（无机化学专业论文）无机纳米材料应用于新型电流型酶生物传感的研究.pdf

西南大学硕士学位论文摘要 无机纳米材料应用于新型电流型 酶生物传感的研究 无机化学专业硕士研究生付萍 指导教师柴雅琴教授 摘要 生物传感器是近年来发展起来的一项新型分析测量技术 它是结合了医学 物理 化学 生物 等多学科的综合研究 同时 由于其具有成本低 灵敏度高 制备简单的优点 生物传感器在临床 医学 环境检测和食品工业等领域有着重要的应用 自1 9 6 7 年第一支葡萄糖氧化酶传感器诞生以 来 酶传感器的发展就越来越受到人们的关注并已用于多种成分的测定 而在酶传感器的研究中 酶的固定化以及固定于电极表面的酶的催化反应过程等都是是关键的环节 对酶传感器的灵敏度 选择性 寿命等有直接影响 本文正是从酶的固定化以及酶催化过程的研究和改进出发 将无机纳 米粒子或有机无机复合纳米材料应用于酶传感器 从而构建了多种酶传感器 本文的主要研究工作 分为三部分 1 基于壳聚糖 纳米金 纳米普鲁士蓝肚半胱氨酸修饰的葡萄糖传感器的研究 首先在金电极表面修饰带正电荷的l 半胱氨酸 再利用静电吸附作用固定普鲁士蓝纳米颗粒 r 衄o v b 然后利用壳聚糖 纳米金复合膜将葡萄糖氧化酶 g o d 固定于修饰电极表面 制成新型的 葡萄糖传感器 通过交流阻抗技术 e i s 循环伏安法 c 和计时电流法考察了电极的电化学特性 在优化的实验条件下 该传感器在葡萄糖浓度为3 0 1 0 6 1 0 x 1 0 3m o l l 范围内有线性响应 检 测下限为1 6 1 0 一m o l l 此外该传感器具有响应快 稳定性好和选择性良好的特点 能有效排除 常见干扰物质如抗坏血酸 尿酸等对测定的影响 2 基于壳聚糖复合膜 纳米铂 纳米聚苯胺修饰的电流型过氧化氢传感器的研究 在金电极表面修饰一层具有良好导电性和高比表面积的纳米聚苯胺膜 n a n o p a n i 然后将纳米 铂 v t n v 分散在纳米聚苯胺膜中 最后利用壳聚糖 纳米金复合膜将辣根过氧化氢酶 h r p 固定于修 饰电极表面 通过扫描电镜考察了纳米聚苯胺膜的修饰过程 并利用交流阻抗技术 循环伏安法和 计时电流法考察了电极的电化学特性 在优化的实验条件下 该传感器在过氧化氢 h 2 0 2 浓度为 1 4 1 0 5 1 5 1 0 五m o l l 范围内有线性响应 检测下限为7 2 x 1 0 一m 0 1 l 米氏常数为1 2 8m m o l l 此外该传感器具有响应快 稳定性好和选择性良好的特点 能有效排除常见干扰物质如抗坏血酸 尿酸等对测定的影响 3 以纳米金与碳纳米管掺杂的壳聚糖复合膜为固定基质的高灵敏度的葡萄糖传感器的研究 复合材料由于其往往发挥各种成分材料的优点具有非常优异的性能 得到了广泛的研究和快速 西南大学硕士学位论文摘要 的发展 本文将纳米金与碳纳米管共同与壳聚糖进行掺杂 制得导电性好 比表面积高的壳聚糖复 合膜 并且兼具有生物兼容性好 易成膜性的优点 以此复合膜为基质 进 步修饰纳米铂 然后 固定葡萄糖氧化酶 制得高灵敏度的葡萄糖生物传感器 实验数据证明壳聚糖复合膜有效地增加了 电极的有效面积并具有较好的导电性 制得的传感器对葡萄糖具有较高的响应灵敏度以及较低的检 测下限 同时具有较好的选择性 在优化条件下 该传感器对葡萄糖的现行相应范围为 6 0 x l o 7 3 5 x l o 3m o l l 检测限为1 9 l o 7m o l l 同时酶催化动力学参数米氏常数为0 3 9m m o l l 关键词 电流型酶传感器纳米普鲁士蓝纳米聚苯胺纳米金纳米铂 i i 西南大学硕士学位论文a b s t r a c t p r e p a r a t i o n o fs e v e r a lc o m p o s i t e d n a n o m a t e r i a l sa n dt l l e l ra d d n c a t l o ni n l 1 l j a m p e r o m e t r i ce n z y m e b i o s e n s o r s a n a l y t i c a lc h e m i s t r ym a s t e rp o s t g r a d u a t e p i n gf u s u p e r v i s o r p r o f e s s o ry a q i n c h a i a b s t r a c t b i o s e n s o ri san e wa n a l y t i c a lm e a s u r e m e n t w h i c hc o m b i n e ss e v e r a ls u b j e c t ss u c ha s m e d i c i n e p h y s i c s c h e m i s t r ya n db i o l o g y m e a n t i m e b e c a u s eo fi t sl o wc o s t h i g hs e n s i t i v i t y a n ds i m p l ep r e p a r a t i o n b i o s e n s o rh a sh a di m p o r t a n ta p p l i c a t i o n si ns o m er l e a ss u c ha sc l i n i c m e d i c i n e e n v i r o n m e n tm e a s u r e m e n ta n df o o di n d u s t r y a n di n 19 6 7 t h ef i r s tg l u c o s e o x i d a s eb i o s e n s o rw a sp r e p a r e dw h i c ha t t r a c t e dm o r ea n dm o r ei n t e r e s ti ne n z y m eb i o s e n s o r s 强ek e yt e c h n i q u eo fe n z y m eb i o s c n s o r si st h ei m m o b i l i z a t i o no fe r l l z y l n e a n dt h i sp a p e r i n t r o d u c e ss o m ee n z y m eb i o s e n s o r sw h i c hc o m b i n et h ei m m o b i l i z a t i o no fe n z y l n ea n d s e v e r a ln a n o m a t e r i a l s a n dt h em a i nw o r k sa r ei n c l u d e da sf o l l o w s 1 g l u c o s eb i o s e n s o rb a s e do nc h i t o s a n n a n og o l d n a n o p r u s s i a nb l u e l c y s t e i n e m o d i f i e dg o l de l e c t r o d e an o v e lg l u c o s eb i o s e n s o rh a sb e e np r e s e n t e di nt h i sp a p e r l c y s t e i n ew a si m m o b i l i z e d o n t oag o l de l e c t r o d et of o r map o s i t i v e l yc h a r g e ds u r f a c e a n dn a l l o p r u s s i a nb l u ew a s a s s e m b l e do nt h em o d i f i e ds u r f a c ea sa l le l e c t r o nt r a n s f e rm e d i a t o r t h e n t h eh y b r i df i l mo f c h i t o s a n n a n og o l da n dg l u c o s e o x i d a s e g o d w a gi m m o b i l i z e do nt h ee l e c t r o d et of a b r i c a t e t h ep r o p o s e db i o s e n s o r t h em o d i f y i n gp r o c e s sw a sc h a r a c t e r i z e db ye l e c t r o c h e m i c a l i m p e d a n c es p e c t r o s c o p y e i s e y c f i ev o l t a m m e t r y c v a n dt r a n s m i s s i o ne l e c t r o n m i c r o s c o p y t e m a n dt h ee f f e c t so fa p p l i e dp o t e n t i a la n dp ho nt h er e s p o m ec u r r e n t sw e r e a l s o i n v e s t i g a t e d u n d e ro p t i m a lc o n d i t i o n s t h er e s u l t i n gb i o s e n s o rd i s p l a y e dar a p i d r e s p o n s et og l u c o s ea n dt h el i n e a rr a n g eo ft h eb i o s e n s o rw a sf r o m3 0 xl0 ot o1 0 10 一j m o l lw i t had e t e c t i o nl i m i to f1 6 x 1 0 一om o l lr s n 3 m o r e o v e r t h ei n t e f f e r e n t s i n f l u e n c i n gt h ep r o p o s e db i o s e n s o rw e r er e s e a r c h e di nd e t a i l a n dt h eb i o s e n s o rp o s s e s s e d e x c e l l e n ts e l e c t i 访埘a n dg o o ds t a b i l i t y 2 i m m o b i l i z i n gp tn a n o p a r t i c l e sa n dc h i t o s a nh y b r i df i l mo np o l y a n i l i n en a n o f i b e r s m e m b r a n ef o ra l la m p e r o m e 仃i ch y o g e np e r o x i d eb i o s e n s o r ac o n v e n i e n ta n de f f e c t i v ew a yf o rf a b r i c a t i n ga m p e r o m e t r i ch y d r o g e np e r o x i d e h 2 0 9 b i o s e n s o rw a sd e s i g n e di nt h i sp a p e r f i r s t l y p o l y a n i l i n e p a n l n a n o f i b e r sm e m b r a n ew i t h g o o dc o n d u c t a n c ea n dh i 曲s u r f a c ea r e aw a se l e c t r o p o l y m e r i z e do nag o l de l e c t r o d ea sa i i i 西南大学硕士学位论文 a b s t i 认c t s u b s t r a t et oe n h a l l c et h ee l e c t r o n t r a n s f e ro ft h eb i o s e n s o r t h e n p tn a n o p a r t i c l e p 心p w a s d i s p e r s e di np a n in a n o f i b e r sm e m b r a n e f i n a l l y t h eh y b r i df i l mc o n t a i n i n gn e g a t i v e l y c h a r g e dg o l dn a n o p a r t i c l e a u n p p o s i t i v e l yc h a r g e dc h i t o s a n c s a n dh o r s e r a d i s h p e r o x i d a s e 卸r p w a si m m o b i l i z e do nt h em o d i f i e de l e c t r o d et of o r mas t a b l eb i o f u n c t i o n a l f i l m w h i c hw a sa l s oe m p l o y e d 硒a na n t i i n t e r f e r e n tb a r r i e ra n dap r o t e c t i v el a y e rt o 眦 t h e m o d i f y i n gp r o c e s sw a sc h a r a c t e r i z e db ye l e c t r o c h e m i c a li m p e d a n c es p e c t r o s c o p y e i s a n dc y c l i cv o l t m m n e t r y c a n dt h em o r p h o l o g yo ft h ep a n in a n o f i b e r sm e m b r a n ew a s c h a r a c t e r i z e db ys c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p y s e m t h ep r o p o s e db i o s e n s o re x h i b i t e da r a p i dr e s p o n s et oh 2 0 2a n dg o o ds e l e c t i v i t yt op o s s i b l ei n t e l q e r e n t s d u et ot h ea h a n c e d e l e c t r o n t r a n s f e rk i n e t i c sa n dt h es u f f i c i e n ts e l e c t i v ep e r m e a b i l i t yo ft h eh y b r i df i l m u n d e r t h eo p t i m i z e dc o n d i t i o n s t h el i n e a rr a n g eo ft h eb i o s e n s o rw a sf r o m1 4 x10 5t o1 5xl 0 2 m o l lw i t had e t e c t i o nl i m i to f7 2 x10 r bm o l l s n 3 t h em i c h a e l i e s m e n t e nc o n s t a n t 研v a l u ew a s1 2 8i n l n o 儿s u g g e s t i n gah i g ha f f i n i t y m o r e o v e r i td i s p l a y e d9 0 0 d r e p r o d u c i b i l i t ya n dl o n g t e r ms t a b i l i t y 3 ah i 曲s e n s i t i v i t yg l u c o s eb i o s e m o rb a s e do ni m m o b i l i z i n gp tn a n o p a r a t i c l ea n d g l u c o s eo x i d a s eo nt h ec o m p o s i t ef i l mo fg o l dn a n o p a r t i c l e c a r b o nn a n o t u b ea n dc h i t o s a n a g o o dc o n d u c t i v ea n dl a r g es u r f a c ec o m p o s i t ef i l mo fo fg o l dn a n o p a r t i c l e c a r b o n n a n o t u b ea n dc h i t o s a nw a sp r o p o s e dt op r e p a r eah i g h l ys e n s i t i v ea n dl o wd e t e c t i o nl i m i t a r y a m p e r o m e t r i cg l u c o s eb i o s e n s o ri nt h i sp a p e r f i r s t l y t h em i x t u r eo fg o l dn a n o p a r t i c l e c a r b o nn a n o t u b ea n dc h i t o s a nw a sd r i p p e do nt h e g l a s sc a r b o ne l e c t r o d et o o b t a i na c o m p o s i t ef i l mw i t hg o o dc o n d u c t a n c ea n dh i 曲s u r f a c ea r e a t h e n p tn a n o p a r t i c l e0 t r y w a sd e p o s i t e do nt h i sc o m p o s i t ef i l m f i n a l l y t h eg l u c o s eo x i d a s ew a si m m o b i l i z e do nt h e m o d i f i e de l e c t r o d es u r f a c e b y c o v a l e n tb o n d i h e c y c l i cv o l t a m m e t r y c v a n d e l e c t r o c h e m i c a li m p e d a n c es p e c t r o s c o p y e i s w c l ee m p l o y e dt oc h a r a c t e r i z ee a c hs t e p si n t h et h em o d i f i e dp r o g r e s s t h ep r o p o s e db i o s e n s o re x h i b i t e da r a p i dr e s p o n s et i m ea n dh i 曲 s e n s i t i v i t yt og l u c o s e u n d e rt h eo p t i m i z e dc o n d i t i o n s t h el i n e a rr a n g eo ft h eb i o s e n s o rw a s f r o m6 o x l o 叫t o3 5 x 1 0 m o 儿 历t hal o wd e t e c t i o nl i m i to f1 9 1 0 m o l l s n 3 t h e v a l u eo fm i c h a e l i e s m e n t e nc o n s t a n tw a s0 3 9m m o l l f u r t h e rm o r e t h eo b t a i n e de l e c t r o d e a l s oe x h i b i t e da l o n g t e r ml i f ea n dg o o dr e p r o d u c i b i l i t y k e y w o r d s a m p e r o m e t r i cb i o s e n s o r p r u s s i a nb l u e g o l dn a n o p a r t i c l e p l a t i n u m n a n o p a r t i c l e i v 独创性声明 本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果 论文中引用他人已经发表或出版过的研究成果 文中已加了标注 学位论文作者 q 寺 签字日期 加加年年月切日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留 使用学位论文的规定 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘 允许论文被 查阅和借阅 本人授权西南大学研究生部可以将学位论文的全部或部分内 容编入有关数据库进行检索 可以采用影印 缩印或扫描等复制手段保存 汇编学位论文 保密的学位论文在解密后适用本授权书 本论文 口不保密 口保 密期限至年月止 学位论文作者签名 俏裤导师签名 笛稚争 j i 签字日期 j o 年午月矽日 签字日期 易僻乒月哆日一 曹雪銮耋鳘 茎堡篓耋茎 耋 第一章绪论 1 1 生物传感器简介 2 0 0 4 年欧洲化学会暨有关化学的职业团体的联合会发布的第3 2 号欧洲分析专讯中 指出 当前分析化学的四大支柱为 谱学 系指能产生谱固的各种分析技术 色谱学 包 括电泳技术1 传感器学 化学计量学 这表明 传感器学已经成为今日分析化学的重 要组成部分和研究热点 生物传感器最基本的结构是由生物识别元件 换能器 信号接收和记录系统三部分 组成 其中生物识别元件由固定化的生物敏感物质构成 如酶 抗原抗体 微生物 细 胞组织 核酸等生物活性物质 而换能器则由检测元件佣如电化学 光学 压电 温 度或者电磁等物理化学方式工作 组成 f 姆 1 1 c i l u l f i c a f l o n o f t h eb m 靶瑚 1 2 电化学酶生物传感毒概述 酶是由生物体内活细胞产生的一种生物催化剂 大多数由蛋白质组成 少数为 p n a 能在机体中十分温和的条件下 高效率地催化各种生物化学反应 电化学酶生 物传感器将具有催化活性的酶作为分子识别元件 并将其与离子选择电极 气敏电极 氧化还原电极等基础电极组合而形成生物传感器 由于酶对底物的催化作用 利用修饰 电极将该催化反应过程中发生的电子转移或得失阻电信号的形式记录下来 通过对记录 的电信号进行分析 处理可以快捷方便的得到待测物质浓度的相关信息 并且由于酶催 化反应的专一性和高效性 使得酶生物传感器较传统分析方法相比具有选择性高 响应 快的特点 能够快速 直接在复杂试样中进行测定 同时 由于电极可以做得非常小 因此可实现实时的在线监测 电化学酶生物传感嚣 按其工作原理不同大致可分为三个发展阶段 其第一阶段可 追溯到上世纪6 0 年代中期 u p d i k e 和h i c k t 研制出世界上第 支葡萄糖氧化酶电极 在这一阶段中电化学酶生物传感器基本上是基于化生物固定膜膜和基础电极 例如 氧 电极或p h 电极等等 构建而成 第一代酶生物电极又称经典酶电极 其主要设计原理 西南大学硕士学位论文第一章 篁皇h e 11 i i ei i 皇蔓曼曼曼曼鼍曼曼皇 是利用基础电极直接测定酶催化反应过程中产生或消耗的电极活性物质 例如 酶催化 反应是一个耗氧过程 就可以使用0 2 电极作为指示电极 如果 酶催化反应为一个产 生或者消耗酸的过程 则可利用p h 电极作为指示电极 经典酶电极结构和原理相对简 单 但其缺点也非常明显 就拿u p d k e 制备的葡萄糖氧化酶电极来说 其通过氧电极 检测溶液中氧的消耗量来测定葡萄糖浓度 这种检测容易受到检测环境中氧分压波动的 影响 并且响应时间长 灵敏度低 工作电位高 选择性低 随着对电极表面酶催化反应认识的逐渐深入 人们发现有一类物质在酶催化反应中 具有较好的电化学活性以及可逆性 这类物质一方面能与酶的氧化还原活性中性快速的 反应 另一方面也能在修饰电极表面以较低的电位下快速地进行上述反应的逆反应 在 电化学生物传感器的构建过程中 将这类电化学活性物质固定于电极表面 其在整个酶 催化反应中扮演了中介体或媒介体的作用 因此也常被称为电子介体或电子媒介体 一 般来说 电子媒介体主要包括低分子介体 如二茂铁及其衍生物 2 哪 有机染料 1 醌及 其衍生物 9 l o 等等 以及含有上述低分子介体官能团的高分子聚合物介体 i i 1 2 第二代酶 生物传感器便是基于电子媒介体酶电极的 由于其相对于第一代酶电极具有工作电位 低 选择性好 灵敏度较高 于是得到了广泛而深入的研究 例如 p a n d a w c i 等人使 用普鲁士蓝作为电子媒介体并将其修饰在非导电聚合物聚邻氨基苯酚膜上制得葡萄糖 传感器 由于普鲁士蓝自身能在较低的电位下于电极表面还原为还原态 普鲁士白 而 普鲁士白对酶催化反应的产物过氧化氢具有良好的催化还原作用 由此制得的电极工作 具有较低的电位 因此 该电极的选择性有了大幅度的提高 1 3 w u l i n a 等人利用硫堇 与碳纳米管的强相互作用 将硫堇吸附于碳纳米管表面 通过电聚合法将修饰了硫堇的 碳纳米管和乙醇脱氢酶共聚到电极表面 制得以硫堇为电子媒介体的乙醇生物传感器 除了制各方法简单之外 该生物传感器还具有较高的灵敏度和快速的响应时间 1 4 y a o h u i 等人则将亚甲基蓝修饰于硅氧化物表面 制得复合纳米材料并将其修饰于电极 表面 由于该复合纳米材料能在电极表面有效地进行电子传递i 因此可作为电子媒介体 从而制得过氧化氢生物传感器 实验表明 该生物传感器对过氧化氢有良好的催化作用 并且响应快灵敏度高 l 副 w e i z h i l e i 等将富勒烯 二茂铁 壳聚糖与离子液体组成的复 合物直接固定于电极表面并以此作为电子媒介体制得葡萄糖生物传感器 该葡萄糖生物 传感器对葡萄糖具有较低的检测下限 可达3 x 1 0 9t o o l l 同时具有较好的选择性和响 应时间 1 6 在近年来的文献当中 固定于电极表面的酶与电极之间直接发生电子传递的现象和 对应的电极 也就是第三代的基于酶的直接电化学的生物传感器的报道也越来越多的被 报道 例如 c h c n x u 等人报道了基于镍一铝 过氧化氢酶的纳米薄膜 并将其固定于电极 表面 固定于该镍 铝纳米薄膜表面的过氧化氢酶在电极表面发生了直接电化学催化反 应 该电极对过氧化氢具有较快的响应速度 1 7 1 d e n g c h u n y a n 等人则在碳纳米管修饰 2 西南大学硕士学位论文 第一章 的玻碳电极表面实现了葡萄糖氧化酶的直接电子传递 其线性范围为0 0 5 4 3 3 m m o l l 1 8 虽然关于第三代生物传感器的文献数量猛增 而且所发现的能够在电极表 面实现直接电化学的酶的种类也不断增加 但大多数文献中所报道的基于酶的直接电化 学的生物传感器的灵敏度普遍不高 电极的寿命也相对较短 并且大多数报道主要集中 于血红素类氧化还原蛋白质和酶 如血红蛋白 1 9 删 辣根过氧化物酣2 1 2 2 1 细胞色素 c 2 3 2 4 微过氧化物酶f 2 5 2 6 以及葡萄糖氧化酶 2 7 2 8 等少数集中酶或蛋白质 因此 第三 代生物传感器还有待于广大研究人员和学者进一步的深入研究和改进 1 3 生物组分的固定 将酶固定于电极表面有多种途径 其中最常用的固定方法有吸附法 包埋法 共价 键合法 交联法 吸附法 即利用范德华力或氢键等作用力 将酶或蛋白质直接固定于 修饰电极表面 例如 m a s u d a 等将葡萄糖氧化酶直接吸附于铂微孔电极表面1 2 9 1 或者 如o r o z e o 等人将辣根过氧化物酶固定于纳米金颗粒修饰的超微电极表面p 们 包埋法则 是将酶包埋于溶胶 凝胶 s o l g e l 或者大分子聚合物的三维空间网状结构当中 l i q i n g w e n 等人利用四乙基原硅酸盐 t e o s 制得了二氧化硅溶胶凝胶并将葡萄糖氧化酶固定于其 中 3 1 1 而l u o x i l i a n g 等人则利用天然高聚物 壳聚糖凝胶包埋辣根过氧化物酶 从而 实现酶的固定 3 2 共价键合法通常是利用酶或蛋白质分子通过共价键作用固定于修饰 电极表面 又如r a j e s h 等人采用共价键和的方法将尿酶修饰在聚毗咯和3 氨基 聚毗咯 的共聚物薄膜之上 制得了尿酸生物传感器 而他采用类似的方法将络氨殷酶固定于 3 氨基 聚吡咯膜上测定了苯酚 儿茶酚和p 甲酚的含量 3 4 交联法也是目前广泛采 用的用于固定生物分子一种方法 该方法借助交联试剂 较常用的交联剂 如戊二醛 它能在温和的条件下与蛋白质分子中的游离的氨基发生所和反应 形成s h i f t 碱而进行 交联 将酶或蛋白质分子结合到电极表面 3 5 1 1 4 纳米材料在生物传感器中的应用 1 4 1 纳米材料简介 纳米材料通常是指尺寸介于原子和宏观物质之间的一类材料 其尺寸大于原子簇而 小于通常的微粉 一般在1 1 0 01 3 1 1 3 之间 人们对纳米材料的研究始于第二次世界大战 期间 而纳米材料得到真正的迅速发展则是从2 0 世纪9 0 年代开始 随着研究的不断深 入 其研究的内涵也在不断扩大 早期的纳米材料研究主要集中在纳米粒子或微粒 如 纳米晶体 纳米非晶等 到后来 研究又涉及到纳米丝 纳米纤维 纳米管 微孔和 介孔材料 包括凝胶和气凝胶 以及由它们组成的薄膜与块体结构材料 以及一些高级 形式的纳米材料 如核壳型纳米材料 c o r e s h e l ln a n o m a t e r i a l s 复合纳米膜层 c o m p o s i t ef i l mo f n a n o s c a l e 以及功能化的纳米材料 f u n c t i o n a ln a n o m a t e r i a l s 3 西南大学硕士学位论文 第一章 由于纳米材料所具有的一些特殊的物理化学性质 如体积效应 表面效应 使得纳 米材料具有许多独特的特性 如超大的比表面积 较高的表面自由能等等性质 吸引了 大量研究人员将纳米材料引入到生物传感器的制备当中 1 4 2 纳米材料在生物传感器中的应用 纳米材料应用于生物分子的固定 纳米材料由于其大的比表面积 广泛应用于生物 传感器制备过程中生物分子的固定 早在2 0 0 1 年b h a r a t h i 等就利用固定在i t o 电极表 面的纳米金来吸附固定葡萄糖氧化酶制得葡萄糖生物传感器 由于纳米金良好的生物兼 容性 使得固定于电极表面的葡萄糖氧化酶保持了良好的生物活性 因此制得的生物传 感器灵敏度高 并且可反复使用 寿命长达四个月 该论文发表在著名的 分析家 杂 志上 3 6 1 第二年j i a j i a n b o 等在美国 分析化学 杂志上发表论文 他们将纳米金固定 于修饰了巯基的电极表面 进而利用自组装法固定上辣根过氧化物酶 h r p 制得第三代 基于蛋白质直接电化学的过氧化氢生物传感器 同样得到的生物传感器具有良好的灵敏 度 重现性和较长的使用寿命 3 7 l 之后l i n y u e h e 等人制备了基于碳纳米管固定葡萄糖 氧化酶的葡萄糖生物传感器 他们首先将碳纳米管羧基化 然后利用碳二亚胺将碳纳米 管固定于电极表面 加入e d c 仆m s 活化碳纳米管表面的氨基 最后利用戊二醛交联固 定葡萄糖氧化酶 由于碳纳米管较高的比表面积 使得修饰电极的有效面积极大的提高 了 从而增加了葡萄糖氧化酶的固定量 因此该传感器的灵敏度得到较大的提高 3 8 1 另外r a n d h h 等人在 分析化学学报 杂志上发表一篇基于碳纳米管固定有机磷水解酶 检测有机磷生物传感器的文章 他们利用该生物传感器成果检测了水中残留的有机磷杀 虫剂的含量 3 9 1 纳米材料应用于电活性催化 许多无机纳米材料也由于其本身具有催化活性 因此 在生物传感器中也常常用于对系统中某些物质的催化作用 例如 t a n g h a o 等人首先将 纳米铂颗粒修饰在碳纳米管表面 再利用纳米铂吸附葡萄糖氧化酶制得高灵敏度的葡萄 糖生物传感器 该方法利用纳米铂作为葡萄糖氧化酶催化反应所产生的过氧化氢的进一 步反应的催化剂 极大的增强了灵敏度 同时也获得了较长的使用寿命 2 2 天后 响应 电流仍能保持7 3 5 t 4 0 l z h a i x i u r o n g 等利用壳聚糖将碳纳米管和普鲁士蓝纳米颗粒固 定于电极表面 并进一步修饰葡萄糖氧化酶 由于普鲁士蓝纳米颗粒能够在较低的电位 下催化还原葡萄糖催化还原反应的产物过氧化氢 因此该电极显示出了较好的选择性 4 1 o 1 5 本论文创新点 基于无机纳米材料在生物传感器应用当中的研究已经广泛展开 本论文结合已有的 文献报道及本实验室之前的工作基础 针对电流型生物传感器的选择性 灵敏度 稳定 4 西南大学硕士学位论文 第一章 性进行了新型生物生物传感器的设计与研究 并利用多种无机以及有机功能纳米材料以 及复合纳米材料 发展了多种性能良好的生物传感器 其创新点可归纳如下 1 由于选择性是衡量一个生物传感器性能以及实用化的关键因素 本文从提高生物 传感器的选择性入手进行了生物传感器的设计 首先制备了无机纳米粒子 普鲁士蓝 纳米颗粒 并利用普鲁士蓝纳米颗粒在低电位下对酶催化反应产物过氧化氢的强催化作 用降低了生物传感器的工作电位 从而增强了该传感器的选择性 另外 在壳聚糖中掺 杂入纳米金颗粒 在固定葡萄糖氧化酶的同时增强了其催化活性 从而也提高了该传感 器的灵敏度 并且壳聚糖的高生物兼容性及多羟基三位网状结构也使得固定的酶能够具 长时间保持其生物活性并不易从电极表面渗漏 从而提高了传感器的寿命和稳定性 2 利用电化学沉积法 在电极表面一步制得具有高比表面积和高导电性的有机导电 聚合物 聚苯胺纳米纤维 在此聚苯胺纳米纤维表面 分散一层纳米铂颗粒 最后利 用壳聚糖 纳米金复合膜固定了辣根过氧化物酶 由于聚苯胺纳米纤维和纳米铂均具有 良好的导电性能 因此为辣根过氧化物酶的固定提供了一个具有良好导电性和大比表面 积的基地 当该电极处于工作状态时 由于固定于电极修饰表面的纳米铂颗粒与过辣根 氧化物酶的协同作用 使得该电极具有较高的灵敏度 同时也具有较宽的线性范围 3 通过上面的实验 我们发现改善电极表面修饰膜层的导电性和增大电极的有效面 积提高酶的固载量能显著提高传感器的灵敏度 因此 我们将纳米金与碳纳米管掺杂到 壳聚糖当中 制得壳聚糖复合膜 以此为基底固载纳米铂 进而固定葡萄糖氧化酶 由 此制得高灵敏度的葡萄糖生物传感器 并且由于壳聚糖良好的生物兼容性和多羟基结构 能有效保持葡萄糖氧化酶的生物活性 因此 制得的葡萄糖生物传感器也具有较长的使 用寿命 西南大学硕士学位论文第二章 m i m m i n m m 皇皇皇篡 第二章基于壳聚糖一纳米金 纳米普鲁士蓝 l 半胱氨酸修饰的葡 萄糖传感器的研究 糖尿病是工业化国家里不容忽视的死亡因素之 快速 准确 选择性地测定血液 中的葡萄糖浓度在医学上具有极其重要的意义 1 9 6 7 年 u p d i k e 和h i e k t i 研制出第一支 葡萄糖氧化酶电极 从此 能简便 快速 准确地测定葡萄糖浓度的葡萄糖氧化酶 g o d 传感器的研究一直都是人们关注的热点 基于酶的生物传感器制备过程中 酶的固定化 是一个关键环节 在酶的固定材料中 壳聚糖不易溶于水 成膜性好 且具有良好的生 物相容性 稳定性 4 2 1 对酶有较好的亲和力 并能有效防止酶和电子媒介体的渗漏 它在许多研究工作中被广泛用于修饰电极的制备 4 3 1 纳米材料如金 银等纳米粒子具 有高比表面积 强吸附力及良好的生物相容性等优异特性 可增加酶的吸附量和稳定性 m 1 同时 纳米金粒子能与g o d 内部的氧化还原中 心f a d 中的亲水基团发生作用 使 g o d 活性中心f a d 暴露出来 从而提高g o d 的催化效率 使电极的响应灵敏度得到提 高 4 5 普鲁士蓝 p r u s s i a nb l u e p b 因其对于过氧化氢有良好的催化还原作用 被称 为 人造过氧化氢酶 它具有良好的化学稳定性 电催化特性 且制备简单 成本低廉 在传感器领域具有广泛应用 蚓 近年来 葡萄糖传感器的研究领域取得了较突出的进展 陈洪渊研究小组 4 7 报道 了一种通过在电极上沉积壳聚糖分散的m n 0 2 纳米粒子制备的葡萄糖安培传感器 它能 够有效地减少抗坏血酸的干扰 沈国励研究小组 4 8 利用多壁碳纳米管和铁氰酸镍纳米 颗粒电化学氧化还原活性的协同作用形成复合成分 制备了葡萄糖传感器 提高了传感 器的电催化性能 朱俊杰研究小组 4 9 通过电沉积法将普鲁士蓝以及壳聚糖一纳米金一葡 萄糖氧化酶复合层固定在电极上制各了葡萄糖传感器 取得了良好的效果 我们以前的 工作中也采用三维网状结构的三甲氧基巯丙基硅烷 s 和纳米金粒子制备了葡萄糖 传感器 增加了酶的吸附 删 本文利用l 半胱氨酸的巯基与金易形成巯金键的特性 在金电极表面修饰带正电荷的l 半胱氨酸 再利用静电吸附作用固定纳米普鲁士蓝 然 后利用壳聚糖一纳米金复合膜将g o d 固定于修饰电极表面 制得葡萄糖传感器 由于媒 介体纳米普鲁士蓝的引入 使得该传感器具有较低的工作电位 避免了大多数还原性物 质的干扰 实验结果证明 该传感器具有较高的灵敏度及良好的抗干扰能力 并且具有 制备简单 稳定性好 响应速度快等特点 2 1 实验部分 2 1 1 仪器与试剂 a u t o l a bp g s t a t 12w i t hg p e ss o f t w a r e e c oc h e r n i e u t r e c h t n e t h e r l a n d 电分析系 统 b r a n s o n i c 2 0 0 超声清洗仪 德国b r a n s o ni i r a s c h a l l 公司 a b 2 0 4 s 电子 6 西南大学硕士学位论文第二章 天平 瑞士m 础小t 0 1 e d o 公司 i m 6 e 型交流阻抗测试系统 德国z a h n e r e l e k t r i k 公司 t e c n a i1 0 型透射电子显微镜 t e m 荷兰p h i l i p sf e i 公司 葡萄糖氧化酶 g o d e c 1 134 1 5 1 0 0 0u n i t 昨 s i g m a 公司 氯金酸 s i g m a 公司 柠檬酸钠 上海化学试剂公 司 2 5m m o 儿磷酸盐缓冲溶液 p b s p h60 由n a 2 1 4 p 0 r k h 2 p 0 4 配制 其它试剂均为 分析纯 实验用水均为二次蒸馏水 笺黪雾 溪蒸攀 薹 鬈董椎 攀j 露 漆 鎏溅i 骥攀 薯 j i 聋谢 二 簇 囊薹 西南大学硕士学位论文第二章 上 在4 下晾干得到葡萄糖传感器 2 15 检测方法 采用三电极检测装置 修饰电极为工作电极 饱和甘汞电极为参比电报 铂丝电极 为对电极 在2 5 下 以2 5m m o l l p b s p h60 为测试底液 采用循环伏安和交流阻 抗技术对电极的修饰过程进行了表征 循环七 c 安测试的电位扫描速率为5 0 m v s 电位 扫描范围为一02 05vf 坩s c e 此外 采用计时电流法研究了传感器对不同浓度的葡 萄糖的电流响应 22 结果与讨论 2 21 传感器的晌应机理 如图22 所示 在0 2 存在的条件下 葡萄糖氧化酶可选择性地催化溶液中葡萄糖 的氧化反应 同时生成葡萄糖酸内酯和h z 0 2 如反应式 1 2 所示 生成的h z 0 2 的 量与溶液中葡萄糖的含量有关 因此可通过检测酶释放的h 2 0 2 以检测溶液中葡萄糖的 浓度娜 5 4 瑚 g o d f a d b d 葡萄糖 g o d f a d h 2 b d 葡萄糖酸内酯 1 g o d f a d h 2 0 2 g o d f a d h 2 0 2 佗1 k 2 f e f e z a p w 坚垂坠k f e 3 f e 2 c n d p b k o 在工作状态下 电极表面的p b 得到电子转变成其还原态普鲁士 1 v m s s i a nw h i t e p w 普鲁士白对h 2 0 2 有良好的催化还原作用 如反应式 3 所示 器 f 电2 2 m e e h a n h r a s u v o l v e d i nd e t e c t i o no f g u c c 脚w i t h g e n e r a t i o n o f 凰0 2 图23 是传感器在2 n k 03 5r e t o o l l 葡萄糖前后在2 5m m o l l p b s p h 6o 中的循 环伏安图 由图可知 当加入葡萄糖后 图3 b 氧化峰电流明显减小 还原峰电流明显 增大 显示出明显的h o 电催化特征 蠢 r i g2 3 c y c l i c v e l t a m m o g r a 璐o f t h eb i o s e n s o r g l e c o s e i n2 5 m m o f lp b s o m6 0 a ts c a l dr a t e o