（无机化学专业论文）单双核钌（Ⅱ）多吡啶类配合物的合成及其dna键合性质研究.pdf

中山人学2 0 0 8 届硕i 学位论文 摘要 钌 i i 多吡啶类配合物由于其丰富的光化学 光物理性质以及其独特的与 d n a 结合能力 被广泛用于小分子配合物与d n a 的相互作用研究 核酸作为生 物体遗传信息的携带者 介入了生物的生长 发育和繁殖等正常活动 也与致癌 等生命的异常活动密切相关 通过金属配合物与d n a 的相互作用研究d n a 的 结构与功能的关系 有助于人们从分子水平上了解生命现象的本质 全文共分为三章 第一章绪论 介绍了核酸的组成和二级结构 钉多吡啶配合物与双螺旋 d n a 作用的理论基础 研究方法和研究现状和影响金属配合物与d n a 结合的因 素 并阐明钌多吡啶配合物与d n a 作用的实际应用和本课题的选题意义 第二章配体和配合物的合成方法及表征 本文合成了六个新的单双核钉 i i 多吡啶类配合物 用电子吸收光谱 快速原子轰击质谱 出 m s 电喷雾 质谱 e s m s 核磁共振波谱 电化学等进行了比较全面的表征 第三章用电子吸收光谱滴定法 荧光光谱法 d n a 热变实验 圆二色 c d 谱法 粘度测定及电泳实验等方法研究了配合物与d n a 的键合行为 研究配合 物结构对d n a 的键合的影响 实验表明 配合物与d n a 的结合与配体的结构 配合物的形状关系密切 以p h i p 为配体的配合物 r u b p 2 p h i p 2 i 沁 p h e n 2 p h i p 2 由于p h i p 配体较大平面性 以很高的亲和力与d n a 插入结 合 以d i d 为配体的配合物 r u b p y 2 d i d 2 r u p h e n 2 d i d 2 由于配体呈立 体垂直结构 与双螺旋d n a 静电结合 以t h i z 为配体的双核配合物 b p y 2 r u t h i z r u b p 2 4 p h e n 2 r u t h i z r u p h e n 2 4 由于具有较大的空间结 构 通过沟结合方式与双螺旋d n a 作用 关键词 钌 i i 配合物 多吡啶 d n a 键合 d n a 光断裂 中山人学2 0 0 8 俑硕十学位论文 s y n t h e s i sa n dd n a b i n d i n gp r o p e r t i e so f v i o n o n u c l e a r d i n u c l e a rr u t h e n i u m 1 1 p o l y p y r i d y ic o m p i e x e s v i vvi m 面o r n 甜n e y u 觚 f a n gw e i p r 0 佗s s o r m e l 而e ro f t h ec h i l l e a c a d e m yo fs c i e n c e a b s t r a c t i 沁t h e i l i u m i i p o l y p y r i d y lc o m p l e x e s d u et o t h e i rr i c hp h o t o c h e m i c a l p h o t o p h y s i c a lp r o p e r t i e sa n ds p e c i a ld n a b i n d i n ga b i l i t i e s a r ew i d e l yb e i n gu s e di nt h e s t u d i e so ft h ei n t e r a c t i o i l so fm e t a lc o m p l e x e sw i t hn u c l e i ca c i d s d n a a st h c c a f r i e ro fg e n e t i ci n f o m a t i o n p l a y sak e yr 0 1 en o to n l yi i lt h eg r o w t h d e v e l o p m e n to f 1 i f e b u ta l s oi nt h ea b n o m l a lb e h a v i o r so fb i o l o g i c a ls y s t e m ss u c h a st h e c a r c i n o g e l l e s i s b yi r l v e s t i g a t i i l gt 1 ei n t e r a c t i o n so fm e t a lc o m p l e x e sw hd n a w e c a ne x p l o r et h es t n l c t l r e s 如n c t i o n sa n dt h er e l a t i 0 1 1 s h i p se a c ho t h e r 南rn u c l e i ca c i d s a n dt h e c o m p l e x e s i tw i l lb e h e l p 向l t o u n d e r s t a n d i n g t h es u b s t a n c eo f l i f e p h e 肿m e n o na tm el e v e lo fn l o l e c u l e so fac h e m i c a la n db i o l o g i cs y s t e m t h et h e s i sc o l l s i s t so ft l r e ec h a p t e r s t h e1 或c h a 讲e r t h ec o m p o s i t i o no fd n a t h es e c o n ds t m c t u eo fd n a t h e t h e o r e t i c a lf o u n d a t i o no ft h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nt h ec o m p l e x e sa i l dd u p l e xd n a t h e c u r r e n ts i t u a t i o na n dt h er e s e a r c h 埘 e t h o d so f 缸e r a c t i o nb e t w e e nr u t h e n i u m i i p o 帅蜘d y lc o m p l e x e sw i t hd n aa r e 晰e n yi n t r o d u c e d 中山人学2 0 0 8 届硕十学位论文 t 1 1 e2 n d c h a p t e r as e r i e so fn o v e lm o n o n u c l e a r d i n u c l e a r p o l y p y r i d y l r u t h e n i u m i i c o m p l e x e sh a v eb e e ns y n t h e s i z e da n dc h a r a c t e r i z e db yt h ee l e c t r o n i c a b s o r p t i o ns p e c t r a f a b m s e s m s n m r e l e c t r o c h e i i l i s t r ym e a 跚l r e m e n t s t h e3 r dc h a p t e r t h e d n a b i l l 拙gb e l 则i o r so ft h er u i i c 0 m p l e x e sw e r e i n v e s t 远a t e db yt h et e c t l i l i q u e so fe l e c t r o n i ca b s o 印t i o nt i t r a t i o i l e r n i s s i o ns p e c t r a v i s c o s ym e a u s u r e m e n t s d n at h e h n a ld e n a t u r a t i o n g e le l e c t 叩h o r e s i sh a sb e e n u t i l i z e dt oe x p l o r et h ed n a p h o t o c l e a v a g eo f t h ei 己u i i c o m p l e x e s i tl 潞b e e n 旬u n d t h a tt h ed n a b i l l d 证gm e c h a i l i s m so ft h e s ec o n l p l e e sa r er e l e v a n tt 0t h es t n l c t u r e so f l i g a n d sa n dt h es h a p e so fc o n l p l e x e s i m c r e a s i l l gt h ep l a n 甜i t yo ft h eh g a n dp h i p r u b p y 2 p h i p 2 a 1 1 d r u q h e n 2 p h i p 2 s 1 1 0 wh i 曲a 箍n i t yw i t hd u p l e xd n a b u t r u b p y 2 d i d 2 a n d r u p h e n 2 d i d 2 w i t hd i dl i g a n db i r l dt od u p l e xd n av i a e l c e r o s t a t i cm o d eo w i i l gt ot h eu n p l a n a m yv e r t i c a ls t m c t u r eo fh g a n d s d 讪c l e a r c o m p l e x e s b p y 2 r u t h 娩 r u b p 2 4 a n d p h e n 2 r i u t h i z i 沁 p h e n 2 4 s h o w 伊o o v e rb i n d m gw i t hd u p l e xd n a d u et ot h e i r1 a r g eu n p l a n a r i t ys t n l c t u r e k e y w o r d s r u i i c o m p l e x p o 蛳y r i d y l d n a b i n d i n g d n ap h o t o c l e a v a g e i i i 原创性说明 本人郑重声明 所呈交的学位论文 是本人 在导师的指导下 独立进行研究工作所取得的成 果 除文中已经注明引用的内容外 本论文不包 含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作 品成果 对本文的研究作出重要贡献的个人和集 体 均已在文中以明确方式标明 本人完全意识 到本声明的法律结果由本人承担 学位论文作者签名 禽是这劣 日期 解6 月歹日 学位论文使用授权声明 本人完全了解中山大学有关保留 使用学位论文的规定 即 学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交 论文的电子版和纸质版 有权将学位论文用于非赢利目的的少量 复制并允许论文进入学校图书馆 院系资料室被查阅 有权将学 位论文的内容编入有关数据库进行检索 可以采用复印 缩印或 其他方法保存学位论文 学位论文作者签名 理魁这若 日期 五冲8 年 月箩日 导师签名 日期 2 力髫年易月l 厂日 知识产权保护声明 本人郑重声明 我所提交答辩的学位论文 是本人在导师指导下 完成的成果 该成果属于中山大学化学与化学工程学院 受国家知识 产权法保护 在学期间与毕业后以任何形式公开发表论文或申请专 利 均需由导师作为通讯联系人 未经导师的书面许可 本人不得以 任何方式 以任何其它单位作全部和局部署名公布学位论文成果 本 人完全意识到本声明的法律责任由本人承担 学位论文作者签名 魏当芳 日期 捌年1 6 1 月 日 中山大学2 0 0 8 届硕士学位论文 1 1引言 第一章绪论 生物无机化学是无机化学与生物化学交叉所形成的一门内容十分广泛的新 兴学科 在很多生物过程如氮的固定 光合作用 氧的输送 能量转移及很多金 属酶的生物活性中 金属离子及其配合物都起着核心作用 1 1 金属离子及配合物 与生物大分子的相互作用是生物无机化学的最基本反应 大量研究证明 人工设 计合成的小分子金属配合物能够作为生命体内核酸酶的模型配合物 作为核酸探 针识别d n a 构型 从而探索d n a 的结构和功能 作为具有敏感的d n a 分子 光开关性质的d n a 足迹试剂 通过金属配合物结构设计 特异性识别并修复核 酸碱基错配部位 作为癌症等重大疾病的诊断试剂和治疗药物 克服现有临床药 物的毒性和抗药性 2 矧 多吡啶钉 i i 配合物是一类具有多吡啶结构 与钌形成 的配合物 由于强配体场的稳定性 这类配合物常具有六配位的八面体构型 自 从二十多年前 b 砒o n 发现 r u p h e n 3 2 能够立体选择性地结合d n a 以来 大 量的多吡啶钌 i i 被应用于非放射性d n a 结构探针 d n a 分子光开关 d n a 断裂 修复试剂等许多与生命体密切相关的应用领域及d n a 介导的电子转移等 重大理论问题的研究中 取得了许多有意义的成果 并显示出相当大的潜力 7 1 核酸不仅是生命体内重要的生物大分子 而且是生命遗传信息的携带者和传 递者 它不仅对于生命的延续 生物物种遗传特性的保持 生长发育 细胞分化 等起着重要的作用 而且与生物变异 如肿瘤 遗传病 代谢病等也密切相关 因此 核酸是现代生物化学 分子生物学和医学的重要基础之一 因此 金属配 合物 特别是八面体钌多吡啶配合物与核酸的相互作用研究是当今生物无机化学 中一个十分活跃 前景广阔的研究领域 通过金属配合物与d n a 的相互作用 有助于人们从分子水平上了解生命现象的本质 7 1 为了深入研究配合物与d n a 的作用机理 首先了解脱氧核糖核酸 d n a 组成和结构以及配合物与d n a 作用的基本方式等基本知识 中山人学2 0 0 8j 甬硕十学位论文 1 1 1d n a 的分子结构 1 9 5 3 年 两个年轻的科学家w 舐s o n 和c r i c k 提出了d n a 双螺旋结构模型 从分子水平上阐述了生命遗传信息 这在分子生物学发展上具有划时代的意义 从此人们开始在分子水平上研究d n a 的结构特征及其结构与功能的关系 具有 g c 和a t 碱基配对的d n a 双股螺旋是生物遗传信息储存 表达和稳定传递的 重要载体 与生物的生长 发育等正常生命活动以及癌变 突变等异常生命活动 相关 因此 研究d n a 的双螺旋结构所具有的生物学功能 将有助于人们从分 子水平上了解生命现象的本质 并从基因水平上理解某些疾病的发病机理 从而 使通过分子设计寻找有效的治疗药物成为可能 然而 d n a 复制是一个复杂的 过程 会不可避免地产生各种各样的错配情况 碱基修饰碱基错配 1 4 j 等引起的 破坏 使d n a 失去了往日美丽的双螺旋标准构型 另外 由链的弯曲及沟宽的 改变造成的螺旋结构的变形 d n a 三螺旋 1 5 四螺旋 16 1 平行的双股螺旋 1 7 两条链相互插入的双股螺旋及发夹结构 l8 等也日益被人们认识 这些研究对进 一步了解药物及蛋白质与d n a 的作用具有重要意义 1 2 核酸的组成和结构 核苷酸是核酸的基本结构单位 核苷酸可以分解成核苷和磷酸 核苷再进一 步分解为碱基和戊糖 碱基分两大类 嘌呤碱和嘧啶碱 核酸中的戊糖有两类 d 核糖和d 2 脱氧核糖 根据戊糖种类不同 核酸可分为核糖核酸 i 斟a 和脱 氧核糖核酸 d n a 图1 1 列出嘌呤碱和嘧啶碱的结构 h 腺嘌呤 a d e i l i l l e a 鸟嘌呤 蛐e g 2 中山大学2 0 0 8 届硕十学位论文 妒西 尿嘧啶 u r a c 辽u 胸腺嘧啶 t h y m i i l e t 胞嘧啶 c y t o s i n e c 图1 1核酸中五种碱基的结构 1 2 1d n a 的一级结构 d n a 的一级结构是指d n a 分子中核苷酸的排列顺序d n a 顺序 或序列 是这一概念的简称 由于核苷酸之间的差异仅仅是碱基的不同 故可称为碱基顺 序 生物世界里形形色色的遗传信息都包含在组成d n a 的a g c t 这四种 核苷酸的排列顺序之中 d n a 分子中不同排列顺序的d n a 区段构成特定的功 能单位 这就是基因 不同基因的功能各异 各自分布在d n a 的一定区域 基 因的功能取决于d n a 的一级结构 要想解释基因的生物学含义 就必须弄清 d n a 顺序 1 2 2 双螺旋d n a d n a 的二级结构指d n a 分子的双螺旋分子结构 由于d n a 是一种柔性的 生物大分子 这使得d n a 双螺旋可以采取不同的构型 主要有a d n a b d n a c d n a d d n a e d n a z d n a 构型 b d n a 构型是大多数天然d n a 的存 在方式 b d n a 是由两条反向平行的多核苷酸链绕着同一个中心轴构成的双螺 旋结构 磷酸双酯键 氢键 相邻二碱基间的堆积 s t a c k 使得整体的分子趋于 稳定 形成我们所看到像螺旋梯一样的形状 双螺旋分子有点像扭曲的楼梯 而 a t 与c g 就是水平的踏板 一阶一阶排列在两条磷酸脊骨之间 两条多核苷 酸碱基之问依靠氢键连接在一起 形成两种特定的碱基配对 a t 和g c 相邻 碱基对平面之间间隔为3 钱因此碱基平面上分布的 电子云系统之间的吸引 o h 吖少 中山人学2 0 0 8 埔硕十 学位论文 力 碱基上永久性偶极之问的作用力和诱导偶极的相互作用等分子问作用力使碱 基之问存在着堆积作用 在双螺旋表面形成两个凹下去的沟 一条沟大些 一条 沟小些 分别称为大沟和小沟 双螺旋表面的沟对d n a 和蛋白质的相互识别是 很重要的 因为只有在沟内才能接触到碱基的序别 d n a 的双螺旋结构是分子 中两条d n a 单链之间基团相互识别和作用的结果 双螺旋结构是d n a 二级结 构的最基本形式 d n a 双螺旋结构在生理条件下是很稳定的 维持这种稳定性 的因素包括 碱基堆积力 主要 即氢键 盐键 1 2 3 三螺旋d n a 图1 2d n a 双螺旋结构 在双螺旋d n a 的大沟中存在多余的氢键给体和受体 这些氢键给体和受体可 以和专一的结合分子 如蛋白质 发生相互作用 形成专一的复合物 也可以与 4 l ji j 人 2 0 0 8 届硕十学位论文 单链d n a 分子结合形成 螺旋d n a 1 9 5 7 年 d a v i e s r i c h 和f e l s e n f i e l d 等 在研究p o l y r a 和p o l y r u 的相互作用时发现了一种三螺旋r n a p o l y r a 2 p o l y r u 并首次基于试验结果提出了三螺旋核酸的概念 随后 a m o t t 等基于x 射线纤维衍射结果建立了三螺旋核酸分子的简单模型 但由于后来未 获得足够的证据证实其能在体内存在并具有生物学意义 而沉寂了很长一段时 间 直到19 8 7 年m 酞i n 等在酸性溶液的质粒中发现一种h 2 型三螺旋d n a 同年 d e r v a n 等证实可通过将第三股d n a 粘接到含有真实基因的天然d n a 上 引起了 人们的广泛关注 研究结果表明 三螺旋d n a 的形成可能伴随于d n a 转录 复 制和重组等细胞过程 三螺旋d n a 的研究有助于深入理解细胞过程 揭示某些 基因疾病的形成机理 为建立基因疾病新疗法提供全新的思路 1 9 罗 秘啊 1 2 4 四螺旋d n a 幽1 3 三螺旋d n a 结构 在组成r n a 和d n a 分子的五个正常核苷中 只有鸟苷及其类似物能 在溶液中形成广泛的自组装结构 它能在中性和不同盐的浓度下 形成g g 碱基 中山人学2 0 0 8j 莆硕十学位论文 对和g 一四碱基体 g u a j l i l l eq u a n e r s 这种现象起源于对鸟苷 3 和5g m p p o l y r i 和p o l y r g 的研究 发现它们形成的自组装强烈依赖于单价盐离子的存 在 阳离子的种类及其性质 1 9 5 8 年 r i c h 基于p o l y r i 结构的纤维衍射图象 提出了一个环状氢键模型 推测可能为三链或四链结构 后证实为四螺旋 近年 来的x 射线衍射 包括纤维和单晶 多凝胶电泳方法和化学探针试验结果表 明 在体外 染色体的端粒和其它部分富含g 的天然单链序列形成了许多异常 的较高级的结构 包括含有g g 碱基双螺旋 g 一碱基四螺旋结构 现在普遍 认为通过控制适当的条件 如温度 d n a 浓度 缓冲液中的n a 和k 离子的摩 尔比 含有端粒d n a 序列的单链d n a 通式为t l 3 t a 一g 3 4 n 在体外可以形 成多种四螺旋结构 2 0 2 3 1 图1 4h o o g s t e e n 碱基对g 4 螺旋结构 1 3 影响金属配合物与d n a 键合模式及结合力大小的因素 钌多吡啶配合物可在d n a 的大沟或小沟处与之结合 作用的形式通常为非 共价结合 其结合模式包括插入 静电和沟结合 其中插入结合模式最为重要 我们常把多吡啶钌配合物中具有较大平面的配体称为插入配体 另外两个小配体 则称为辅助配体 插入结合是指配合物以插入配体嵌入到d n a 碱基对之间 其 余两个辅助配体留在碱基对外面 配合物与d n a 的键合模式与d n a 本身 配合物的形状 大小等密切相关 6 中山人学2 0 0 8 届硕十学位论文 并由此影响到它们结合力的大小 具体来说 主要有以下几个影响因素 1 3 1d n a 的结构的影响 不同构型的d n a 与同一配合物作用时其键合方式可能会有所不同 由于不 同构型的d n a 的外形 螺旋直径 螺旋方向 大沟和小沟的大小 深浅等均不 同 同一配合物与之键合的方式也不同 如 i 沁 p h e n 3 2 与小牛胸腺d n a 作用 后其吸收光谱出现减色反应 荧光明显增强 而和鱼精d n a 作用后未出现减色 反应和荧光增强现象 用c d 光谱也证明它与小牛胸腺d n a 以插入方式结合 在鱼精d n a 中形成沟面键合 2 4 1 1 3 2 配合物的形状的影响 配合物的形状与d n a 的匹配程度决定了配合物与d n a 的作用方式 s i t l 越 提出配合物是根据其自身的形状 对称性及旋光性质与d n a 特定位点相匹配的 原则对d n a 进行识别的 当配合物中没有供插入的平面配体时 配合物与d n a 的作用主要以静电结合模式为主 如 r u b p y 2 a f p n p 2 和 r u b p y 2 a f p 卜巾 2 相 比 由于a f p n p 并不是平面结构 两者均不能以插入方式与d n a 作用 因p h e n 比b p y 具有较大的疏水性以及扩展的体系 故前者以静电相互作用与c td n a 结合 而后者则通过沟面结合与c td n a 发生作用 若将a f p n p 替换为a n 一 时 苯环可转至与菊胺相同的平面上 故二者均采用经典的插入方式与c td n a 发生相互作用 2 5 1 如图1 5 为b p mp h e l l a f p n p 和a f n p 的结构 7 o b叩 中山人学2 0 0 8 届硕 学位论文 图1 5b p y p h e n a f p n p 和a f n p 的结构 当配合物中含有非平面或带有较大障碍基团的配体往往不能插入 如 d p p q p y m e 2 q p y 2 6 1 等 有些仅能部分插入 如d i p 2 7 1 c i p n i p 2 8 等 有关 配体如图所示 q p y 图1 6 d p p q p y d i p 配体结构图 1 3 3 插入配体的影响 d 砸 插入方式要求配合物的插入配体具有较好的平面性 适中的平面面积和疏水 性 一般来说 插入配体芳环面积越大 配合物与d n a 结合越强 因此插入结 合一般要求具有一个平面的芳香配体作为插入平台 但当增大的平面面积与插入 配体不在同一平面内时 空间位阻增大 配合物与d n a 的结合反而减弱 例如 配合物 r u 唧y 2 i p 2 和 i 沁 b p y 2 p i p 2 与d n a 作用时都表现为插入结合模式 2 9 1 晶体结构表明配体p i p 中苯坏与母环咪唑并邻菲罗啉几乎处于同一平面内 3 0 1 这样配体p i p 插入碱基对与碱基耳 堆积面积要大于配体i p 在相同条件下 前者m l c t 峰的减色率为1 5 5 而后者为2 1 9 后者的荧光增幅也要大于前者 表明配合物 r u b p y 2 p i p 2 与d n a 的结合力大于 r u b p y 2 i p 2 同理 配合物 i 沁 p h e n 2 p i p 2 十与d n a 的结合力也要大于 r u p h e n 2 i p 2 但若配体p i p 中苯 环与咪唑并邻菲罗啉环由于取代基空间位阻效应而不能处于同一平面时 配合物 与d n a 的键合模式及结合力大小则发生明显改变 如配体c i p 中由于苯环邻位氯 原子的空间位阻使得苯环与母环成4 6 夹角 这样配合物 r u b p y 2 c i p 2 与 d n a 作用时只能以部分插入方式进入d n a 碱基对之间 3 l 其m l c t 峰减色率及 中山人学2 0 0 8 屑硕士学位论文 荧光增强幅度均明显小于配合物 r u b p y 2 p i p 2 h n 公n hh i pp i pc i p 图1 7i p p i p c i p 结构图 此外 插入配体的芳环上有取代基时 不同取代基的大小以及同一取代基取 代位置的不同 都会导致配合物与d n a 不同的结合强度和生物活性 因此 在 不影响配合物与d n a 插入键合模式改变的前提下修饰取代以改变配合物的光电 化学性质 可望找到对d n a 的有效断裂进行光断裂 特别是可见光 的有效断裂 试剂 1 3 4 辅助配体的影响 与插入配体的影响相比 辅助配体的影响相对较小 研究也较少 当插入配 体相同时 适当增大辅助配体及其疏水性将有助于增强配合物与d n a 的键合能 力或提高立体选择性 b a n o n 曾报道迄今为止和d n a 作用最强的配合物是 r u p h e n 2 d p p z 2 但我们课题组合成出的和c td n a 作用更强的配合物 l h i p 2 d p p z 2 3 2 它们的键合常数分别为7 5 1 0 6n l o l 1 d m 3 和2 1 1 0 6 m o l d m 3 而 r u b p y 2 d p p z 2 与c td n a 的键合常数则仅为4 5 1 0 6 i n o r l d m 3 这是因为辅助配体i p 的平面面积要比p h e n 和b p y 的大 产生了一 个较大的方向平面 使其疏水性增大 由此增强了配合物与d n a 的作用 但辅 助配体的面积也不能太大 否则会引起空间位阻增大 它的立体位阻将阻碍配合 物进一步插入到d n a 的碱基对中 配合物与d n a 的相互作用反而减弱 9 州 飞丫人 匝 n 中山人学2 0 0 8 屑硕十学位论文 1 3 5 氢键的影响 插入配体中的分子内氢键 也有助于提高配合物与d n a 分子间的亲和力 如 r u b p y 2 h p i p 2 和 r u b p y 2 l l i l a i p 2 具有比相应的 r u b p y 2 p i p 2 十和 r u b p y 2 n a i p 2 更强的d n a 亲和力 这是因为配体h p i p 和l u l a i p 中 其1 0 位的 羟基 能够与眯唑环上8 位的氮形成分子内氢键 扩张了插入配体与d n a 碱基 对平面作用的面积 3 3 1 1 4 金属配合物与d n a 相互作用的研究方法 1 4 1 光谱检测方法 a 电子吸收光谱 由于比较灵敏 直观 方便 它是研究金属配合物与 d n a 作用最常用的方法之一 核酸分子由于其嘌呤和嘧啶碱基具有共辘双键体系 所以在紫外区2 6 0 2 9 0n m 处有特征的吸收 这种吸收随分子中各碱基的种类 所占比例以及碱基 间的堆积方式等的改变而有所不同 一般来说 结构越有序 吸收值越低 因此 我们可利用紫外吸收光谱对上述各核酸分子结构的形成进行初步判断 一般来说 当小分子以插入方式键合于双螺旋碱基对之间时 其吸收光谱表 现出峰位的红移及减色效应 光谱变化的大小与配合物和d n a 作用的强弱有关 插入键合方式的光谱变化要大于其它结合方式 b 稳态和时间分辩荧光光谱 配合物以插入方式与d n a 作用后 配合物 受到了d n a 碱基对疏水环境的保护 它的振动模式受到抑制 或免受水分子的 淬灭 其发光强度和荧光寿命一般会增强 并根据强度的变化来判断与d n a 作 用的强弱 对于常温下没有荧光的化合物可用溴化乙锭 e b 的竞争实验 来 l o 中山人学2 0 0 8 届硕十学位论文 研究其d n a 键合的性质 3 4 1 当配合物与d n a 键合的模式不只一种时 可通过 分解其时间分辨发射光谱 得到不同的激发态寿命 从而推断出配合物与d n a 可能的键合模式 3 4 1 c 圆二色谱 圆二色谱可以检测有无旋光物质的存在 如测量外消旋化合 物对d n a 平衡透析后的透析液可以帮助确定配合物与d n a 有无异构体选择性 结合 还可以帮助我们确定d n a 的二级结构 另外 通过比较己拆分的异构体 键合d n a 前 后其c d 谱的变化 可获得配合物不同构型与d n a 键合方式方 面的信息 d 线二色谱 l d 和电二色谱 e d 线二色谱和电二色谱都是采用与固定 光轴方向 在流动梯度体系中旋转和外加电场 使d n a 螺旋轴取向固定 平行 或垂直的平面偏振光 测量结合d n a 后的配合物对垂直和平行于d n a 的线偏 振光的不同吸收 结合d n a 后的配合物 因d n a 产生微扰 利用微扰理论 计算配合物与d n a 的相对取向 从而为配合物与d n a 的相互作用提供结合方 向 角度等结构方面的信息 3 5 1 e 瞬时共振拉曼光谱 t r a i l s i e n tr e s o n a l l c er a l m a n t r r t r r 可以探测 微环境的变化对配合物激发态的性质或行为的影响 从而可以用来研究配合物与 d n a 的作用机理 b a m n 等人用此方法研究了 r u p h e n 2 d p p z 2 在水中及在d n a 存在下基态与激发态的共振拉曼光谱 3 6 1 d n a 的加入导致t r r 光谱强度的降低 进一步增加d n a 浓度 会引起谱带变宽 甚到消失 他们认为这是由于插入的 d p p z 配体与d n a 碱基对之间强的7 7 c 相互作用 1 4 2 流体力学方法 应用流体力学技术测试d n a 双螺旋长度变化 在确定小分子化合物与d n a 作用模式方面 粘度测试有其独特的应用 当小分子配合物以插入配体通过经典 中山人学2 0 0 8 膈硕十学位论文 插入方式与d n a 作用时 d n a 相邻碱基对的距离会增大以容纳插入配体 导致 d n a 双螺旋伸长 于是d n a 溶液的粘度就增加 3 7 3 8 当以静电 沟面结合等 非插入方式与d n a 作用时 d n a 溶液的粘度变化不大或基本不变 3 9 以部分 或非经典插入方式与d n a 作用时 则可能使d n a 双螺旋发生扭结或弯曲 使 其粘度减少 4 0 粘度测定被认为是在缺少晶体数据的情况下 检测配合物与双 螺旋d n a 是否以插入方式结合的最有效的方法之一 1 4 3 凝胶电泳法 核酸电泳是进行核酸研究的重要手段 是核酸探针 核酸扩增和序列分子等 技术不可或缺的组成部分 钉多吡啶类配合物作为优良的d n a 光断裂试剂 可望 作为d n a 结构探针和诊疗试剂 核酸电泳技术操作简便 快速 可以分辫用其它 方法 如密度梯度离心 所无法分离的核酸片断 已经成为一种常规手段 被广 泛用力研究配合物对d n a 的断裂能力 质粒d n a 一般有三种构型 图1 8 第一种是共价闭环超螺旋d n a f o m i 它的结构比较紧密 第二种是开环缺刻d n a f o mi i 构型 当超螺旋d n a 的一条链上出现一个缺刻时 就成为这种构型 此时 超螺旋结构被松开 不能 超螺旋 因此结构较松散 第三种是线形d n a f o 姗i i i 当超螺旋d n a 的两 条链在同一部位被切断时 d n a 不能成环 完全开放成线状 图1 8 三种构型的质粒d n a 的示意图 三种构型的d n a 分子量完全相同 但是由于立体构型的不同 它们在琼脂 1 2 中山人学2 0 0 8 届硕 学位论文 糖凝胶中的迁移率不同 超螺旋的f o m li 由于结构紧密 通过凝胶向正极移动 走在最前面 其次是线形f o mi i i 而缺刻型f o 肌i i 由于结构松散 向 f 极移 动受到抑制 走在最后面 9 2 纯度较高的质粒d n a 中主要有两种成分 即超 螺旋f o 姗i 和缺刻f o mi i 其中以f o mi 为主 1 4 4 核磁共振 m 垤r 波谱法 n mr 谱能够直接提供配合物和d n a 键合的详细信息 是近几年来在更深层 次上探测小分子化合物与d n a 键合机理所采用的一种技术 利用这一技术 可 判断出配合物与d n a 键合的具体位点 如在d n a 的大沟还是小沟 或碱基位置的 特异性结合等 1 4 5d n a 热变性技术 d n a 的变性指d n a 分子由稳定的双螺旋结构松解为无规则线性结构的现 象 确切地说就是指维持双螺旋稳定性的氢键和疏水键的断裂 断裂可以是部分 的或全部的 是可逆的或是非可逆的 测定解链温度是考察核酸及其与其它物质 相互作用的稳定性时广泛使用的方法 核酸由多链结构 双螺旋或四螺旋 变为 单链结构的中点温度反应了该结构的稳定性 该温度的变化也反应了结构稳定性 的变化 d n a 双螺旋在受热过程中会逐渐解旋 这是一个热力学相变过程 配合物 与d n a 作用方式不同 则d n a 熔化温度 死 变化程度就不同 当配合物与 d n a 以插入方式作用时 d n a 熔化温度 变化最大 被认为是半数碱基 对解旋的温度 4 1 4 2 1 一般 死增加越多 则配合物与d n a 作用越强 中山人学2 0 0 8 甬硕十学位论文 1 4 6 密度泛函计算与分子模拟 由于密度泛函方法 d f t 考虑了电子相关 且计算速度快 近年来已被 广泛应用的金属配合的计算 4 3 4 7 1 随着配合物与d n a 研究的深入 d f r 方法也 被应用于这一领域 通过d f t 计算能够解释配合物的光谱性质及其与d n a 的 相互作用的规律 在研究金属配合物与d n a 的相互作用时 可以运用分子力学 方法进行构象分析 探索配体 配合物与生物大分子的稳定结构和可能的构象 模拟分子反应动力学过程 通过动态模拟计算配合物与寡核苷酸片断结合的最佳 构象 这对指导新型d n a 断裂试剂的设计 合成以及筛选高活性的抗癌药物具 有重要的意义 此外 单晶x 射线衍射 电化学方法也可为研究小分子化合物与d n a 的键 合作用提供一定信息 1 5 钌多吡啶配合物与核酸作用的应用前景 1 5 1d n a 结构探针 钌多吡啶配合物具有丰富的光物理 光化学 电化学性质以及易于通过合成 手段构建各种各样的结构和构型的特点使其在d n a 的结构探针上发挥重要的作 用 八十年代初期 b a n o n 发现配合物 z n p h e n 3 2 的不同异构体与d n a 作用时 存在选择性 由此在生物无机化学方面开辟了用金属配合物作为d n a 结构探针 的新研究领域 4 8 4 9 1 最近报道的 r u 5 6 d m p 3 2 配合物也被发现对二级结构具有 选择性 通过圆二色谱研究证明 一 r u 5 6 一d n l p 3 2 优先结合b 型的p o l yd g c 1 2 而八 r u 5 6 d n 叩 3 2 优先结合z 型p o l yd g c 1 2 核磁实验证明配合物从大沟 插入b 型d n 5 0 总的来说 多吡啶钌 i i 配合物对d n a 二级结构的识别能力 1 4 中山人学2 0 0 8 屑硕 学位论文 主要依赖于配合物自身结构 几何形状及面积 及d n a 结构 沟的深度及宽 度 之间的吻合程度 因此 对于结构相当柔性的d n a 分子 我们可以通过多 吡啶钉 i i 配合物的结构设计 开发出能够对某些特定条件下的特定的d n a 二 级结构进行高效识别的小分子探针 1 5 2d n a 分子光开关 八面体过渡金属多吡啶钌配合物在溶液中可以作为双螺旋d n a 的灵敏荧光 探针 这类配合物与d n a 有较强的结合力 在水溶液中几乎不发光 但加入 d n a 后产生极强的荧光 可作为d n a 的分子光开关 m a i y a 等对d p p z 进行修饰 在七吡嗪环外侧上一个电活性中心的醌 由于 醌在一定电压下可转化为氢醌 结果发现对配合物 r u p h e n 2 q d p p z 施于不同的 电压 其在c h 3 c n h 2 0 溶液中的荧光出现有趣的 开关 o n o 舯现象 也是 将电活性中心与光发射中心巧妙的组合在同一配合物中 由氧化 还原控制荧光 的闭合的 光 电开关 器件 5 1j 我们实验组报道了另一新型具有d n a 分子光开关性能的配合物 r u 唧y 2 h n o i p 2 十 它在水溶液中没有荧光 但加入不同b 型d n a 后 配合 物发出了强烈的荧光 发光量子产率甚至还略大于母体化合物 r u b p y 2 d p p z 2 荧光发射峰位置随不同序列的d n a 而变化 从g c 序列的6 0 7 n m 变化为触1 序 列的6 1 51 1 i i l 该化合物可灵敏检测水溶液中双链d n a 的存在与否 有望发展成 为新型非放射性核酸探针 5 2 最近t u n o 等也发现 r u b p y 2 t p p h z 2 通过加入c 0 2 和e d t a 可以调节荧光 的开关 使其光开关循环 5 3 加入c 0 2 后形成双核配合物 使其荧光淬灭 再 加入比配体t p p l l z 络合能力强的e d t a 使c 0 2 从配体t p p l l z 上离去而与e d l a 结合 从而使荧光恢复 这样通过双核配合物的形成与解离而达到了荧光开关的 循环 而与之结构相似的配合物 r u b p y 2 t a p t p 2 由于不存在多余配位点则没展 示出上述现象 1 5 中山人学2 0 0 8 屑硕十学位论文 1 5 3 对非正常双螺旋d n a 结构的识别 1 5 3 1 错配碱基对的结构特征及其分子识别 尽管 正常碱基是通过通过氢键作用形成互补配对的 但是 维持d n a 螺 旋整体稳定性的 除此之外还包括其他各种堆积作用 这些堆积作用跟整个序列 有关 这就导致在d n a 复制过程中不可避免的产生很多各种各样的错配情况 碱 基不再遵守w 缸s o n c r i c k 规则进行配对 另外 复杂的生化环境对d n a 碱基造 成巨大的修饰破坏 人类基因大约含1 0 9 个碱基对 任何对d n a 的理化破坏都 会影响到d n a 复制过程 导致错配甚至断链的发生 5 4 蛋白质识别修复系统在 维持d n a 的精确复制中发挥很重要的作用 5 5 修复酶利用错配碱基对有使双螺 旋骨架去稳定而解旋的作用来识别错误的碱基配对 5 6 1 然而 生物体内仍有许 多未被完全修复的错配碱基对存在 任何形式的复制错误都会导致子系d n a 分 子的诱变 可能引发致命的基因疾病 最初 w a t s o n c r i c k 提出了错配理论 他们认为 碱基从酮式转变为醇式 从胺基转变为亚胺基的互变异构性是引发诱变的主要因素 这些互变异构体可以 形成a c 和g t 配对 5 7 但是后来的大量此类诱变研究 5 8 表明 主要的错配形 式是g t 和a c 的w r o b b l e 配对 而不是碱基的互变异构体配对 晶体结构的研 究也证实了这一点 5 9 1 研究表明 在生命体系中 w a t s o n c r i c k 与错配碱基对之 间存在竞争 不考虑溶液酸碱性和碱基定向的情况下有8 种可能的错配 g t a c g g a a g a c c t t c t 此外 碱基之间除了按照标准的配 对方式外 可以按照反标准配对 h o o g s t e e n 和反h o o g s t e e n 配对 这些配对形 式是形成三链和四链螺旋的结构基础 研究表明 g a 错配比其它类型的错配更难修复 鲫 这一发现引起科学家们 极大的兴趣 该错配有四种存在模式 6 l 6 2 1 它的结构受到酸碱性 盐度和错配 位置的序列环境等影响 6 3 6 引 例如 在中型溶液中为g a n t i a a n t i 构型 在酸性 溶液中为g s 1 1 a a n t i 构型 该错配碱基对对序列的依赖性可能源于错配碱基于 相邻碱基之间的偶极一偶极作用 6 2 和氢键作用 6 3 1 w i l s o n 工作组发现富含嘌呤 的寡聚核若酸与自身配对形成的双螺旋与正常双螺旋有相似的稳定性 6 9 g a 错 1 6 中山人学2 0 0 8 届硕 学位论文 配结构性多样 这对酶的识别及修复系统是一个巨大的挑战 也是生物体内g a 错配难以识别修复的重要因素之一 但是 在大多数情况下 细胞可以通过自身的复杂的修复体系来修正这些错 误 如果修复失败 将导致多种遗传疾病和癌症等严重后果 因此检测和修复错 配碱基将有利于新的诊断化学治疗试剂的丌发 b a n o n 设计了可以特异性识别碱基错配部位的铑 i i i 配合物 蹦b p y 2 c h r y s i 3 并通过光照切断与错配部位相邻的碱基的磷酸骨架 配体 岫s i