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重组抵抗素对原代猪前脂肪细胞增殖与分化的影响 摘要 动物脂肪沉积是脂肪细胞数量增加、体积增大以及脂滴聚集的结果。近年来的研 究表明，脂肪组织不仅是机体能量储存的场所，同时也能分泌诸如抵抗素( r e s i s i t i n ) 、 瘦素( 1 e p t i n ) 、肿瘤坏死因子a ( t n f - a ) ，白细胞介素6 ( i l - 6 ) 等多种脂肪细胞因 子( a d i p o e y t o k i n e s ) 调节机体能量代谢调节。本研究旨在探讨抵抗素对猪前脂肪细胞 代谢、增殖与分化的影响及其与胰岛素、胰高血糖素的相互关系。 1 、取1 彳日龄新生仔猪颈部皮下脂肪组织，利用胶原酶消化法获取猪前脂肪细 胞，于3 7 、5 c 0 2 、饱和湿度下进行原代培养，通过m t r 法，油红。染色以及 测定细胞内脂蛋白脂酶活性鉴定猪前脂肪细胞。结果显示，猪前脂肪细胞数量呈指数 增长，于分化第3 天细胞内开始充脂，此后充脂程度逐渐加剧，细胞形态由原始的成 纤维细胞样演变为圆形的细胞形态，同时，细胞内脂蛋白脂酶的活性呈现出先上升后 下降的变化趋势。由此可见，采用胶原酶法获得的细胞符合前脂肪细胞的特征。 2 、为了探讨重组抵抗素水平对前脂肪细胞增殖与分化的影响，将原代培养猪前 脂肪细胞随即分为5 组，分别在含1 0 小牛血清的d m e m f 1 2 培养基中加入o 、5 0 ， 1 0 0 ，1 5 0 ，2 0 0n g m l 的重组抵抗素。通过形态学观察以及测定细胞内甘油三酯含量 和脂蛋白脂酶活性等方法评定前脂肪细胞的增殖与分化情况。结果表明，1 0 0n g m l 抵抗素能显著促进猪前脂肪细胞的增殖，随着重组抵抗素的剂量增加，这种促增殖作 用有减弱的趋势。重组抵抗素同样能促进前脂肪细胞分化，但这种促分化作用随着重 组抵抗素的剂量的增加而增强，细胞的充脂程度越强。 3 、采用六因素三水平正交试验设计( 有交互作用) ，通过m t r 法，油红o 染色， 测定细胞内甘油三酯含量以及脂蛋白脂酶活性来评估重组抵抗素，胰岛素以及胰高血 糖素的交互作用对猪前脂肪细胞增殖与分化的影响。结果表明，l o o n g m l 重组抵抗 素与1 5 0n m o l l 胰岛素相互作用对前脂肪细胞的增殖具有显著性作用，并且显著提 高细胞内脂蛋白脂酶的活性，并且这种促进作用均强于两者各自单独作用时所产生的 影响；而1 0 0n g m l 重组抵抗素与3 0 0n m o l l 的胰岛素相互作用则能显著促进前脂 肪细胞的分化，刺激细胞内甘油三酯的合成代谢。本研究未观察到胰高血糖素对猪前 脂肪细胞增殖和分化的作用，但胰高血糖素能促进甘油三酯的分解代谢，抑制脂蛋白 脂酶活性。 本研究结果表明，抵抗素在调节猪前脂肪细胞代谢、增殖与分化中发挥了重要作 用，前脂肪细胞增殖的数量、分化的时机可能与胰岛素和抵抗素的相互作用有关。 关键词：抵抗素，前脂肪细胞，增殖与分化，猪 e f f e c t so fr e c o m b i n a n tr e s i s t i no np r o l i f e r a t i o na n d d i f f e r e n t i a t i o no f p o r c i n ep r e a d i p o c y t e i np r i m a r yc u l t u r e a b s t r a c t i th a sb e e nw i d e l ya c c e p t e dt h a tt h ei n c r e a s eo fa d i p o c y t eq u a n t i t ya n dv o l u m e ，弱 w e l la sl i p i dd r o p l e tg a t h e r i n gi nt h ea d i p o c y t e ，a r em a i nc o n t r i b u t i o no ff a t t yd e p o s i t i o ni n a n m a l s t h er e c e n ts t u d i e sr e v e a l e dt h a ta d i p o s et i s s u ei sn o to n l yar e s e r v o i rf o re n e r g y s t o r a g e ，b u t a l s os e c r e t eav a r i e t yo fa d i p o c y t o l i n e ss u c ha s l e p t i n ，t u m o r n e c r o s i s f a c t o r - a ( t n f - a ) ，i n t e r l e u k i n - 6 ( i l - 6 ) ，r e s i s t i n ，a n dp l a ya ni m p o r t a n tr o l ei nt h er e g u l a t i o n o fe n e r g yb a n l a n c ea n dh o m e o s t a s i s t h ea i m so fp r e s e n tw o r kw a st os t u d yt h ee f f e c t so f r e s i s t i no n m e t a b o l i s m ，p r o l i f e r a t i o n a n dd i f f e r e n t i a t i o no fp o r c i n e p r e a d i p o e y t e f u r t h e r m o r e ，t h ei n t e r a c t i o na n de f f e c t so fr e s i i t i n ，i n s u l i na n dg l u c a g o n so np o r c i n e p r e a d i p o c y t ew e r eo b s e r v e d 1 s u b c u t a n e o u sa d i p o s et i s s u ef r o mc e r v i c a lp a r tw a sr e m o v e df r o m1 - 7dn e w b o r n c r o s s b r e dp i g l e t sa n dp r e a d i p o c y t ew a so b t a i n e db yc o l l a g e n a s e1 vd i g e s t i o n t h ei s o l a t e d p r e a d i p o c y t e sw e r ec u l t u r e di n3 7 c ，5 d 霸b c 0 2a n ds a t u r a t i o nh u m i d i t ya n ds u b s e q u e n t b y i d e n t i f i e db ym o r p h o l o g yo b s e r v a t i o n ，i e ，m t i o ro i lr e dos t a i n i n ga n dd e t e c t i o no f l i p o p r o t e i nl i p a s e ( u l ) a c t i v i t y t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h ea m o u n to fp r e a d i p o c y t e st e n d t ob e e x p o n e n t i a l l yi n c r e a s e d 3d a y sl a t e r , d i f f e r e n t i a t i n ga d i p o c y t e sf i l l e d w i t hf a t t y d r o p l e ta p p e a r e d h e n c e f o r t h ，m o r ea d i p o c y t e sc o n t a i n i n gf a t t yd r o p l e tw e r eo b s e r v e d ，a n d t h em o r p h o l o g yo ft h ec e l l sh a db e e nc h a n g e df r o mf i b r o b l a s t l i k et or o u n d a tt h es a m e t i m e ，t h ea c t i v i t yo fl i p o p r o t e i nl i p a s e ( u l ) t e n dt od e s c e n df r o mh i g h e rl e v e l t h e r e f o r e , t h ec e l l sc a m ef r o ms u b c u t a n e o u sa d i p o s et i s s u ed i g e s t e db yc o l l a g e n a s ei v ，p o s s e s st h e t y p i c a lc h a r a c t e r i s t i c so fp r e a d i p o c y t e s 2 i no r d e rt o s t u d yt h ee f f e c t so fr e c o m b i n a n tr e s i s t i n o np r o l i f e r a t i o na n d d i f f e r e n t i a t i o no fp r e a d i p o e y t e ，t h ep r i m a r yp o r c i n ep r e a d i p o c y t ew e r er a n d o m l yd i v i d e d i n t o5g r o u p s ，c u l t u r e di nd m e m f 1 2m e d i u mc o n t m n i n g1 0 c a l fs e r u m ，r e s p e c t i v e l y s u p p l e m e n t e dw i t hr e c o m b i n a n tr e s i s t i n0 ，5 0 ，1 0 0 ，1 5 0 ，2 0 0n g m li nt h ec u l t u r em e d i u m t h eo b s e r v a t i o no ft h ec e l l u l a rm o r p h o l o g ya n dd e t e c t i o no fl i p o p r o t e i nl i p a s e ( l p l ) w e r e u s e dt oe v a l u a tt h ee f f e c t so fr e s i s i t i no np r o l i f e r a t i o na n dd i f f e r e n t i a t i o no fp o r c i n e p r e a d i p o e y t e t h er e s u l t sd e m o n s t r a t e dt h a t1 0 0n g m lr e s i s t i nc a ni m p r o v ep r o l i f e r a t i o n o fp r e a d i p o c y t e ，a n dt h ep o s i t i v ee f f e c to np r o l i f e r a t i o nh a sb e e nw e a k e n da st h e c o n c e n t r a t i o no fr e s i s t i ni n c r e a s e di nt h ec u l t u r em e d i u m s i m i l a r l y ，d i f f e r e n t i a t i o no f p o r c i n ep r e a d i p o c y t ec o u l db ep r o m o t e db yr e s i s t i ns u p p l e m e n t a t i o n ，t h es t i m u l a t i o ne f f e c t o fr e s i s t i no np r e a d i p o c y t ew e r ef a r t h e rs t r e n g l 【h e n e da st h er e s i s t i nc o n c e n t r a t i o ni n c r e a s e d m o r e o v e r , t h eq u a n t i t yo ff a t t yd r o p l e ti nt h ei m m a t u r e a d i p o c y t e i n c r e a s e d s i m u l t a n e o u s l y 3 t h eo n h o g o n a le x p e r i m e n t ( i n t e r a c t i o n ) w a sd e s i g n e di n6f a c t o r sw i t h3l e v e l s t h e s ef a c t o r si n c l u d e dr e c o m b i n a n tr e s i s t i n ，i n s u l i n ，g l u c a g o na n dt h e i ri n t e r a c t i o n t h e e f f e c t so np r o l i f e r a t i o na n dd i f f e r e n t i a t i o no fp o r c i n ep r e a d i p o c y t ew a se v a l u a t e db y c e l l u l a rm o r p h o l o g yo b s e r v a t i o n ，t h r i g l y c e r i d ec o n t e n ta n dl p la c t i v i t y t h e r e s u l t s i n d i c a t e dt h a t10 0n g m lr e s i s t i nc o o p e r a t ew i t ha n d15 0n m o l li n s u l i nc a ns i g n i f i c a n t l y e n h a n c et h ec a p a b i l i t yo fp r o l if e r a t i o no f p o r c i n ep r e a d i p o c y t e ，t h el p la c t i v i t yw a sa l s o n o t a b l e l yi n c r e a s e d ，w h i c hi sm o r ee v i d e n tt h a nt h ee f f e c tp r o d u c e db yr e s i s t i no ri n s u l i n d i o n e s i m i l a r l y , b o t ho ft h ed i f f e r e n t i m i o no fp o r c i n ep r e a d i p o c y t ea n dt h i g l y c e r i d e s y n t h e s i z ew e r ea l s os i g n i f i c a n t l yi m p r o v e db e c a u s eo ft h es y n e r g i s t i ce f f e c to f10 0n g m l r e s i s t i na n d3 0 0n m o l li n s u l i n i nt h ep r e s e n ts t u d y , g l u c a g o nh a dn os i g n i f i c a n te f f e c t so n p r o l i f e r a t i o na n dd i f f e r e n t i a t i o no fp o r c i n ep r e a d i p o c y t e ，b u tg l u c a g o nw a sd i s c o v e r e dt o p r o m o t ek a t a b o l i s mo ft r i g l y c e r i d ea n di n h i b i tt h el p l a c t i v i t yo fp o r c i n ep r e a d i p o c y t e t h er e s u l to ft h ep r e s e n ts t u d y s u g g e s tt h a tr e s i s t i np l a ya ni m p o r t a n tr o l ei n r e g u l a t i o no fm e t a b o l i s m ，p r o l i f e r a t i o na n dd i f f e r e n t i a t i o no fp o r c i n ep r e a d i p o c y t e t h e a m o u n to fp r o l i f e r a t e dp r e a d i p o c y t ea n dd i f f e r e n t i a t i o no c c a s i o nw e r er e l a t e dt o t h e i n t e r a c t i o no fr e s i s t i na n di n s u l i n k e y w o r d s ：r e s i s t i n ；p r e a d i p o c y t e ；p r o l i f e r a t i o na n dd i f f e r e n t i a t i o n ；p o r c i n e ； i l l 英文缩写词表 广东海洋大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得 的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个 人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承 担。 作者签名：旒辱 2 。8 年石月3 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和 借阅。本人授权广东海洋大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数 据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于1 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密团。 ( 请在以上相应方框内打“) 作者签名： 导师签名： 2 0 移g 年 2 0p 手年 月多 日 6 月f 后日 广东海洋大学硕士学位论文 1 前言 脂肪组织不仅是哺乳能量贮存的重要场所，同时也是重要的内分泌器官，能分泌 脂肪细胞因子( a d i p o c y t o l i n e s ) ，参与机体能量代谢的调节。对于动物机体脂沉积及 其分布的研究一直都是畜牧工作者的研究热点。探索机体脂肪代谢及脂肪沉积的相关 规律，为进一步提高畜禽产品品质提供理论依据。 m e r s m i n n 等【l 】利用组织化学分析法以及电镜检测对猪脂肪组织发育进行监测发 现，脂肪细胞由初期的多房性逐渐变为单房性的，与此同时，随着细胞的生长，脂肪 细胞中心的脂滴不断增大，但是在当时的实验条件下并未能在脂肪细胞分化的早期分 辨出脂肪干细胞。随着细胞生物学，分子生物学等一系列的研究方法和手段不断完善， 使得对脂肪代谢及脂肪沉积机制的研究提高到细胞分子水平上来。c h e n 脯【2 】通过建立 全长e d n a 文库来研究脂肪组织中相关基因的功能，并且可以利用这一全长c d n a 研 究不同条件( 内分泌，环境，遗传，营养，药理学或者生理学) 调控下脂肪细胞的相 关功能。 近年来，、脂肪细胞生脂过程及其调控受到世界各国学者的广泛关注。利用离体培 养细胞模型研究胰岛素抵抗，肥胖症等疾病的发病机制、利用不同的脂肪细胞来研究 外源性物质对脂肪组织发育的影响是常用的研究手段。脂肪细胞分化决定因子1 ( a d i p o c y t ed e t e r m i n a t i o na n dd i f f e r e n t i a t i o n d e p e n d e n tf a c t o r1 ，a d d l ) 能促进脂肪细 胞中相关生脂基因的表达，但是多不饱和脂肪酸在脂肪细胞分化过程中抑制该因子基 因表达的丰度。l i u 等【3 】在研究不同浓度的二十二碳六烯酸( d o c o s a h e x a e n o i ca c i d ， d h a ) 及不同浓度的抗氧化剂对来源于7 至9 同龄仔猪的脂肪细胞a d d l m r n a 表达的 丰度的影响时发现，d h a 对a d d i m r n a 表达丰度的影响是通过脂肪酸的过氧化反应 机制来进行调控的。利用r t - p c r ，建立c d n a 文库等现代分子生物学的研究手段来监 控脂肪细胞不同发育时期、不同基因的表达水平，有助于揭示脂肪细胞发育过程中的 分子事件，阐明脂肪细胞发育的基本规律。 另外，猪作为生脂能力最强的动物，其生理特点以及代谢功能特点与人都非常接 近1 4 】，因此这种动物模型同渐进入广大研究者的视线，建立相应的研究模型研究脂肪 组织生脂过程的基本规律，包括脂肪组织的形态学变化，生脂过程中对相关细胞因子 的调控等等，对于更好地了解脂肪发育过程及其机制、指导畜牧生产有着十分现实的 意义：利用猪脂肪细胞的离体培养模型有助于深入研究肥胖、胰岛素抵抗等相关疾病 病机理及其防治。 重组抵抗素对原代猪前脂肪细胞增殖与分化的影响 1 1 研究目的与意义 1 1 1 研究脂肪细胞增殖与分化的意义 ( 1 ) 脂肪组织是一个储能组织 众所周知，脂肪组织是一个能量储存的组织。机体能量的动态平衡是由能量的摄 取、贮存、释放( 消耗) 等几个因素综合作用的结果。组成脂肪组织的基本单位是脂 肪细胞，负责储存机体过剩的能量。当机体从外界摄取的能量较生命活动所需的能量 要多时，机体将多余的能量以甘油三酯的形式储存于脂肪细胞中；相反地，当机体摄 入的能量不足以满足机体的需要时，脂肪细胞中的甘油三酯就会被分解，以游离脂肪 酸等形式释放到机体当中以满足机体的能量需要。因此，脂肪细胞是一个甘油三酯的 主要贮存场所，并对调节能量动态平衡发挥着重要的作用。 此外，当甘油三酯贮存于脂肪细胞时，脂肪细胞的体积会逐渐变大，脂肪细胞充 脂，形态上膨胀，变圆。而且在机体一些因素的诱导下，脂肪组织可以不断地分化， 形成新的脂肪组织，脂肪组织在数量与容积上均变大。因此，体脂沉积可以看作是脂 肪细胞数量增多和体积增大的结果。 ( 2 ) 脂肪组织还是一个具有分泌功能的组织 近年相关研究表明，脂肪组织不仅仅是能量的贮存库，而且还能分泌脂肪细胞因 子，如：脂联素( a d i p o n e c t i n ) ，瘦素( l e p t i n ) ，抵抗素( r e s i s t i n ) 等等，这些细胞因子 参与了机体的代谢调控。 随着近年来对脂肪细胞功能的深入研究，人们对脂肪组织的生理机制有了不同层 次的认识。第一，脂肪细胞是一个新的多能干细胞资源。从人脂肪组织分离到的脂肪 源干细胞具有无限增殖能力，表现为正常的二倍体表型，在特定的条件下，这类干细 胞具有潜在分化为多种细胞的能力，如成骨细胞、成肌细胞、成软骨细胞、神经元细 胞的潜能畸。6 1 。脂肪细胞作为新的干细胞源，具有取材方便，获得细胞数量多，在移 植过程中无异体排斥反应等优势；第二，近年来的研究表明，高等哺乳动物的脂肪组 织不仅具有储存能量和维持机体能量平衡的作用，而且还可以作为一个分泌组织参与 机体的内分泌调控h 。脂肪组织除了以甘油三酯的形式储存能量以外，参与组成脂肪 组织的脂肪细胞还能分泌出大量蛋白因子( 如表1 1 所示) 。表中所列的脂肪细胞因 子，有着广泛的生理调节活性。其中有凋控食欲和能量代谢的瘦素( l e p t i n ) ，酰化刺 激蛋i 兰i ( a c y s t i m u l a t o r yp r o t e i n ，a s p ) ，与胰岛素功能有关的a c r p 3 0 和抵抗素( r e s i s t i n ) ， 与免疫功能有关的肿瘤坏死因子q ( t n f c t ) 和白细胞介素6 ( i l 6 ) ，与心血管功能 有关的血管紧张素原( a n g i o t e n s i n o g e n ) 、凝血因子i i i ，与脂蛋白代谢有关的脂蛋白脂 酶( l i p p r o t e i nl i p a s e ，l p l ) ，转运蛋白( t r a n s p o r tp r o t e i n ) ，性激素，前列腺素 2 广东海洋大学硕士学位论文 表1 - 1 脂肪细胞分泌的细胞因子删 分类细胞因子功能影响文献 传送人脑关于体脂贮存的信号；调节 l o 、l l 、 瘦素( l e p t i n ) 食欲与能量消耗：促进脂肪酸氧化作1 2 细胞因子和用，以及调控脂肪形成 与细胞因子肿瘤坏死因子0 t 干扰胰岛素受体的信号传导及可能 1 3 、1 4 相关的蛋白 ( t u m o r n e c r o s i sf a c t o r - a ，t n f 国 导致肥胖症中胰岛素抵抗的发生 白细胞介素6与宿主防御，葡萄糖代谢及脂肪代谢1 5 ( i n t e r l e u k i n 一6 ，i l 一6 )有关 与纤维蛋白 纤溶酶原激活物抑制剂1有效抑制纤维蛋白溶解系统 1 6 、1 7 溶解系统有 ( p l a s m i n o g e na c t i v a t o ri n h i b i t o r - 1 ， p a i 1 ) 关的蛋白 凝血因子h i ( t i s s u ef a c t o r )参与凝血过程的主要分子1 8 肾素血管紧 血管紧张素i i 的前体，参与调节血压 1 9 张素系统的 血管紧张素原 与电解质平衡 ( a n g i o t e n s i n o g e n ，a g t ) 蛋白 可能是联系脂肪组织代谢与替代补 2 0 、2 1 补体及与补 补体因子d ( c o m p l e m e mf a c t o rd ) 体途径的激活的有关分子 体有关的蛋 酰化刺激蛋白( a c y - s t i n m l a t o 巧 影响脂肪细胞中甘油三酯的合成效 1 8 白 p r o t e i n ，a s p ) 窒 脂联素( a d i p o n e c t i n )与胰岛素敏感性有关， 2 2 前列腺素1 2 ( p g h ) 和前列腺素i f 2 。与调控炎症过程，血液凝固，排卵及 1 5 ( p g i f 2 。)酸的分泌功能有关 转化生长冈子p ( t r a n s f o r m i n g 调节许多生物反应，如：细胞增殖，2 3 细胞生长因 g r o w t hf a c t o r - 1 3 ，t g f l 3 )细胞分化。细胞发育与凋亡 子与激素 类胰岛素生长因子i ( i n s u l i n 1 i k e影响许多细胞的增殖，间接影响许多2 4 、2 5 g r o w t hf a c t o ri i g fi )生长激素的功能 巨噬细胞抑制冈子( m a c r o p h a g e 与免疫调节和促炎症反应有关 2 6 i n h i b i t o r yf a c t o r ，m i f ) 其他蛋白抵抗素( r e s i t i n )与胰岛素的功能以及糖代谢有关2 7 、2 8 ( p r o s t a g l a n d i n ，p g ) 和生长因子( g r o w t hf a c t o r ) 等。通过一系列的脂肪细胞因子， 与其它神经内分泌和免疫器官形成广泛联络的神经一内分泌一免疫网络，发挥着众多 的生理调节和病理调控作用。 3 苇组抵抗素对原代猪前脂肪细胞增殖与分化的影响 ( 3 ) 脂肪组织与机体的炎症过程有关 近几年的研究表明，一些炎症过程往往会使得脂肪组织代谢也发生相应的变化。 在一些炎症过程中，由脂肪细胞或者脂肪组织衍生出的巨噬细胞会分泌出一些炎症因 子，参与到机体炎症调节过程中，如：发生肥胖症的同时，会伴随着发生局部脂肪组 织的炎症。目前，在肥胖症当中，有几个相关的炎症因子已经被确认是在发病过程中 起到调节作用的，如：肿瘤坏死因子( t n f - q ) h i 、白细胞介素- 6 ( i l 一6 ) 汹1 。另外， 肥胖的发生是机体多种生理生化因素综合作用的结果，但其核心还是在于过多的脂肪 细胞的生成以及甘油三酯的合成代谢大于分解代谢，导致脂肪过度沉积。并且，肥胖 还伴随有多种危及人类健康的并发症，如：i i 型糖尿病，心血管疾病，高血压等。 虽然i i 型糖尿病的详细发病机理仍没有完全阐明，但i i 型糖尿病的发生与体脂增加紧 密相关，而且肥胖患者体内分泌的各种蛋白因子和游离脂肪酸对糖尿病的发生也发 挥关键性的作用 3 2 j o 此外，最近的研究发现，机体的内分泌系统在内脏多脂症以及全 身心血管疾病也参与了其中的病理生理调节过程的【3 3 】。如表1 2 所示，一些疾病在发 生过程中，从病理生理学角度来看，与之相关的脂肪组织及其分泌的细胞因子也会参 与到其中的调节过程。也就是说，在这些疾病发生的过程中，附近的相关脂肪组织也 会随之发生相应的变化，细胞因子的分泌程度与正常时相比会有所增减。 表1 - 2 不同部位脂肪组织及细胞在疾病炎症病理生理学中的作用 由此可见，研究脂肪细胞增殖与分化的基本规律，阐明前脂肪细胞分化过程中发 生的细胞及分子事件，有利于我们更深入的了解脂肪组织的发育及体内能量代谢和平 衡，为畜牧生产提供一定的理论依据；同时也有利于进一步探讨肥胖及并发症发生的 分子机制，为有效控制肥胖、治疗相关的并发症提供依据。 1 1 2 研究抵抗素对前脂肪细胞增殖与分化影响的意义 自从2 0 0 1 年s t e p p a n 等人发现了抵抗素以来，许多研究都围绕着抵抗素的相关结 4 广东海洋大学硕士学位论文 构及其功能来进行，近几年的研究重点集中在研究抵抗素与肥胖与i i 型糖尿病间的联 系。目前已知，抵抗素是存在于血浆中的富含半胱氨酸的分泌性蛋白，属于抵抗素样 分子( r e s i s t i nl i k e m o l e c u l e s ，r e l m s ) ，又称f i z z s ( f o u n di ni n f l a m m a t o r yz o n e s ) 家族成员【3 5 】。 ( 1 ) 抵抗素可以反馈调节脂肪组织的形成 抵抗素调节脂质的形成是通过负反馈机制进行的。在脂肪细胞分化过程中，抵抗 素分泌增加，但却抑制了脂质的形成。己知3 t 3 l 1 和原代前脂肪细胞向成熟脂肪细 胞分化过程中，抵抗素m r n a 水平明显增高。3 t 3 l 1 脂肪细胞在含有小鼠全长抵抗 素c d n a 表达载体转染的c o s 细胞的条件介质中离体培养，抵抗素抑制8 0 的 3 t 3 l 1 细胞向成熟脂肪细胞的转化。这些调节模式表明：抵抗素可作为动物营养状 态的脂肪传感器，且对脂肪分化产生抑制效应，可能是脂肪形成的反馈调节因子【3 6 】。 另外，机体内抵抗素表达量的变化也与饮食有关【3 7 】，抵抗素可能是作为胰岛素抵抗， 糖尿病发病的一个前期信号。 ( 2 ) 抵抗素可以调控胰岛素介导的葡萄糖运转过程 抵抗素可以抵抗胰岛素的作用，使细胞摄取葡萄糖量下降，同时也使组织对胰岛 素的敏感性下降。体外实验中，3 t 3 l 1 细胞可在培养基中分泌丰富的抵抗素，说明 这一激素可能以自分泌或旁分泌的方式调控胰岛素介导的葡萄糖转运过程。将 3 t 3 一l 1 细胞暴露于纯化的抵抗素i g g 抗血清，监测 3 h 2 一脱氧葡萄糖在胰岛素 ( 5 啪。儿) 刺激后的摄取水平，结果脂肪细胞葡萄糖摄取能力提高4 2 ，而暴露于非 特异性i g g 血清的对照组葡萄糖摄取率无变化。l i u 等1 2 5 对小鼠肌肉注射重组抵抗 素后发现，抵抗素能显著提高小鼠血清葡萄糖水平，在注射2 0 天后，试验组小鼠血 清高密度脂蛋白水平也显著低于对照组，3 0 天后。血清总胆固醇水平也有显著差异。 由此可见，在注射重组抵抗素以后小鼠体内的脂肪代谢以及糖代谢都发生了相应的变 化，即胰岛素抵抗可能与小鼠体内抵抗素基因的大量表达有关，抵抗素可改变机体对 胰岛素的敏感性。 ( 3 ) 抵抗素通过刺激细胞信号抑制因子( s u p p r e s s o ro f c y t o k i n es i g n a l i n g ，s o c s - 3 ) 来减弱胰岛素的作用 s t e p p a n 等( 2 0 0 5 ) 利用3 t 3 一l 1 细胞来研究抵抗素对胰岛素的调节作用。研究结 果表明，抵抗素是通过诱导细胞信号抑制因子( s o c s 3 ) 在3 t 3 一l 1 脂肪细胞中的表 达，抑制胰岛素受体磷酸化，胰岛素受体底物磷酸化、磷脂酰肌醇一3 激酶( p 1 3 k ) 活性、磷脂酰肌醇三磷酸盐产物的生成以及抑制蛋白激酶b a k t 的活性等等来减弱胰 岛素的作用口引。 由此可见，抵抗素在脂肪细胞糖代谢，脂肪代谢、能量平衡以及影响胰岛素功能 5 重组抵抗素对原代猪莳脂肪细胞增殖与分化的影响 巾发挥重要的作用。因此，我们有必要考察抵抗素对前脂肪细胞增殖与分化的调节， 主要考察： ( i ) 抵抗素在脂肪细胞发育过程的哪个阶段进行调控，如何调控： ( 2 ) 抵抗素对脂肪细胞的增殖有何影响：( 3 ) 抵抗紊如何调1 ，脂肪细胞的分化等等。 此外，在众多关于抵抗素牛理活性的研究中，人多数均以啮齿类动物作为研究模 型。以猪前脂肪细胞作为研究模型考察抵抗素对前脂肪细胞增殖与分化影响则鲜有报 道。猪作为生脂能力最强的动物，在生理特点咀及代酣特点上与人有着非常相似的规 律，因此，本研究以猪前脂肪细胞作为研究模型，考察重组抵抗素对前脂肪细胞增殖 与分化的影响，并以此阐明重组抵抗素在脂肪组织发育过程i + j 的调节机制。 2 国内外的研究进展 2i 前脂肪细胞的增殖与分化 阶r彩$ # 变化阶段标志 细胞定型 细胞接触 第一阶段 问壳质+ 目胞 第二阶段 脂肪组织胚细胞 篇箍 m 胞有! 分裂增殖 ( p “a d i p 。q 。i ) ( m i t o s i sc o n a le x p a u “o n ) - - - - + 细胞生长停滞 脂肪# _ 诹 l i p i d - a c c u m u l a t j o n 第口m 段 前麝肪细胞 p m _ d p o c y i e ) 第i 阶段 来成鼎鹰肪细胞 ( i t u r 8a d 。p n 6 ) _ _ _ 。 第六m 段 成熟詹肪细胞 m t u n a d i p o c y t e ) 早期标志：a 2 c o l 6l p l ：i g f j ：k r 能2 0 眷oa d d i s ”r e b p ：。i 黑盟； 宇 晚期标志c e b p a g l u t 一4 p e n l i p i n - i p o g e n i ce u 叫m c $ l l p o l i t i ce n z y m e s 量后标志：l e p t i n ：r # j s t i n ； a d i p s i n fa d i p o n e c t l n v l s f a c f i n ： o m e n t i f l ：c o r s - 2 6 图1 - l 脂肪细胞细胞增殖与分化图【“l 脂肪组织是脂肪细胞的数量上增加和体积上增大的结果。成熟的脂肪细胞可由间 充质干细胞( m e s e n c h y m a ls l x n ec e l l ，m s c ) 诱导分化获得，经过脂肪胚细胞，前体脂 肪细胞，未成熟的脂肪细胞，最后分化为成熟的脂肪细胞( 如图1 1 ) 。 广东海洋大学硕士学位论文 贴壁细胞在体外培养中经历了五个时期，即游离期贴壁期_ 替伏期( 滞留 期) 对数期( 指数增殖期) 生长停止期( 平台期) 的连续过程【4 们。 细胞在接种后呈悬浮状态，称悬浮期( 游离期) ，此时细胞质回缩，胞体呈圆形； 接种至培养容器后，细胞附着于支持物上，细胞进入至贴壁期；贴壁成功后，细胞会 经历一段短暂的滞留期，此阶段的细胞至少进行一次以上的再分裂，才继续向成熟脂 肪细胞分化。细胞在贴壁后经过潜伏期后开始生长，进入指数增殖期后，细胞呈现出 对数增长的趋势，且活力最佳，细胞由最初贴壁时的成纤维细胞样形态变成三角形或 则多边形等不规则形态。当细胞数量逐渐增多时，细胞因接触连成一片而达到接触抑 制继而细胞运动停止，有的细胞则会因为密度抑制而终止分裂。与此同时，前脂肪细 胞内出现脂肪滴聚集，并随着脂肪滴数量不断增加，前脂肪细胞逐渐膨胀，形态也由 不规则形态变为椭圆或者圆形，随着脂肪滴的增多，由于脂滴彼此间的相互作用，许 多小脂滴融合成一个大脂肪滴，细胞核被脂肪滴挤向一侧。 在细胞增殖的过程中，细胞数量上呈现出指数增长趋势。同时，细胞内的某些蛋 白质出现标志性的表达，如：脂蛋白脂酶( l i p o p r o t e i nl i p a s e ，l p l ) 【4 l 】在早期出现较 高的表达水平。因此，可以利用该酶的标志性表达水平来监测前脂肪细胞增殖与分化 的进度。此后l p l 的表达减弱并维持在一个较稳定的水平【2 引。这个时期是前脂肪细 胞一代培养中增殖力最旺盛的时期，细胞数量不断增多，最终相互接触汇合成片，由 于细胞的密度抑制和接触抑制，前脂肪细胞进入汇合期的生长停滞期。此时，前脂肪 细胞在促有丝分裂信号的作用下继续保持着增殖能力，并在促产脂信号的诱导下进入 前脂肪细胞的终末分化阶段。进入该阶段后，定型的前脂肪细胞开始聚集脂滴，并发 生细胞充脂过程。大量分化后期的标志蛋白开始大量表达，如：g l u t 4 ，g p d h ，l e p t i n 等等。这种由前脂肪细胞分化而来的细胞有着典型的脂肪细胞形态特征和功能特征 4 2 - 4 3 j 。此外，成熟的脂肪细胞为终术分化细胞，该细胞也可以逆分化为前脂肪细胞并 同时损失大量细胞质内的脂滴，同时细胞分化标志酶的表达也下降【4 5 1 。因此，利用 成熟脂肪细胞逆分化为前脂肪细胞过程中某些标志性分子，人为控制脂肪滴聚集、调 节脂肪细胞的数目，可有效控制脂肪组织增生与肥大，为肥胖症的预防与治疗提供新 的思路和途径。 1 2 2 前脂肪细胞增殖与分化的鉴定 前脂肪细胞生长发育到一定阶段，也会出现某些与其他细胞相似的生长特征以及 细胞标志，如细胞增殖数量呈现s 型增长等。未定型的前脂肪细胞缺乏特有的形态特 征，也没有特异性酶，因此目自仃仍无法对其进行有效的鉴定。研究表明，定型后的前 脂肪细胞是具有向成熟脂肪细胞分化潜势的基质细胞，并且在其分化过程中会出现一 些其他细胞所不具有的特征。因此，可通过细胞形态学变化，酶活性变化以及相关细 胞因子表达水平的变化等对前脂肪细胞的分化情况进行鉴定。实验证明当甘油三酯合 7 重组抵抗素对原代猪前脂肪细胞增殖与分化的影响 成受障碍时，3 t 3 l 1 前脂肪细胞仍可经历生理生化和形态的变化，这说明细胞的形 态学变化反映了前脂肪细胞分化过程而并非脂滴聚集的结果【4 7 1 。在形态学上，在前 脂肪细胞增殖与分化的过程中，最初呈梭状，接着会形成单层汇合，逐渐聚脂而变圆。 而在同样的培养条件下，成纤维细胞在培养的过程中则仍保留原有的细胞形态以及未 出现聚脂现象1 4 2 1 。 由此看来，前脂肪细胞增殖与分化的过程，具有一些基本的规律：( 1 ) 离体培 养前脂肪细胞其增殖曲线与大多数细胞相似，均呈现出s 型的增长趋势；此规律可以 利用m t t 法来进行测定。因为在一定的细胞数范围内，m t t 与细胞形成的结晶物与 细胞数呈正比；( 2 ) 形念学的变化。由于前脂肪细胞向成熟脂肪细胞分化过程中， 细胞内发生脂滴聚集，形态由梭状逐渐变为圆形，因此，我们可以利用倒置显微镜定 时对细胞的形态学变化进行观察；另外，由于只有脂肪细胞在分化过程中才出现脂肪 滴的聚集，因此利用油红o 与脂滴的亲和性进行染色，如果细胞内红染即证明细胞 内存在脂肪滴的聚集，如果没有，则该细胞不是脂肪细胞；( 3 ) 酶及相关分子标志 表1 3 脂肪细胞分化过程中表达的分子标记 广东海洋大学硕士学位论文 表达变化。在不同分化时期，前脂肪细胞的胞浆成分会发生相应的变化，同时也伴随 着某些分子标记表达水平的变化( 如表1 3 所示) 。 上述分子标志物质在前脂肪细胞不同分化时期的表达水平存在很大差异，彼此之 间相互调