脑胶质瘤治疗新发现-CSFr-1受体阻断对巨噬细胞及肿瘤微环境的影响.docx

脑胶质瘤治疗新发现-CSFr-1受体阻断对巨噬细胞及肿瘤微环境的影响GMB包含多种亚型，包括神经母胶质肿瘤。大多数胶质细胞治疗手段。新的治疗手段作用于胶质肿瘤细胞微环境，例如肿瘤相关巨噬细胞和小胶质细胞TAMs。巨噬细胞依赖于CSF1分化和生存。我们运用CSF1r抑制剂作用于鼠神经源性胶质细胞模型，我们发现可以增加生存率及抑制肿瘤细胞成熟。CSF1r阻滞减缓了病人来源的异种移植颅内胶质细胞的生长。令人意外的是，治疗后老鼠体内，TAMS在治疗后并不减少，在CSF1r抑制的环境中胶质细胞分泌的GM-CSF及INF-帮助了TAMs的存活，活化的M2表达在存活的TAMs中升高，这与肿瘤细胞受损的表现相似。这种基因表达与胶质瘤病人的生存率提高有关。我们的结果证实TAMs是一个治疗神经源胶质瘤的潜在治疗靶点，并证实了tams在csf1r抑制时对GMB的转变。GMB是一种恶性程度高，预后差，对外壳治疗及放化疗不敏感的基本。他的大量异常通路激活导致的的及大量肿瘤细胞的和基因的多样性，是治疗的难点。这种多样性GBM有多中分子型，神经母型、间充质性、神经性、传统型。与之相比，在肿瘤微环境中的非肿瘤细胞是稳定的治疗靶点。在很多种肿瘤中TAMs表达与肿瘤恶性度高预后差有关。CSF-1依赖性efg信号业余乳腺癌和胶质瘤有关。在小鼠癌症模型中，一些手段可以就是消除或抑制TAMs，一个就是CSF1r抑制，可以消耗巨噬细胞并且在很多异种移植肿瘤西行中可以缩小肿瘤。我们使用强效选择性的CSF-1抑制剂作用于非临床的GBM模型，包括RCAS-hPDGFB阴性；Cdkn2a基因鼠，我们称之为PDG鼠，和来源于病人的颅内异体接种的神经母性GBM细胞系的肿瘤球。我们发现CSF-1抑制了胶质瘤的生长机制并不是TAMs的消耗而是胶质瘤微环境对其的“再教育”PDG鼠模型中，可以特定致癌基因传递的RCAS病毒受体有表达，PDGFB。PDG肿瘤包含了人类神经母胶质瘤的生理学和分子学的特性。我们首先研究了zaiPDG GBM中是否像人类一样有大量巨噬细胞聚集。我们确认，大量CD11b阳性骨髓细胞和巨噬细胞在PDG GBMs中大量表达，与正常脑相比。在PDG中MRNA中Cd68,CSF1r的表达升高（Fia.1a.b）胶质瘤细胞和Tams表达CSF1，单CSF1受体仅表达于巨噬细胞中。BLZ945是颅内CSF1r的抑制剂，他对CSF1r的IC50是1nM，高于其他酶活性3200倍。对空白组老鼠骨髓来源的巨噬细胞（BMDMs）BLZ945可以移植CSF1依赖的分化。EC50=67nM。而且可以减少CSF1r的磷酸化，与CSF1r的特异性抗体相同。BLZ945同样可以可以减低CRL-2467BMDMs（PDG鼠来源）和NOD-SCID鼠来源的BMDMs的活性。但是，BLZ945对于PDG肿瘤细胞系（CSF1r阴性）和U87（人来源肿瘤细胞）的增值和PDG肿瘤球的形成并没有作用（Fig.1 d.Fig.3d-g）因此，BLZ945没有直接作用于对胶质瘤细胞，而是通过抑制CSF1r扰乱巨噬细胞。CSF-1r抑制阻断了胶质瘤的进行提高存活率接下来我们将BLZ用于PDG鼠，肿瘤接种2.5周后,30%的动物出现小的肿瘤II-II级,70%的没有肿瘤(通过MRI)(Fig.4ab)我们用BLZ945治疗小鼠并评估期无症状存活(fig1e,) 载体组中位存活时间是5.7周.与之相比,BLZ945治疗提高了长期生存率,64.3%的小鼠活到了26周,实验终点.我们选择这个时间作为实验终点,因为Cdkna缺乏鼠在三十周出现自发的肿瘤.BLZ945在实验中并未出现明显的副作用(fig4e)与以前的病理学结果相符.载体组组织学分型全部是高恶性肿瘤,与之相比BLZ945恶性度低,并且有55.6%的动物并没有发现症状。（fig1g。fig，4cdf）接下来我们检测BLZ945对PDGs的作用，其在组织诊断上和GBM拥有相同的特性。的我们进行了一项7天的包含MRI检测肿瘤初始大小和其发展的实验。（fig2a）我们将患有肿瘤的大鼠所及分组进行blz945和载体的治疗。载体治疗组，肿瘤增大，相比较，blz945组肿瘤停止增大，并且大多数肿瘤变小（fig 2bde Fig 5a.b）随后我们研究了第三组肿瘤大于40mm的用blz945治疗，大多数成年鼠发生了退化。（fig2cde fig5c）载体组不能比较，因为大多数不能活到实验结束。我们确认CSF-1r的磷酸化在所有鼠中被抑制，并且不影响胶质细胞产生的hPGDF-B由于我们使用的是PDGF驱动的模型，我们想拍出BLZ945对假体刘PDGFr信号的脱靶作用。胶质瘤表达PDGFR-，外周细胞表达PDGFR-。PDGFR抑制降低U87的活力。PDG肿瘤在活体或者细胞培养中可能会对PGDFR受体的抑制做出反应。BLZ945与PDGFR的亲和力超过其对CSF1r的亲和力10000倍，不同于PDGFR抑制，blz945或CSF1r抗体治疗对u87或PDG细胞系的发育没有影响。总而言之，这些数据显示blz945对活体的治疗作用是通过CSF-1r的抑制而不是PDGFR的脱靶。为了证实在胶质瘤中CSF1r抑制对其的机制，我们研究了大量肿瘤发生的过程，包括肿瘤分化程度，增殖，血供和对凋亡的抵抗。我们做了一个7日的BLZ945的实验，包括3,7日取组织以观察CSF1r抑制的动态变化。载体组发生高等级肿瘤，二945组动物表现出了以肿瘤细胞减少为特征的表现（fig3a，fig8a）原始肿瘤内的肿瘤细胞减少。（fig3b-d）945治疗后增殖减少显示67-89%的胶质细胞（fig3be），凋亡增加了9-17倍（fig3bf），肿瘤的血管减少，这个降低可能不是由于945对内皮细胞的直接作用。因为他们的在细胞培养中并不受影响（Fig.8b-f）。但是，CSF1r的抑制肿瘤生长和恶性程度的作用可能源自他对细胞增殖的抑制和对凋亡的增加。接下来我们研究CSF抑制在人类神经母GBM中的作用，包括肿瘤球和细胞系培养。肿瘤球和细胞系均为CSF1r表达或基地表达与人类巨噬细胞相比，并且在单次培养中对945都不敏感(Fig.4a,b补充9ab我们将胶质瘤肿瘤球对NOD-SCID小鼠进行颅内注册并用载体和945进行治疗。这四种人类细胞系均对945做出了反应，并抑制了肿瘤的生长抵御肿瘤的侵袭。这些结果证明CSF1r抑制在临床前的实验中在多个神经母GBM中有效，包括了基因鼠和人类异体异种移植。肿瘤提供的生存因子保护TAMs对945诱导的杀伤巨噬细胞的存活依赖于CSF-1r信号通路但我们抑制了CSF1r并不减少巨噬细胞的数量，BLZ945治疗会减少空白组CD11bLy6G细胞，小胶质细胞在正常脑组织中的含量也减少了。但惊奇的是，与载体组相比，CSF1r的抑制组并不减少PDG鼠体内的TAM数量。同样在人类同源肿瘤细胞中TAMs也并没有消耗。BLZ945治疗组治疗保留CSF1r的活体，与载体组PDGs组的表达并没有区别，我们研究了PDG模型中游离胶质细胞核招募BMDMs的比例是否有区别，我们发现并有改变，但是在外周组织中巨噬细胞量减少，但是在PGDs中并没有效果。在鉴定945处理的其他免疫细胞，发现数量并没有区别较前的报道中神经细胞会对CSF1r有影响，所以我们检查了胶质瘤瘤和正常脑组织中，神经细胞并没有变化，这和我们之前研究的CSF1r质表达在巨噬细胞是一致的。研究胶质瘤对TAMs在945诱导的杀伤中的特定的保护作用，我们研究了胶质瘤支持因子是否在CSF1r被抑制的情况下对巨噬细胞的保护作用。讨论我们在这儿展示了一种新的CSF-1r移植引起的抑制肿瘤进展，回缩肿瘤，并且表明可以提高神经母GBD转基因鼠的存活率。同时，CSF1r抑制对大量的人GBM异种移植的的肿瘤也同样的效果，通过对着这些治疗的研究。我们惊奇的发现TAMs在所有模型中均对CSF抑制引起的死亡被特异性的保护，与之对比，正常的脑组织和小胶质细胞被消耗，其他组织中的巨噬细胞同样被消耗，这与之前的报道一致。结果可能由于胶质瘤分泌得因子有助于TAM在945的环境中存活，其他附近的的小胶质细胞由于没有这个信号通路的保护所以被消耗。我们建立细胞培养模型模拟这个微环境，以便我们鉴定和筛选在CSF1r抑制是帮助巨噬细胞讯获得GM-csf和IF-。这些因子核受体表达大量的小胶质细胞与正常组织相比，这和他们的功能一致。这让我们研究CSF1r抑制时Tam的功能，他的数量并没有改变。表达分析存活的TAMs在活体中抑制了M2的活化，这个和钝化肿瘤的作用一致，我们模拟这个细胞培养环境并验证CSF1r抑制逆转了胶质瘤瘤分泌因子诱导的M2的转化，同时也有直接的作用作用于巨噬细胞。数据显示胶质瘤微环境中的因子保护了TAMs因为CSF1r抑制而造成的杀伤，并对其进行“再教育”使其拥有抗肿瘤的作用。这研究有几个临床提示，1，人胶质瘤与巨噬细胞聚集有关，并且对针对Tams的靶向治疗有关。2.我们发现改变TAM的肿瘤促进作用可以有效的降低肿瘤的恶性程度，但针对巨噬细胞的治疗并不消耗巨噬细胞。第三，我们在相关的临床前研究中发现对于人类原位移植神经母GBM和鼠模型中均发现945Z治疗有良好的预后倾向，这可能