8 1 1 7 9 0 2 K r a me r I Wi b u l s w a s A C r o f t D e t a 1 R h e u ma t o i d a r t h r i t i s t a r g e t i n g t h e p r o l i f e r a t i v e fi b r o b l a s t s J P r o g C e l l C y c l e R e s 2 0 0 3 5 5 9 7 0 3 T e b i b J G A p o p t o s i s r e l e v a n c e t o r h e u ma t o l o g y J R e v R h e u m E n g l 1 9 9 5 6 2 6 1 8 6 2 6 4 O s p e h C N e i d h a r t M G a y R E S y n o v i a l a c t i v a t i o n i n r h e u ma t o id a rt h ri t i s J F r o n t B i o s c i 2 0 0 4 9 2 3 2 3 2 3 3 4 5 赵君宁 何一然 张振玉 等 青 蒿琥 酯对人 胃癌细胞增殖及凋亡的影 响 J 中国癌症杂志 2 0 0 5 1 5 4 3 4 7 3 5 0 6 来丽娜 方步武 青蒿琥 酯对 大鼠肝 星状 细胞增殖 的影响 J 中国药 理 与ll当 床 2 0 0 6 2 2 3 4 2 5 2 6 7 杜志峰 李振彬 青蒿琥酯对佐剂性关节炎大鼠血清T N F fit I L B 含量及滑膜细胞 凋亡的影响 D 石家庄 河北 医科大学 2 0 0 5 8 X u H H e Y Y a n g X e t a 1 A n t i