水产品中氯霉素的测定.docx

XXX实验室检测中心管理体系文件作业指导书（第A版 第0次修改）文件编号：编写：审核：批准：批准日期：受控状态： 受控 非受控正副版本： 正本 副本持有者：发布日期： 实施日期：作业指导书文件编号：第1页 共4页标 题：水产品中氯霉素的测定第A版 第0次修改颁布日期：年月日1. 目的使氯霉素的测定处于受控状态，保证氯霉素检测结果的准确性与一致性；规范参加本项目检测工作人员的操作规程。2. 适用范围适用于水产品中氯霉素残留量的筛选检验。3. 引用标准动物源食品中氯霉素残留检测 酶联免疫吸附法农业部1025号公告-26-2008氯霉素酶联免疫检测试剂盒说明书 广州瑞森生物科技有限公司无公害食品 水发水产品 NY 5172-2002分析实验室用水规格和试验方法GB/T 6682-2008食品卫生检验方法 理化部分 总则 GB/T5009.1-20034. 概述氯霉素属广谱抗生素，曾在畜牧业中广为应用。但氯霉素有较强的副作用和毒性作用，如果氯霉素在食用动物中残留，可通过食物链传给人类，长期微量摄入氯霉素，不仅使人体肠道正常菌群失调，而且还会引起多种疾病，对人类的健康造成危害。世界上许多国家禁止此药用于生产食品动物，并规定了在畜产品中氯霉素不得检出。5. 测定5.1. 原理 氯霉素酶联免疫检测试剂盒，主要是利用抗原与抗体的特异性免疫化学反应的基本原理来进行的，换句话说，就是利用酶标记物与样品中的氯霉素与微孔中的抗体进行竞争反应。在整个反应当中，如果样品中的氯霉素残留的越多，相对地就会竞争反应越多的酶标记物，使得能结合上抗体的酶标记物相对地减少，用TMB底物显色，样品中的氯霉素含量与样品的吸光度值呈反比，与标准曲线比较即可得出氯霉素含量。5.2. 仪器5.2.1. 酶标仪(配备450nm滤光片)。5.2.2. 旋转蒸发仪。5.2.3. 匀浆器。5.2.4. 振荡器。5.2.5. 冷冻离心机。5.2.6. 微量移液器:单道20L、50L、100L、1000L；多道250L。5.2.7. 天平:感量0.01g。5.2.8. 氮气吹干装置。作业指导书文件编号：第2页 共4页标 题：水产品中氯霉素的测定第A版 第0次修改颁布日期：年月日5.3. 试剂和材料 以下所有试剂，均为分析纯试剂；水为符合GB/T 6682规定的二级水。5.3.1. 乙酸乙酯。5.3.2. 乙腈。5.3.3. 正己烷。5.3.4. 0.5N盐酸溶液5.3.5. 0.5N氢氧化钠溶液5.3.6. 氯霉素酶联免疫试剂盒:28冰箱中保存。5.4. 样本处理a) 将3克已均质的样品放入15mL离心管中，再加入6mL乙酸乙酯，震荡5分钟。b) 用离心机离心1700g10分钟，取2mL上层液(乙酸乙酯)至10mL玻璃管中，于50下，利用氮气将有机溶剂吹干。c) 在此玻璃管中加入正己烷1mL，先将残余物完全溶解后，再加入1mL样品稀释液，震荡30秒钟。d) 用离心机离心1700g 10分钟，利用吸管吸去包含中问乳化层部分的上层液(正己烷)，再吸取下层液(水层)备用。稀释倍数:1若待测物为白虾可按以下流程将样品做8倍浓缩以增加检品敏感度a) 将6克已均质的样品放入15mL离心管中，再加入6mL乙酸乙酯，震荡5分钟。b) 用离心机离心1700g 10分钟，取4mL上层液(乙酸乙酯)至10mL玻璃管中，于50下，利用氮气将有机溶剂吹干。c) 在此玻璃管中加入正己烷2mL，先将残余物完全溶解后，再加入0.5mL样品稀释液，震荡30秒钟。d) 用离心机离心1700g 10分钟，利用吸管吸去包含中问乳化层部分的上层液(正己烷)，再吸取下层液(水层)备用。稀释倍数:0.1255.5. 酶联免疫测定5.5.1. 将标准品对应微孔按序编号后分别分别加入100L氯霉素标准溶液。5.5.2. 在其他的微孔加入100L已完成前处理的样品溶液。5.5.3. 再于每一微孔另加入50L已完全回温的酶标记物。5.5.4. 轻敲酶标板四周，使其充分混合后于室温下避光静置1小时。5.5.5. 将微孔中的反应液甩掉，再将已稀释清洗液加满每一微孔后甩掉，重复3次。5.5.6. 最后一次甩掉清洗液后，在吸水纸上拍干。5.5.7. 于每一微孔加入显色液100L后，轻敲酶标板四周，使其充分混合。5.5.8. 于室温下避光静置20分钟。5.5.9. 加入反应终止液，每一微孔加入100L。5.5.10. 酶标仪以单波长450nm或双波长450nm/650nm读值。作业指导书文件编号：第3页 共4页标 题：水产品中氯霉素的测定第A版 第0次修改颁布日期：年月日5.6. 结果判定5.6.1. 定性判定 用样品的平均吸光度值与标准值比较即可得出样本所含氯霉素浓度范围(ng/ml)。假设样品1的吸光度值为0.313，样品2的吸光度值为1.032，标准液吸光度值分别是:0ppb为1.892；0.025ppb为1.501；0.05ppb为1.175；0.1ppb为0.751；0.3ppb为0.421；0.6ppb为0.198。则样品1的浓度范围0.3ppb-0.6ppb;样品2的浓度范围0.05ppb-0.lppb。(再乘以相应的稀释倍数)5.6.2. 定量判定所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值(B)除以第一个标准(0标准)的吸光度值(BO)再乘以100%，即百分吸光度值。百分吸光度值%=BB0100%B标准溶液或样本溶液的平均吸光度值。BO0ng/ml标准溶液的平均吸光度值。以标准品百分吸光率为纵坐标，以氯霉素标准品浓度(ng/ml)的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中氯霉素的实际浓度。若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样品的准确、快速分析。6. 检测方法灵敏度、准确度、精密度6.1. 灵敏度 本方法在鱼、虾、蟹样品中氯霉素的检出限为0.025ppb。6.2. 准确度本方法的回收率为70130。6.3. 精密度 本方法样本的变异系数小于10。7. 相关文件氯霉素酶联免疫检测试剂盒说明书（广州瑞森生物科技有限公司）酶标仪操作规程旋转蒸发仪操作规程匀浆器操作规程振荡器操作规程冷冻离心机操作规程氮吹仪操作规程天平称量操作规程。作业指导书文件编号：第4页 共4页标 题：水产品中氯霉素的测定第A版 第0次修改颁布日期：年月日8. 注意事项1) 使用前请先将试剂盒回温至室温(置于室温60分钟以上)，各溶液皆摇匀后方可使用。2) 回温后，取出所需酶标板条，将剩余未测的ELISA孔条立即放回铝箔袋中，置于4保存。3) 10倍样品稀释液与10倍清洗液请用蒸馏水稀释10倍方可使用。(如1mL浓缩稀释液加9mL蒸馏水)稀释后的1萃取稀释液和1清洗液可于4保存一周。4) 萃取流程请使用P.P.材质的15mL离心管以免腐蚀。5) 反应终止液含0.5 N HCl，请小心操作。6) 氯霉素标准溶液含氯霉索，请小