胎兔与成兔皮肤瘢痕基因差异表达的分析.doc

胎兔与成兔皮肤瘢痕基因差异表达的分析作者：吴志远,孙雪峰,罗少军,江黎明单位：524001 广东省湛江市，广东医学院附属医院整形外科研究所(吴志远、罗少军、江黎明)；河北北方学院附属第二医院(孙雪峰)【摘要】 目的 探讨胎兔及成兔皮肤瘢痕基因表达变化的特征及其可能的生物学意义。方法 建立动物模型，收集胎兔及成兔皮肤愈合处的皮肤组织，用基因芯片技术检测胎兔及成兔皮肤瘢痕的基因表达变化规律。结果 基因芯片高通量地揭示了胎兔及成兔皮肤瘢痕的基因表达变化的信息，差异表达基因有117个，其中下调的基因有28个，上调的基因有89个，涉及十大类基因。结论 胎兔及成兔皮肤瘢痕的基因图谱存在差别，这些基因可能参与了瘢痕的形成过程。【关键词】 皮肤 基因芯片 基因表达Analysis of expressed genes in fetal rabbit skin and the scar of adult rabbitWU Zhiyuan，SUN Xuefeng，LUO Shaojun，et al. Guangdong Medical College, Guangdong, Zhanjiang 524001【Abstract】 Objective To analyse the changes of genes and their biologic significance that occurred in fetal rabbits skin and the scar of adult rabbits.Methods The animal model was established, and the samples were obtained from the fetal rabbits skin and the scar of adult rabbits,and rules of expressed genes in all the samples were detected by using gene chip.Results Gene chip disclosed a large scale of information in current stduy. 117 different genes in fetal rabbits skin and the scar of adult rabbit were found, in which 28 were downregulated and 89 were upregulated.Conclusion There are differences of gene expression between fetal rabbits skin and the scar of adult rabbits by using gene chip analysis, and maybe these genes are involved in the development of scar in rabbits.【Key words】 rabbits; scare; gene chip; gene expression 目前对皮肤的认识已深入到分子领域，寻找皮肤瘢痕形成过程中的相关特异性基因已显得十分必要。本实验通过基因芯片技术研究胎兔及成兔皮肤瘢痕基因表达变化的待征，探寻皮肤瘢痕形成过程中的基因表达规律，实现基因水平调控皮肤创伤修复和组织再生及瘢痕形成中得到直接的预防和干预手段。1 材料与方法1.1 标本来源及收集 建立动物模型，取孕22 d的成兔3只，在麻醉下暴露孕兔背部，切取面积为2 cm×1 cm的全层皮肤，予以原位缝合，然后将孕兔行剖腹术，按同样方法，取一只胎兔行手术。继续饲养8 d，取原孕30 d的成兔，切取原手术处皮肤及瘢痕组织，共获3组标本，多聚甲醛固定，包埋切片备用。1.2 总RNA抽提和测定 按Chomczynski等1提出的一步法，分别抽提胎兔皮肤组织和成兔瘢痕组织的总RNA，用Licd沉淀法纯化后紫外分析及电泳检测显示获得了高质量的纯净总RNA。1.3 mRNA分离纯化按照Oligotex mRNA spincolumn protocol2分离纯化mRNA，紫外分析其质量。1.4 芯片制备 美国SuperArray公司提供含14784基因芯片。用通用引物进行PCR扩增，PCR引物长度为13 000 bp，靶基因以0.5 μg/μl在硅烷化玻片上点样，点样后玻片凉干备用。1.5 表达谱探针制备 参照Schena2方法标记cDNA探针并纯化，用Cy3dTUP标记胎兔皮肤组织cDNA,Cy5dTUP标记成兔皮肤瘢痕组织。1.6 杂交与扫描及结果的分析 将基因芯片与制备探针杂交后，扫描Cy3Cy5两种荧光信号的强度和比值，用专用软件分析，差异表达的标准为基因表达变化在2倍以上为阳性。1.7 统计学分析 本次实验均采用背部相同部位皮肤标本，采用两两比较和聚类分析方法。2 结果2.1 总RNA抽提结果 各标本提取的总RNA A250/ A280值达1.8171.928，电泳结果证实所抽提的总RNA的纯度符合实验要求。2.2 生物信息学分析 以Ratio<0.5和Ratio>2.0作为基因下调和上调的比较标准(95%的可信区间内)，比较胎兔及成兔皮肤瘢痕基因差异表达。3组间均出现的差异表达基因有117个，其中下调的基因有28个，上调的基因有89个。 按专用处理软件的生物信息学分析涉及10大类基因：原癌和癌基因(8个)、细胞骨架和运动相关(16个)、细胞信号和传递蛋白相关(30个)、代谢相关(13个)、蛋白合成翻译(6个)、离子通道和运输(1个)、细胞周期蛋白(3个)、DNA结合转录(3个)、细胞凋亡(1个)、其他(36个)。通过对数据结果的聚类分析，胎兔皮肤参与蛋白翻译、能量合成和DNA复制的基因表达较活跃，如DNA聚合酶、苹果酸酶以及烯醇酶、髓过氧化物酶，ATP酶许多与细胞外基质特定转录蛋白有关的各种转录因子、转化酶合成酶等相关基因呈高表达；成兔皮肤瘢痕组织凋亡相关基因、蛋白合成翻译及原癌基因和抑癌基因表达异常。3 讨论 皮肤创伤治愈涉及到各种细胞、细胞外基质、可溶性介质、生长因子、以及细胞分子之间的相互作用，这是一个网络式的，由各种分子信号高度调控的，受到基因控制的复杂系统工程，任何环节的异常都可能导致连锁性反应，因此要捕捉到这种网络式的多种基因变化，就必须依赖先进的生物学技术，基因芯片的开发和应用不仅更新了瘢痕研究的理念，而且为基因水平上探索瘢痕的发生机理及防治方法提供了简单、高效、精确的研究手段3。成人皮肤受到创伤后，愈合过程中，伴有瘢痕形成，而胎儿皮肤伤口呈无瘢痕愈合4。虽以大量的基础和临床实验研究，胎儿无瘢痕愈合分子机制始终未解之谜5。随着胎儿无瘢痕愈合分子机制的深入研究，寻找从胎儿与成人皮肤内在特性研究瘢痕产生的根源及相关调控基因已显得十分必要6。 瘢痕的形成过程包括损伤及炎症反应、细胞外基质堆积、胶原过度沉积及瘢痕的改建3个基本过程。许多因素如各种炎性细胞(尤其是成纤维细胞)、细胞因子、细胞生长因子、蛋白酶、多糖等均参与了增生性瘢痕的形成7。而且，其相互间的关系，作用机制仍没有清晰的了解。因此，许多年以来，瘢痕的治疗是仍未攻克的难题，虽然经过长期、大量的研究，目前积累的资料仍然零碎而不系统8。本实验通过建立动物模型，筛选出的差异表达基因全面反映了瘢痕增殖形成过程中炎性细胞(尤其成纤维细胞)的分裂增殖、细胞信号转导、细胞凋亡、细胞骨架支、受体、蛋白翻译合成、代谢等各方面的变化。可以看到，随着芯片扫描例数的增加，最终集中到数量不多的基因上。这些基因或许就是重要或关键的相关基因，对它们在分子与蛋白水平的重新研究，将会得到新的结论。在本实验中发现了更多的肌动蛋白、原肌球蛋白、波形蛋白、前纤维蛋白等相关基因的异常表达。另外，细胞外基质(扣纤维连接蛋白、胶原纤维)、多种细胞因子、免疫因子均参与了瘢痕的形成。本实验中的117个共同表达的差异基因中已知基因仅占1/3，而大量未知功能的基因目前仅知道其序号、如何进行功能研究也是新的课题。本研究为进一步寻找相关瘢痕调控基因，实现基因水平调控皮肤创伤修复和组织再生及瘢痕形成中寻找到直接的预防和干预手段，进而为研究皮肤无瘢痕愈合的机制打下基础。【参考文献】 1 Chomcznyski P，Sacchi N. Singlestep method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate phanol chloroform extration.Anal Biochem,1987，162：156.2 Schena M, Shalon D,Heller R, et al. Parallel human genome analysis: microarraybased expression monitoring of 1 000 genes.Proc Natl Acad Sco USA,1996,93:10614.3 王春梅，百束比古，张启旭，等.瘢痕疙瘩成纤维细胞的基因组学研究.中华整形外科杂志，2005，21：299301.4 Burrington JD.Wound healing in fetal lamb. J Pediatr Surg,1971，6：523528.5 程飚，付小兵，盛志勇，等