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RT-PCR逆转录-聚合酶链反应 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)的原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。一、反转录酶的选择1 Money 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。最适作用温度为37。2 禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。最适作用温度为42。3Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2+存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。4MMLV反转录酶的RNase H-突变体：商品名为Superscript 和SuperScript。此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。二、合成cDNA引物的选择1 随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。2 Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3端Poly(A+)尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。由于Poly(A+)RNA仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。3 特异性引物：最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA 3端最靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。二、 试剂准备1RMA提取试剂2第一链cDNA合成试剂盒3dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM4Taq DNA聚合酶三、操作步骤1. 总RNA的提取：见相关内容。2. cDNA第一链的合成：目前试剂公司有多种cDNA第一链试剂盒出售，其原理基本相同，但操作步骤不一。现以GIBICOL公司提供的SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis 试剂盒为例。（1）在0.5ml微量离心管中，加入总RNA 1-5g，补充适量的DEPC H2O使总体积达11l。在管中加10M Oligo（dT）12-18 1l，轻轻混匀、离心。（2）70加热10min，立即将微量离心管插入冰浴中至少1min。然后加入下列试剂的混合物：10PCR buffer 2l 25mM MgCl2 2l 10mM dNTPmix 1l 0.1M DTT 2l 轻轻混匀，离心。42孵育2-5min。（3）加入Superscript1l ，在42水浴中孵育50min。（4）于70加热15min以终止反应。（5）将管插入冰中，加入RNase H 1l ，37孵育20min，降解残留的RNA。-20保存备用。3PCR：（1）取0.5ml PCR管，依次加入下列试剂：第一链cDNA 2l上游引物（10pM） 2l下游引物（10pM） 2ldNTP(2mM) 4l10PCR buffer 5lTaq 酶（2u/l） 1l（） 加入适量的ddH2O，使总体积达50l。轻轻混匀，离心。（） 设定PCR程序。在适当的温度参数下扩增28-32个循环。为了保证实验结果的可靠与准确，可在PCR扩增目的基因时，加入一对内参（如G3PD）的特异性引物，同时扩增内参DNA，作为对照。（） 电泳鉴定：行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果。（） 密度扫描、结果分析：采用凝胶图像分析系统，对电泳条带进行密度扫描。四、注意事项1 在实验过程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。在总RNA的提取过程中，注意避免mRNA的断裂。2 为了防止非特异性扩增，必须设阴性对照。3 内参的设定：主要为了用于靶RNA的定量。常用的内参有G3PD（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）、-Actin（-肌动蛋白）等。其目的在于避免RNA定量误差、加样误差以及各PCR反应体系中扩增效率不均一各孔间的温度差等所造成的误差。4 PCR不能进入平台期，出现平台效应与所扩增的目的基因的长度、序列、二级结构以及目标DNA起始的数量有关。故对于每一个目标序列出现平台效应的循环数，均应通过单独实验来确定。5 防止DNA的污染：（） 采用DNA酶处理RNA样品。（） 在可能的情况下，将PCR引物置于基因的不同外显子，以消除基因和mRNA的共线性。百合鳞片总RNA提取方法的比较杜运鹏 李双 何恒斌 杨爽 贾桂霞 【摘要】：为了筛选出适合百合鳞片的总RNA的提取方法,本研究以东方百合品种Siberia的鳞片为材料,比较了Trizol法、改良Trizol法、RNA提取试剂盒以及改良CTAB法提取RNA的效果。结果表明:Trizol法、改良Trizol法及RNA plant plus Reagent提取试剂盒均不能提取到完整的RNA;离心柱型植物总RNA提取试剂盒存在DNA污染;改良CTAB法能有效去除多糖,28S条带的荧光亮度是18S条带的1.52倍,D260/D280值都在1.92.1之间,D260/D230值大于2,两个样品的平均得率分别为103.57g/g和119.21g/g,说明此方法适合百合鳞片RNA的提取。RT-PCR结果扩增出了特异性条带,说明改良CTAB法从百合鳞片中提取的RNA质量高、完整性好、产率高,完全可以用于后续的分子生物学实验。灰绿藜RNA提取方法及在cDNA文库构建中的应用摘要:目的：为分离灰绿藜耐盐相关新基因，构建叶片cDNA文库，探索从盐生植物中提取高质量RNA的方法。方法：以灰绿藜叶片为材料，应用RNA Plant Reagent法（Tiangen）、Plant RNA purification Reagent法（Invitrogen）、UNIQ柱式总RNA试剂盒提取法（Sangon）、SDS-LiCl法、TRIZOL试剂法（Invitrogen）等进行总RNA的提取，并构建其全长cDNA文库和抑制消减文库。结果：RNA Plant Reagent法、Plant RNA purification Reagent法和UNIQ柱式总RNA试剂盒提取法获得的RNA完整性均不好；SDS-LiCl法提取的RNA完整性好（28S条带亮度是18S的2倍、条带锐利清晰）、纯度高（A250/A260为189003，A260A230为223002），适合用于直接反转录及构建全长cDNA文库，并获得成功；TRIZOL试剂法简单快捷，产率高（272482gg），完整性较好，可经mRNA纯化后用于抑制消减文库的构建并获得成功。结论：建立了用于构建高质量cDNA文库的灰绿藜RNA的制备方法。CDNA构建分为六个阶段： 阶段1：反转录酶催化合成cDNA第一链 阶段2：cDNA第二链的合成 阶段3：cDNA的甲基化 阶段4：接头或衔接子的连接 阶段5：Sepharose CL-4B凝胶过滤法分离cDNA 阶段6：cDNA与噬菌体臂的连接 详解 一).构建cDNA文库： 以生物细胞的总 mRNA 为模板，用逆转录酶合成互补的双链 cDNA ，然后接到载体上，转入到宿主后建立的基因文库就是 cDNA 文库。 1、mRNA的提取及其完整性的确定 1） 总 RNA 的提取 RNA 提取方法：APGC法或NP-40或应用试剂盒提取总RNA 2）mRNA 的分离 高等真核生物 mRNA 分子的 3 端均有 poly(A) 尾，将总RNA通过寡聚（DT）纤维柱分离mRNA或利用磁珠法制备纯mRNA。在某些情况下，裂解细胞后用蔗糖梯度来制备mRNA-核糖体复合物作为提取mRNA的替换途径。 3） mRNA 的纯化 按照大小对总 mRNA 进行分级，主要用琼脂糖凝胶电泳和蔗糖密度梯度离心法进行分级；多聚核糖体的免疫学纯化法，这是利用抗体来纯化合成目的多肽的方法。 4）mRNA 完整性的确定 确定 mRNA 完整性的方法有三种： 直接检测 mRNA 分子的大小； 测定 mRNA 的转译能力； 检测总 mRNA 指导合成 cDNA 第一链长分子的能力。 2、 cDNA 的合成和克隆 1） cDNA 第一链的合成 用亲和层析法得到 mRNA 后，根据 mRNA 分子的 3 端有 poly (A) 尾结构的原理，用 1220 个核苷酸长的 oligo （ dT ）与纯化的 mRNA 混合， oligo （ dT ）会与 poly (A) 结合作为反转录酶的引物，反转录反应的产物是一条 RNA-DNA 的杂交链。 oligo （ dT ）结合在 mRNA 的 3 端，因此合成全长的 cDNA 需要反转录酶从 mRNA 分子的一端移动到另一端，有时这种全合成难以达到，尤其是 mRNA 链很长时，为此建立了一种随机引物法合成 cDNA 。随机引物是一种长度为 610 个核苷酸，由 4 种碱基随机组成的 DNA 片段。与 oligo （ dT ）仅与 mRNA 3 端结合不同，它们可以在 mRNA 的不同位点结合。随机引物法合成的产物也是 RNA-DNA 的杂交体。把 cDNA 克隆到载体中之前，必须把这种杂交体中的 RNA 转变成 DNA 链，即形成双链 DNA 分子。 2）. 双链 cDNA 的合成 合成 cDNA 第二条链有两种方法。一种方法是利用 cDNA 第一链的 3 末端常常出现发夹环的特征，这种发夹结构是反转录酶在第一链末端“返折”并且进行复制第一链的结果，它为合成 cDNA 第二链提供了有用的引物。用这种方法合成的双链 cDNA 在一端有一个发夹环，可以用单链特异的 S1 核酸酶切去。但是 S1 核酸酶的处理，常常会“修剪 ” 过多的 cDNA 顺序，使 cDNA 丢失了 mRNA 5 端的部分顺序。 另一种方法是用大肠杆菌的 RNase H 进行修饰。 RNase H 能识别 RNA-DNA 杂交分子并把其中的 RNA 切割成短的片段，这些 RNA 短片段仍与 cDNA 第一链结合，可被新合成的 DNA 所取代。新合成的 DNA 存在切口，用 DNA 连接酶把这些切口连接在一起形成一条完整的 DNA 链。 RNase H 法优于 S1 核酸酶法，它能获得包括 mRNA 5 端全部或绝大部分的更长顺序 cDNA 分子。 3） 将 cDNA 重组到载体上 合成的 cDNA 与载体 DNA 进行连接一般有 3 种方法： 借助于末端转移酶的 3 -OH 端合成均聚物的能力，双链 cDNA 和线性化载体 DNA 的 3 -OH 端分别加上均聚核苷酸链； 双链 cDNA 和线性化载体 DNA 分别用 Klenow 片段进行末端补平，然后用 T4 DNA 连接酶进行齐头连接，形成重组体； 通过粘性末端连接。 4）. 转化 重组的载体 DNA 分子在一定条件下转化入大肠杆菌，形成携带质粒的菌株。当不同重组的 DNA 含有不同的 cDNA 基因时，整个转化子含有来自 mRNA 群体的各种 cDNA 基因，这样的转 化子群体构成该 mRNA 全部遗传信息的 cDNA 基因文库。 5）. 目的 cDNA 克隆的鉴定 用于从 cDNA 文库中筛选和鉴定目的 cDNA 的方法主要有 3 种： 核酸杂交 免疫学杂交检测 cDNA 同胞选择近年来随着生物技术的不断发展，出现了许多克隆新基因的方法和手段，如图谱克隆技术、转座子标签技术、mRNA差异显示技术二基因组减法技术以及cDNA文库筛选技术等。但上述方法人多具有实验周期长、技术步骤烦琐且工作量大等特点。cDNA末端快速扩增技术（rapid amplification of cDNA ends，RACE）是一种基于PCR从低丰度的转录本中快速扩增cDNA的5和3末端的有效方法，以其简单、快速、廉价等优势而受到越来越多的重视。经典的RACE技术是由Frohman等（1988）发明的一项技术，主要通过RT-PCR技术由已知部分cDNA序列来得到完整的cDNA5和3端，包括单边PCR和锚定PCR。该技术提出以来经过不断发展和完善，克服了早期技术步骤多、时间长、特异性差的缺点（Frohman等，1995：Schaefer，l995： Chen，1998： Bespalova等，1998： Matz等11999）。对传统RACE技术的改进主要是引物设计及RT-PCR技术的改进：改进之一是利用锁定引物（lock docking primer）合成第一链cDNA，即在oligo（dT）引物的3 端引入两个简并的核苷酸【5-Oligo（dT）16-30MN-3，M=A/G/C；N=A/G/C/T】，使引物定位在poly（A）尾的起始点，从而消除了在合成第一条cDNA链时oligo（dT）与poly（A）尾的任何部位的结合所带来的影响；改进之二是在5 端加尾时，采用poly（C），而不是poly（A）；改进之三是采用RNase H-莫洛尼氏鼠白血。病毒（MMLV）反转录酶或选择嗜热DNA聚合酶可能在高温（60 -70）有效地逆转录mRNA，从而消除了5端由于高CC含量导致的mRNA 二级结构对逆转录的影响；改进之四是采用热启动PCR （hot start PCR）技术和降落PCR（touch down PCR）提高PCR反应的特异性。随着RACE技术日益完善，目前己有商业化RACE技术产品推出，如CLONTECH的MarathoTM技术和SMARTTM RACE技术。邢桂春等（2001）先后使用上述两种试剂盒进行RACE反应，结果发现使用MarathonTM所得到的片断总是比采用SMARTTM RACE试剂盒到所得到的片断短。其原因在于MarathonTM技术反转录反应往往不能真正达到mRNA的5 末端。所以认为，进行RACE反应应当优选SMARTTM RACE试剂盒。以下就国内目前应用最广的SMARTTM RACE试剂盒为例，简要概述RACE技术的原理和操作过程。SMARTTM 3-RACE的原理利用mRNA的3末端的poly（A）尾巴作为一个引物结合位点，以连有SMART寡核营酸序列通用接头引物的Oligo（dT）30MN作为锁定引物反转录合成标准第一链cDNA.然后用一个基因特异引物GSP1（gene specific primer，GSP）作为上游引物，用一个含有部分接头序列的通用引物UPM（universal primer，UPM）作为下游引物，以cDNA第一链为模板，进行PCR循环，把目的基因3 末端的DNA片段扩增出来。（见Figure 1）Figure 1.SMARTTM 5-RACE的原理先利用mRNA的3末端的poly（A）尾巴作为一个引物结合位点，以Oligo（dT）30MN作为锁定引物在反转录酶MMLV作用下，反转录合成标准第一链cDNA.利用该反转录酶具有的末端转移酶活性，在反转录达到第一链的5末端时自动加上3-5个（dC）残基，退火后（dC）残基与含有SMART寡核苷酸序列Oliogo（dG）通用接头引物配对后，转换为以