1挑战杯资料 汇编 挑战杯作品3 获奖作品 一等奖 2正

第七届“挑战杯”广东省大学生课外学术科技作品竞赛获奖作品过渡金属离子对蛋白质水解作用的研究 *本作品获第七届“挑战杯”广东省大学生课外学术科技作品竞赛一等奖段海华 梁耀辉 秦绿叶 黎瑞明 陈丽 指导老师：乐学义 刘国武（理学院，华南农业大学，广东广州，510642）1 前言我国的废弃蛋白质资源十分丰富。仅十几亿人口每年的人发渣就达几十万吨。猪、牛、羊、等牲畜的毛、蹄角以及鸡、鸭、鹅、等禽类的羽毛每年都在百万吨以上。利用这些废弃蛋白质水解制取氨基酸，开发氨基酸资源，成了既利于环保，又符合可持续发展的绿色科研课题。提高蛋白质的水解效率是开发氨基酸资源的最重要环节，也是化学界少人问津的难、重课题。1.1 蛋白质水解研究综述氨基酸是蛋白质的基本结构单位。蛋白质水解制取氨基酸的方法主要有酸水解法、碱水解法、酶水解法三种。在美国，Brehm Josef 等人将动物或蔬菜磨成粉末，并以此为原料，在pH值10.0-14.0，70摄氏度以上反应，制得氨基酸。另外，Blortz Doris 等人用肽链内切酶和肽链外切酶水解动物产品，制得口感较好的氨基酸。不过，酶水解法的水解率太低，而碱水解法会使丝氨酸、苏氨酸、精氨酸以及半胱氨酸遭到破坏，并使其它的氨基酸外消旋化。因此目前应用得最广泛的是酸水解法。本实验正是采用酸水解法。酸水解法中，盐酸水解法使用较为广泛，一般用6-10molL-1 盐酸水解7-24h。优点是氨基酸不易被破坏，但盐酸易挥发，对设备、环境及生产工人的健康均有不良影响，且浓盐酸的浓度较低，生产过程中耗量大，运输费用大，脱酸费用高。硫酸水解法一般用3-5 molL-1 硫酸，水解时间同盐酸法相当。优点是硫酸挥发性小，可选用石灰乳或碳酸钙中和脱酸，生成的硫酸钙沉淀经分离而除去，生产成本低。不足之处是个别氨基酸如色氨酸会损失。另外副产品硫酸钙也是一种良好的饲料添加剂，对畜禽补充钙，用硫酸钙优于用碳酸钙。综合考虑，硫酸水解法优于盐酸水解法。毛发等角质蛋白是随处可见的废弃蛋白。羽毛被广泛用做羽绒原料，但鸭毛、鹅毛提绒后剩下约40-50% 羽毛梗未被利用，国内鸡毛大多数被白白扔掉，其粗蛋白含量在80% 左右，因此从羽毛中提取复合氨基酸前景广阔。朱曜利用畜禽毛角作原料，在10 molL-1盐酸中，117下水解6.5-7h，料酸比为1：1.8，滤液用氢氧化钠中和至pH=4.8。静置沉淀，分离干燥，制得复合氨基酸。朱广军将洗净的鸡毛用10 molL-1盐酸在105108水解10h，水解液用氨水中和至pH6.5-6.8，真空蒸馏除水，干燥即得混合氨基酸。羽毛梗作原料，除杂、洗净、晾干、粉碎，加入1.7倍 10 molL-1盐酸，在105108水解12h，滤液用9 molL-1氨水中和至pH6.5-6.8，直接减压蒸馏滤液，脱水后干燥，粉碎制得复合氨基酸。1.2 氨基酸二次开发研究综述已发现自然界有一百多种氨基酸，但从蛋白质水解产物中分离出来的氨基酸通常只有20种。除脯氨酸外，这些氨基酸在结构上都有共同点，即与羧基相邻的 碳原子上都有一个氨基，因此称为氨基酸。氨基酸都是白色的晶体，各有特殊的结晶形状。熔点较高，通常在200以上，大多数可溶于水中。复合氨基酸与铜、铁、锰、锌、钴等的无机盐在一定的工艺条件下螯合，可制得复合氨基酸微量元素螯合物。就氨基酸而言，最常见是作为二齿配体，以碳上的氨基和羧基作为配位基团同金属离子配位，形成具有五元环结构的较稳定的螯合物。在一定条件下，氨基酸侧链的某些基团也可以参与配位。氨基酸螯合物在营养学上也有很高效用，因此，引起有关专家的广泛关注。汪建伟等人将鸡羽毛洗涤、高压蒸煮、甩水、干燥、粉碎后制成羽毛粉。用200g 羽毛粉、9 molL-1HCl 600mL，电动搅拌保温回流1012h，至无双缩脲反应为止。水解液经减压蒸馏赶酸，然后脱色，再加入Fe2O3 15g，在90-100搅拌反应。待Fe2O3 完全溶解后，用10% 氨水调整pH4.0。继续保温搅拌反应3-4h，至反应液无三价铁离子为止。将反应液减压蒸发浓缩至液面出现结晶膜，冷至室温，结晶陈化4-5h，减压抽滤。将结晶80烘干成粉状，即得复合氨基酸铁铵成品97.2g，收率为44.2%。 谭钦德等人将头发或鸡羽毛等物500-600g 用浓度为3.5 molL-1的硫酸溶液1800-2000mL 浸泡，浸泡充分后转入水解装置，甘油浴中加热至酸液微沸，控制水解温度为115-118。反应7h 后取样用甲醛法测定氨基酸含量。此后，每隔2h 取样分析一次。到达水解终点的时间为：头发14h，鸡羽毛11h。水解液用适量活性炭脱色后，慢慢加入石灰乳中和至溶液pH=2.0，立即抽真空过滤，滤饼用pH=2.0的硫酸溶液洗涤3次。收集滤液在水浴上蒸发浓缩，冷却后得混合氨基酸固体。按氨基酸：稀土=3：1（摩尔比）分别称量氨基酸和稀土氧化物，各溶于水，使两者混合，于水浴上加热反应并蒸发近干，得混合氨基酸稀土配合物。他们还提出甲醛法的本质是测定氨基酸的酸性基团（-COOH），由于水解液中有H2SO4或HCL 存在，在测定酸性基团前需用容量分析法对无机酸作定量分析。这样在连续滴定时，会因溶液中同时存在两种指示剂，致使甲醛法的终点变色不明显而影响测定结果。为减少因判断变色失误而引起的误差，本论文在最后滴定时除用指示剂外，还用pH计判断滴定终点。1.3 氨基酸配合物效用研究综述微量元素是动物体所必需的营养要素之一,直接或间接地参与机体几乎所有的生理和生化功能,对生物的生命活动起着极其重要的作用。微量元素的营养作用经历了三个发展阶段，第一代产品即无机盐类添加剂，如硫酸铜、硫酸锌等；第二代产品即一些简单的有机化合物，如乳酸铜、富马酸亚铁、葡萄糖酸锌等。以上两类特别是第一代产品存在许多缺陷，吸收及生化功能差，微量元素之间的拮抗作用明显，不能满足动物生长的需要。第三代产品即氨基酸微量元素螯合物，最先由美国Albicn实验室研制成功，并以“Metalosates”商标获得专利。微量元素的吸收是在肠内吸收处或在消化前与氨基酸蛋白质进行螯合，由于机体螯合矿物质的自然能力有限，未被螯合的游离金属离子则不能被吸收。通过氨基酸与微量元素的螯合，克服了第一、二代产品的缺陷，具有抵抗干扰、缓解矿物质之间的拮抗竞争作用，有良好的化学生化稳定性，在机体内环境条件下溶解性好，易被动物体消化吸收，生物学效价高，并且可加强动物体内酶的活性，促进蛋白质、脂肪和维生素的利用率，显著降低饲料消耗，提高动物的健康水平 。氨基酸螯合物还具有一定杀菌和改善免疫功能的作用，对某些肠炎、皮肤病、痢疾、贫血有治疗作用。总之，氨基酸螯合物的应用安全性高，用于动物适口性好、增重明显，同时也克服了在饲料中添加过多一、二代产品造成的矿物质中毒及浪费现象。基于上述优点，氨基酸螯合物越来越受到科技界的关注，用途日益广泛，使用领域不断扩大。现已开辟的领域有以下方面：1、用作医疗保健品，补充人体微量元素；2、代替无机盐应用于饲料工业；3、用于化肥、农药。钟国清和曾仁权指出，在制备氨基酸螯合物的过程中，为降低生产成本，提高经济效益，可以在酸水解过程中加入适当金属盐，把水解与螯合反应结合起来，并进行了有关试验，取得了初步效果。3不过有关应用这种方法的文献非常少。本论文就是在蛋白质水解过程中加入Mn2+、Fe2+、Co2+、Mg2+、Ni2+、Cu2+、Zn2+等金属离子，试图探讨这些金属离子对水解反应是否有促进作用，若有促进作用看促进作用有多大，以及在水解过程中是否有氨基酸配合物生成。2 实验材料与方法2.1主要实验材料鸡毛，毛发，甲醛，甘油，九水合硫化钠，30%的双氧水，甲基红指示剂，酚酞指示剂，活性炭，扩展剂（正丁醇：醋酸：水为4：1：3），0.1水合茚三酮乙醇溶液，氢氧化钠，七水合硫酸锌，硫酸镁，五水合硫酸铜，四水合氯化锰，六水合硫酸铁，六水合氯化钴，六水合硝酸镍，2.0 molL-1，3.5 molL-1，4.0 molL-1的硫酸溶液，0.1012 molL-1的氢氧化钠的标准溶液。2.2实验设备 三角瓶，PH计，碱式滴定管，温度计，层析缸，层析滤纸，烧杯，球形回流管，称量瓶，毛细玻璃管，量筒，烘箱，天平，滤纸，抽滤瓶，布氏漏斗，电热套，干燥器。2.3实验方法2.3.1硫酸水解毛发10g毛发加3.5 molL-1硫酸35mL，加2.0 molL-1硫酸35mL，（加30双氧水加速溶解）反应温度为110到115，纸色谱法监测反应进程，甲醛法测定氨基酸含量，在毛发刚刚溶解时加入不同的金属离子，通过比较甲醛法及纸色谱的结果，确定不同金属离子对水解反应的影响。2.3.2硫酸水解鸡毛10g鸡毛加4.0 molL-1硫酸35mL，加2.0 molL-1硫酸35mL，反应温度为110到115，纸色谱法监测反应进程，甲醛法测定氨基酸含量，鸡毛刚刚溶解时加入不同的金属离子，通过比较甲醛法及纸色谱的结果，确定不同金属离子对水解反应的影响。2.3.3复合氨基酸螯合物的制取用上面剩余的水解液，用活性炭脱色，碳酸钙中和硫酸，抽滤，蒸去大部分滤液，重结晶得晶体。2.3.4复合氨基酸含量的测定甲醛通过下式与氨基酸反应，生成酸，可用氢氧化钠滴定之，据此确定氨基酸量。4NH4+6HCHO=（CH2）6N4H+3H+6H2O用NaOH滴定生成的酸，进而推断出原样中NH4+的含量。OH-+H+=H2O(CH2)6N4H+OH-=(CH2)6N4+H2O如果被测样品中含游离的酸或碱，则需事先加以中和。复合氨基酸含量的测定可以用甲醛法即准确移取一定体积V（L）复合氨基酸溶液，先用硫化钠除去金属离子，脱色，加甲基红指示剂，用氢氧化钠中和至刚显黄色，加4mL中性甲醛溶液 ,摇匀静置5分钟，加酚酞指示剂，用0.1012 molL-1的NaOH标准溶液滴至 pH=9.2,记下加甲醛后所消耗的碱量 (V1 )。同样空白测定耗碱量 (V2 )。氨基酸含量 % =(V1 - V2 ) CNaOH MA 100 / W1000V/V总式中 V1 ,V2 分别为试样及空白加甲醛后所消耗的 NaOH体积(mL )，CNaOH NaOH标准溶液的物质的量的浓度 (molL-1)， MA氨基酸平均分子量，W被测试样的克数，V取出的水解液的体积，V总水解液的总体积。通过上述方法，可以比较不同水解条件下，氨基酸含量的不同，从而确定最佳的反应条件。氨基酸平均分子量M= 20种天然氨基酸的分子量的总量/20 =134水解液的总体积 V总=35mL（没加双氧水）水解液的总体积 V总=42.2mL（加双氧水）2.3.5 纸色谱法取层析滤纸（615）一张，在纸的一端距边缘2cm处用铅笔划一条直线，在此直线上做2个记号，用毛细玻璃将水解液点在上述点上，将滤纸挂在层析缸中，待扩展剂上升到距上边缘2-3cm处时取出滤纸，用铅笔描出扩展剂的前沿界线，自然干燥，用喷雾器均匀喷上0.1茚三酮乙醇溶液，然后置烘箱中烘烤5min即可显出各层析斑点。2.4 实验过程与数据处理2.4.1 硫酸水解毛发1) 3.5 molL-1的硫酸水解毛发10g毛发装入100mL三角瓶中加3.5 molL-1的硫酸35mL，装上球形冷凝管,甘油浴加热回流，反应温度110到115，等毛发全部溶解后开始计时，同时加入不同的金属离子。最后得棕黑色溶液，甲醛法定氮，加入4mL的甲醛。先确定反应时间。实验取1h，3h，5h，7h，9h,作变量,然后加入0.5g金属离子，取反应时间，及生成的氨基酸含量作对比实验。每个变量取2mL水解液作为定氮对象。酸水解毛发的结果列于表1，相对应氨基酸的量列于表2。表1 3.5 molL-1酸水解毛发结果表 反应时间NaOH种类 用量/mL 13579无金属离子11.6013.1021.1522.8022.85MnCl24H2O17.4819.6521.9222.9223.06Fe(NH4)2(SO4)26H2O16.1819.9321.1524.0024.90CoCl26H2O13.3014.1517.4020.7423.35MgSO414.2015.5517.3020.2821.70Ni(NO3)26H2O13.7618.9120.4321.8023.84CuSO45H2O9.9513.9014.2015.6017.40ZnSO47H2O17.4318.0819.5221.3022.78表2 对应氨基酸的量种类对应的氨基酸的含量/无金属离子27.5331.0950.1954.1154.23MnCl24H2O41.4846.6352.0254.3954.72Fe(NH4)2(SO4)26H2O38.4047.3050.1956.9659.09CoCl26H2O31.5633.5841.2949.2255.41MgSO433.7036.9041.0648.1351.50Ni(NO3)26H2O32.6544.8848.4851.7356.58CuSO45H2O23.6232.9933.7037.0241.29ZnSO47H2O41.3642.9146.3255.5054.06 刚开始做实验时，我们取反应时间为12h，但反应到11h时的数据变小，因此取反应时间为9h，作为反应的终点，根据资料显示的结果最终的反应时间为12h。2) 2.0 molL-1硫酸水解毛发10g毛发装入100mL三角瓶中加2.0 molL-1的硫酸35mL，加入7.2mL30的双氧水，装上球形冷凝管,甘油浴加热回流，反应温度110到115，等毛发全部溶解后开始计时。最后得棕黑色溶液，甲醛法定氮，加入4mL的甲醛。先确定反应时间。实验取1h，3h，5h，7h，9h,作变量,然后加入0.005mol的金属离子，取反应时间，及生成的氨基酸含量作对比实验。每个变量取2mL水解液作为定氮对象。酸水解毛发结果列于表3，对应氨基酸的量列于表4。表3 2.0 molL-1酸水解毛发结果表反应时间/hNaOH种类 用量/mL13579无金属离子10.2512.3016.6717.5019.27Fe(NH4)2(SO4)26H2O12.5716.6418.4021.0022.55CoCl26H2O11.2513.8216.6617.1120.61Ni(NO3)26H2O14.2516.3317.8921.4922.66表4 对应氨基酸的量种类对应的氨基酸的含量/无金属离子29.3335.1947.7050.0755.14Fe(NH4)2(SO4)26H2O35.9747.6152.6560.0964.52CoCl26H2O32.1939.5447.6748.9658.97Ni(NO3)26H2O40.7746.7351.1961.4964.87改变酸的浓度时，先把全部七种金属离子（Mn2+、Fe2+、Co2+、Mg2+、Ni2+、Cu2+、Zn2+）各自做了一次水解实验，然后选取了比较好的三种离子(Fe2+、Co2+、Ni2+、)来做进一步的实验，看低浓度酸的情况下金属离子对蛋白质的水解作用如何。在比较表2与表4右侧第一列数据，得出在2.0 molL-1低酸度下，金属离子催化作用比4.0 molL-1高酸度下提高20左右。2.4.2 硫酸水解鸡毛1) 4.0 molL-1的硫酸水解鸡毛10g鸡毛装入100mL三角瓶中，加4.0 molL-1的硫酸35mL，装上球形冷凝管,甘油浴加热回流，反应温度110到115，等鸡毛全部溶解后开始计时。最后得酱色溶液，甲醛法定氮，加入4mL的甲醛。先确定反应时间。实验取1h，3h，5h，7h，9h,作变量,然后加入0.5g金属离子，取反应时间，及生成的氨基酸含量作对比实验。每个变量取2mL水解液作为定氮对象。酸水解鸡毛结果列于表5，对应氨基酸的量列于表6。表5 4.0 molL-1酸水解鸡毛结果表反应时间/hNaOH种类 用量/mL13579无金属离子13.1014.1320.6021.0622.60MnCl24H2O13.9016.5917.5020.7521.05Fe(NH4)2(SO4)26H2O15.0017.4220.2524.7425.84CoCl26H2O14.3517.3520.1521.5522.75MgSO412.5314.7815.5516.4018.47Ni(NO3)26H2O13.7417.3817.9319.2620.61CuSO45H2O13.7414.8417.4918.8720.85ZnSO47H2O14.7917.1018.3320.5322.20表6 对应氨基酸的量种类对应的氨基酸的含量/无金属离子31.0933.5348.8949.9853.63MnCl24H2O32.9939.3741.5349.2449.95Fe(NH4)2(SO4)26H2O35.6041.3448.0658.7161.32CoCl26H2O34.0541.1747.8251.1453.99MgSO429.7435.0636.9038.9243.83Ni(NO3)26H2O32.6141.2542.5545.7148.91CuSO45H2O32.6135.2241.5144.7849.48ZnSO47H2O35.1040.5843.5048.7252.68从上表可以看出反应进行到9h后氨基酸的增加量减少了很多，因此实验取9h作为反应的终点，根据文献最终的反应时间是9h。2) 2 molL-1硫酸水解鸡毛10g鸡毛装入100mL三角瓶中加2.0 molL-1的硫酸35mL，装上球形冷凝管,甘油浴加热回流，反应温度110到115，等鸡毛全部溶解后开始计时。最后得棕黑色溶液，甲醛法定氮，加入4mL的甲醛。先确定反应时间实验取1h，3h，5h，7h，9h,作变量,然后加入0.005 molL-1的金属离子，取反应时间，及生成的氨基酸含量作对比实验。每个变量取2mL水解液作为定氮对象。酸水解鸡毛结果列于表7，对应氨基酸的量列于表8。表7 2.0 molL-1酸水解鸡毛结果表反应时间/hNaOH种类 用量/mL13579无金属离子11.6012.9515.3417.6019.50Fe(NH4)2(SO4)26H2O14.6016.8819.5021.0022.80CoCl26H2O12.1013.6016.4017.7118.22MnCl24H2O11.7014.9417.5318.6020.71表8 对应氨基酸的量种类对应的氨基酸的含量/无金属离子27.5330.7336.4041.7746.28Fe(NH4)2(SO4)26H2O34.6540.0646.2849.8454.11CoCl26H2O28.7132.2738.9242.0343.24MnCl24H2O27.7735.4541.6044.1449.15同样，改变酸的浓度时，我们先把全部七种金属离子（Mn2+、Fe2+、Co2+、Mg2+、Ni2+、Cu2+、Zn2+）做了一次数据，然后选取了比较好的三种离子(Mn2+、Fe2+、Co2+、)来做进一步的实验，看低浓度酸的情况下金属离子对蛋白质的水解作用如何。在低酸度下，金属离子对鸡毛的水解作用较小，可提高水解效率在17左右。2.5 复合氨基酸螯合物的制取用上面反应所得的剩余水解液，以活性炭脱色，抽滤，后用碳酸钙中和硫酸至pH值为1-2，滤去硫酸钙，然后蒸去大部分滤液，重结晶得晶体，得到复合氨基酸的金属螯合物。选取几份比较纯净的螯合物来做了红外光谱分析，其红外谱图如下：此图为加有Mn2+的鸡毛的水解液所得复合氨基酸螯合物的红外光谱图。其晶体外形为灰色针状晶体。由此我们可以推出此复合氨基酸螯合物中含有的官能团为：3411.10 cm-1为N-H的伸缩振动2960.46 cm-1和2924.61 cm-1为 C-H反对称伸缩振动。2847.80 cm-1为C-H的对称伸缩振动。1685.35 cm-1和1618.78 cm-1为C=O对称伸缩振动。1460.03 cm-1为C-H弯曲振动。1142.53 cm-1为C-N伸缩振动。676.53 cm-1和671.41 cm-1为N-H的面外弯曲振动。但不能确定为哪种氨基酸，如想确定螯合物有哪种氨基酸，有待做元素分析、Xray衍射和质谱进一步印证。因时间关系，我们未能做以上几种分析，又留下一个遗憾。此图为加有Fe2+离子的毛发的水解液所制得的复合氨基酸螯合物的红外光谱图。其晶体外形为白色针状。由此我们可以推出复合氨基酸螯合物中含有的官能团为：3482.79 cm-1和3487.91 cm-1为N-H的伸缩振动2960.46 cm-1和2914.37 cm-1为 C-H反对称伸缩振动2847.80 cm-1为C-H的对称伸缩振动1690.47 cm-1和1685.35 cm-1为C=O对称伸缩振动1142.53 cm-1为C-N伸缩振动666.29 cm-1为N-H的面外弯曲振动