（微生物学专业论文）美达霉素产生菌菌种鉴定及调控基因medorf10的功能研究.pdf

硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 中文摘要 菌株a m 7 1 6 1 ( a m 7 1 6 1 ) 能够产生具有强抗肿瘤活性的抗生素美达霉素 ( m e d e r m y c i n ) ，作为一株重要的抗生素产生菌，迄今为止并未进行系统的分类鉴 定，文献中仅根据形态认为是链霉菌( s t r e p t o m y c e ss p a m 7 1 6 1 ) ；m e d - o r f i o 是 美达霉素生物合成途径中的一个重要基因，通过前期工作初步认为是一新型转录调 控基因。本研究首先对链霉菌a m 7 1 6 1 进行分类鉴定，并利用生物信息学分析、基 因互补和基因突变手段对m e d - o r f l o 展开功能研究，内容如下： 在不同条件下培养a m 7 1 6 1 并观察其培养形态、生长情况及产素情况，以及进 行扫描电镜观察、革兰氏染色等，表明：a m 7 1 6 1 为典型链霉菌形态，但较一般链 霉菌生长迅速；克隆其1 6 sr r n a 进行同源性分析及系统进化树分析表明：a m 7 1 6 1 与纳士维尔链霉菌x s d 0 8 1 4 7 ( s t r e p t o m y c e sn a s h v i l l e n s i ss t r a i nx s d 0 8 1 4 7 ) 序列同源性 高达9 9 ，确定其为纳士维尔链霉菌的一个亚种； 对m e a - o r f l 0 的一级、二级及三级结构进行生物信息学分析，结果显示： m e d o r f l 0 为一个非常小的疏水蛋白分子，具有一个s h 3 ( s r eh o m o l o g3 ) 基序和 一个酪蛋白激酶2 ( c k 2 ) 基序；仅含一个m 【 f 2 ( n u c l e a rt r a n s p o r t o rf a c t o r2 ，核运 输因子2 ) 结构域：其同源基因在芳香聚酮抗生素基因簇中广泛存在，推测是抗生 素合成必须基因；与放线紫红素生物合成基因簇中的a c t v b o r f a ( 编码新型正调控 蛋白) 同源性最近，推测二者功能一致： 对m e d - - o r f l o 的功能进行体内遗传学分析：表明m e d - - o r f l 0 突变导致美达 霉素的积累量和孢子产量下降：互补后发现美达霉素的积累和孢子产量均有一定程 度的恢复，推测m e d - o r f l o 是美达霉素合成中的调控基因，同时有可能会影响到菌 株的分化； 以上研究结果初步确定了美达霉素产生菌链霉菌a m - - 7 1 6 1 的分类地位，并且 为美达霉素生物合成调控基因的研究奠定了良好基础。 关键词：链霉菌a m 7 1 6 1 ；美达霉素；分类鉴定；调控基因；生物信息学分析； 基因回补 a b s t r a c t t h es t r a i na m - 7 1 6 1 ( a m 7 1 6 1 ) p r o d u c e sa na n t i b i o t i cm e d e r m y c i ns h o w i n gs t r o n g a n t i c a n c e ra c t i v i t y h o w e v e r , a sap r o d u c e ro fa ni m p o r t a n ta n t i b i o t i c ，t h i ss t r a i nh a sn o t b e e nc l a s s i f i e ds y s t e m a t i c a l l ys of a ra n dw a st e m p o r a l l yr e f e r e n c e da ss t r e p t o m y c e ss p a m 一7 1 6 1 m 弘o r f l 0g e n el o c a t e di nt h em e d e r m y c i nb i o s y n t h e t i cc l u s t e rw a s p r o p o s e dt ob ean o v e lt r a n s c r i p t i o n a lr e g u l a t o r yg e n e i nt h ep r e s e n ts t u d y , t h es t r a i n a m 7161w a sf i r s t l yi d e n t i f i e db yc l a s s i c a lc l a s s i f i c a t i o na n d16 sr r n a - s e q u e n c e a n a l y s i s ；a n dt h e nf u n c t i o n a la n a l y s i so fm e d - o r f 10w a sc o n d u c t e db yb i o i n f o r m a t i c s ， g e n ec o m p l e m e n t a t i o na n dg e n ek n o c k - o u t t h em a i nr e s u l t sa r cs u m m a r i z e da sf o l l o w s ： t h es t r a i na m 7 1 6 1s h o w e dat y p i c a lm o r p h o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c so f s t r e p t o m y c e t e sb yg r a m s t a i n i n ga n ds e m o b s e r v a t i o na sw e l la sg r o w t hc u r v eo n d i f f e r e n tc u l t u r a lc o n d i t i o n s ，b u tg r e wm u c hf a s t e rt h a nt h ec o n l i n o ns t r e p t o m y c e t e s p h y l o g e n e t i ct r e ea n a l y s i so fa m 7 161o nt h eb a s i so f16 sr i 姒s e q u e n c ei n d i c a t e d t h a tt h es t r e p t o m y c e ss p 。a m 7 1 6 1a n ds t r e p t o m y c e sn a s h v i l l e n s i ss t r a i nx s d 0 8 1 4 7s h a r e 9 9 h o m o l o g ya tt h en u c l e o t i d es e q u e n c e ，t h e r e f o r e ，w es u g g e s tt h a tt h e 砧沮7 1 6 1w i l l b ec l a s s i f i e di n t oas u b s p e c i e so fs t r e p t o m y c e sn a s h v i l l e n s i s b i o i n f o r m a t i c s a n a l y s i s f o rt h ep r i m a r y , s e c o n d a r ya n dt e r t i a r ys t r u c t u r eo f m c d o r f l 0s h o w st h a tm 靠o r f l 0i sas m a l la n dh y d r o p h o b i cp r o t e i nc o n t a i n i n gt h r e e 骆h e l i c e s ，f o u rf l - s h e e t sa n das h 3 ( s r ch o m o l o g3 ) m o t i f a sw e l la sac a s e i nk i n a s e2 m o t i f o n l yo n ec o n s e r v e d 舰d o m a i n ( n u c l e a rt r a n s p o r t e rf a c t o r2 ) w a sf o u n di n m e d o r f l 0 h o m o l o g o u sg e n e so fm e d - o r f l 0a l ef o u n d t oe x i s tw i d e l yi n t h e b i o s y n t h e t i cg e n ec l u s t e r so fm a n ya r o m a t i cp o l y k e t i d ea n t i b i o t i c s ，i m p l y i n gt h a ti ti sa n e s s e n t i a lg e n ef o rb i o s y n t h e s i so ft h e s em e t a b o l i t e s m 弘o r f l os h a r e st h eh i g h e s t h o m o l o g yw i t ht h ea c t v i o r f ag e n ew h i c hi s an o v e la n dp o s i t i v et r a n s c r i p t i o n a l r e g u l a t o r yg e n ei nt h eb i o s y n t h e s i so fa c t i n o r h o d i n t h e r e f o r e ，m e d - o r f l 0i sc o n s i d e r e d t oh a v et h es i m i l a rf u n c t i o nt oa c f v i - o r e a m o l e c u l a rg e n e t i ca n a l y s i so fm e d o r f l 0i nv i v os h o w e dt h a t ：b e t ht h er e d u c e d p r o d u c t i o no fs p o r e sa n da c c u m u l a t i o no fm e d e r m y c i nw o r eo b s e r v e db y t h ek n o c k - o u t o fm 弘o i 强1 0a n di t sf u n c t i o nw a sr e s t o r e db yc o m p l e m e n t a t i o nw i t hm e d - o r f l 0 ， i n d i c a t i n gt h a tm e d - o r f loi sap o s i t i v er e g u l a t o r yg e n ei nt h ep a t h w a yo fm e d e r m y c i n b i o s y n t h e s i s a n dm i g h th a v ea ni m p a c to nt h ed i f f e r e n t i a t i o no fs t r e p t o m y c e ss p a m 7 1 6 1 t h ep r e s e n ts t u d yp r o v i d e su sw i t hu s e f u li n f o r m a t i o nf o rt h ef u r t h e rr e s e a r c ho ft h e b i o s y n t h e t i cp a t h w a yo fm e d e r m y c i n k e y w o r d s ：s t r e p t o m y c e ss p a m - 7 1 6 1 ；m e d e r m y c i n ；b a c t e r i a li d e n t i f i c a t i o n ； r e g u l a t o r yg e n e ；b i o i n f o r m a t i c sa n a l y s i s ；g o n ec o m p l e m e n t a t i o n ； 华中师范大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，独立进行研究工作 所取得的研究成果。除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或 集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在 文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人承担。 作者签名：i 彰移澎 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，o p - 学校有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借 阅。本人授权华中师范大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进 行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。同意华中 师范大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 作者签名：留移秀导师签名：彦爱袈 允许北京万方数据电子出版社出版的中国学位论文全文数据库将本人论文 以电子、网络、镜像及其他数字媒体形式公开出版。 作者签名彰积、覆 本人已经认真阅读“c a l i s 高校学位论文全文数据库发布章程 ，同意将本人的 学位论文提交“c a l i s 高校学位论文全文数据库 中全文发布，并可按“章程”中的 规定享受相关权益。回垂途塞堡变厦溢蜃i 旦坐生i 旦二生i 旦三生筮查! 储签名f 彰拍骰 日期：。一f d 年占b9 日 导师签名：彦器乐 呐易，年舌月夕日 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 1 1 链霉菌和抗生素 第一章前言 1 1 1 链霉菌 链霉菌是革兰氏阳性细菌，广泛分布于土壤及腐烂植物中，闻起来有泥土味道， 系统生物学上属于原核生物界放线菌目链霉菌科链霉菌属。链霉菌具有复杂的形态 分化和次级代谢过程，能产生很多种具有生物活性的次级代谢产物，被称为天然药 物的合成工厂。比如一些农用抗生素因具有较低毒性及残留性质，可以抑制病原微 生物的生长繁殖，改变病原菌的形态，从而在农作物生产方面可作为植物保护之用； 有些可以当成家畜饲料的添加物，最重要的是应用于医疗方面的_ 些抗生素。目前 已知的临床上应用的上万种抗生素，大约8 0 来源于放线菌( 而这些产生菌的7 5 是链霉菌) h o p w o o dd 八1 9 9 9 ，如链霉素、四环霉素、红霉素、保米霉素、维利 霉素等，因此在医学上有着极其重要的意义。 链霉菌具有复杂的形态分化周期，从孢子萌发，营养菌丝产生，气生菌丝产生 到孢子丝分裂成单孢子，每一个阶段都具有明显的形态特征【刘志恒等，2 0 0 4 ( 图1 1 ) 。首先，孢子萌发，菌丝延伸、分枝形成基质菌丝。基质菌丝多分枝，横 隔稀疏，很少断裂，深入到培养基内导致菌落不易挑起( 功能是吸收营养物质) 。 基质菌丝生长到一定阶段后，生长出培养基外伸向空间形成气生菌丝。气生茵丝较 粗，覆盖在菌及表面，使菌落呈绒毛状，功能是传递营养物质、繁殖，气生菌丝生 长到一定阶段，分化出可形成分生孢子的菌丝，叫孢子丝，是繁殖菌丝。孢子丝有 直形、柔曲、钩环状至松敞和紧密螺旋形的，孢子丝发育到一定阶段即分化成孢 子。孢子呈节状，由菌丝断裂而成。到后期，大部分基质菌丝被降解，为气生菌 丝的发育提供营养。3 5 天后，大量孢子布满菌落表面，使菌落呈现颗粒状或粉状， 不透明，有褶皱，菌落周围有放射状菌丝。菌落可以连续生长几个星期，边缘继续 延伸，基内菌丝又会长出气生菌丝，而且特定的细胞会产生种类众多的抗生素( 图 1 2 ) 。链霉菌复杂的生活周期与更高层次分化的多细胞生物相似，为多细胞生物发 育的研究提供了一个简单而又有效的模式系统。 、罐弋， 瓣一s 产生气生菌丝j j i 孵 图1 1 链霉菌的生活史模式图 f i g1 1l i f ec l k l eo f s t r e p t o m y c e t e s 链霉菌基因组染色体呈线状，是目前己知的最大的原核生物基因组，且结构复 杂，其中鸟嘌呤和胞嘧啶( g + c ) 百分含量非常高，可达6 9 7 6 ，是目前所有已 经研究过的生物中基因组( g + c ) 最高的一类生物【g o o d f e i l o wm 1 9 8 4 】。链霉 菌染色体i _ | 个约5m b 的核心区和约15m b 的左臂及23m b 的右臂组成。核心区 富含行使细胞功能的基因，保守性很强，而两臂的保守性较弱。 到目前为止，已经有如下几种链霉菌完成全基因组测序并公开发表：链霉菌模 式菌株一天蓝色链霉菌( s t r e p t o m y c e sc o e l i c o l o r a 3 ( ) 【b e n t l e ys d e ta l 2 0 0 2 】， 最有效杀虫剂阿维菌素产生菌除虫链霉菌( s t r e p t o m y c e sa v e r m i t i l i s ) 【i k e d ah e t a l ，2 0 0 3 】以及链霉素产生菌一灰色链霉菌( s t r e p t o m y c e s g r i s e u s ) o i m i s h iy _ e t a l ， 2 0 0 8 】。其中天蓝色链霉菌是链霉菌中第一个完成全基因组测序的种，作为链霉菌 基础生物学和分子生物学研究的模式菌株，遗传学基础已经相当完善：染色体d n a 全k 8 6 6 7 5 0 7b p ，含有7 8 2 5 个开放阅读框架( o r f s ) ，大小约为原核生物ec o l i 的 两倍【k i e s e r h m ，1 9 9 2 】，比真核酿酒酵母( sc e r e v i s a i e ) 的基因组( 约6 2 0 0 个o r f s ) 还大。链霉菌基因组上富含次生代谢相关基因簇，所以基因组学研究对发现新结构 的重要的活性物质提供一个重要的途径【b e n t l e ys de t a l ，2 0 0 2 】。 嚣 m a s t e r s t h e 。 i 百万 一s 隔 二一蔓 叠 图1 2 链霉菌苗落形态 f i g12 m o r p h o l o g y o f 鼬印o t 畸c e t e sc o l o n i e s t 口 1 i2 链霉菌源抗生素 1 9 4 2 年从链霉菌中发现了第一个抗生素链丝菌素。1 9 4 4 年又发现了链霉茼 素，自此人们丌始对从链霉菌中筛选抗生素展开进一步的研究。接下来的3 0 多年， 每年发现的由链霉菌产生的抗生素几乎呈现指数增长，在7 0 年代达到最高峰。 链霉菌产生的抗生素不仅种类繁多而且结构复杂，从结构e 大致可分为下列六 夫类：( 1 ) 氨基耱苷类抗生素：母核出糖或藉胺衍生，与其它分子结合形成糖或糖 胺衍生物，可干扰植物体内病原细胞蛋白质的合成，如链霉素。( 2 ) 大环内酯类抗 生素：1 2 个以上的碳原子构成的环状结构，与细菌5 0s 核糖体亚基结合，阻断蛋 白质合成，如红霉素等。( 3 ) 核酸类抗生素：含有核酸类似物的衍生物，通过作用 于病原菌的脱氧核糖核酸合成系统，进而抑制其前体物的合成，如多氧霉素。( 4 ) 四环霉素类抗生素：由四个乙酸及丙二酸缩合环化形成，抑制病原菌核糖体蛋白， 如四环霉素等。( 5 ) 多烯类抗生素：由2 5 3 7 个碳原子组成的大环内酯类抗生素， 含有3 7 个相邻双键，通过与病原真菌细胞膜上的类固醇结合，进而破坏细胞膜， 如制霉菌素等。( 6 ) 多肚类抗生素：氨基酸通过不同肽键结合形成网状结构，在非 核糖体指导下的肽类合成酶作用下形成的短肚，可抑制病原菌细胞壁的合成，如纯 霉素【王以光1 9 9 7 】。 抗生素结构的多样性决定了其生物活性的多样性，具有抗细菌、抗真菌、抗肿 瘤、抗病毒或免疫抑制活性的抗生素已经广泛应用于临床，而一些从抗生素中发现 的酶制剂、药理活性物质、免疫调节物质、杀虫杀螨和除草剂、抗菌剂、植物生长 调节剂等也已广泛应用于农业和畜牧业【黄惠娟等2 0 0 7 1 。 据报道，自然界约有9 9 以上的微生物并没有被开发出来 d a v i e sj 1 9 9 9 ， 说明微生物作为生物活性物质来源还有很大开发潜力。但是，近些年来从自然界直 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i $ 接分离具有新结构、新活性的天然产物变得越来越困难，已知结构化合物的重复性 分离很高。同时，由于临床上大量抗生素的使用，病原微生物的抗药性日益严重。 所以，随着多抗药性、高抗药性病原菌的出现，随着艾滋病、s a r s 、禽流感以及 甲型h 1 n 1 流感等新型疾病不断出现，随着癌症成为人类生命健康最大杀手，如何 更好地利用已有资源，建立新型的筛选方法，定向创造新结构、新活性药物以及提 高微生物次级代谢产物的产量，成为当务之急。时下，硅胶板筛选技术和一些分子 生物学基础上的组合生物合成技术( c o m b i n a t o r i a lb i o s y n t h e s i s ) h o p w o o dd 八 1 9 9 7 、组合生物催化技术( c o m b i n a t o r i a lb i o c a t a l y s i s ) m i c h e l sp c e ta 1 1 9 9 8 以 及代谢工程( m e t a b o l i ce n g i n e e r i n g ) b a i l e y 厄e t a l ，1 9 9 0 在药物发现中逐渐占据 主导地位，成为解决上述问题的主要技术手段。 1 2 抗生素生物合成与调控 1 2 1 概述 链霉菌中与次生代谢途径相关的基因通常以基因簇( c l u s t e r ) 的形式存在于染 色体上( 基因簇内部基因分别负责次生代谢产物的合成、调控、分泌、抗性等) ， 这样的基因簇数量之多都是以前未曾料想到的。比如天蓝色链霉菌基因组中有2 3 个 基因簇参与形成次生代谢产物合成，约占基因组总量的5 ，而除虫链霉菌中则有3 0 个次生代谢产物合成基因簇，占全基因组的6 6 。链霉菌次生代谢复杂，分化复杂， 表明基因调控的复杂性，其基因组中同样富含编码调控蛋白的基因，如天蓝色链霉 菌中参与蛋白调控的基因有9 6 5 个，占整个基因组的1 2 3 h u t c h i n g sm i e ta 1 2 0 0 4 。链霉菌这种复杂的基因组结构与其生存的土壤环境相适应：土壤中存在各 种胁迫压力，包括化学、物理和生物的，链霉菌一方面通过产生抗生素抑杀“异己”， 另一方面，基因组富含的编码调控、转录蛋白的基因可以感应各种环境信号和生理 信息并作出反应，行使各种复杂功能，只有这样才能在具有高度竞争的土壤环境中 得以良好的生存。实验证实链霉菌中次级代谢常发生在营养生长和孢子分化的过度 时期，这充分表明链霉菌次级代谢产物的合成与其复杂的形态分化密切相关【雷健 等，2 0 0 7 。 链霉菌基因组特别是次生代谢基因簇信息的阐明，有利于通过基因工程手段修 。 饰改造代谢途径，得到理想的天然产物并提高其产量。功能基因组研究则可以进一 - 步了解次级代谢调控网络，提高改造菌株的可行性，有利于优化产生菌和新型药物 的研究。 4 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 1 2 2 抗生素生物合成 抗生素生物合成途径的阐明是利用代谢工程进行药物结构和活性改良的基础。 目前生物合成研究主要集中在两类抗生素：一类是聚酮抗生素，一类是肽类抗生素。 聚酮抗生素的聚酮母核是由聚酮合成酶( p o l y k e t i d es y n t h a s e ，p k s ) 来负责催化 形成的。从聚酮合成酶的结构特征和催化机理来看，可将其分为三种类型：i 型、 i i 型和i 型【s h e nb 2 0 0 3 ；孙宇辉等，2 0 0 6 1 。 i 型p k s 是研究报道最多最透彻的，基因簇较长，由几个多功能的多肽组成， 包含多个结构域，每个结构域功能各异，数个相关结构域形成一个模块，负责2 c 单位缩合，还原，释放等过程，产物多为大环内酯类。模块底物的特异性决定了i 型p k s 对起始单位和延长单位的选择，而p k s 每个模块上不同的还原结构域使聚 酮产物得到不同程度的还原。聚酮骨架组成单位的多样性和每个碳单位的不同还原 程度决定了复合聚酮化合物结构的多样性，这暗示着聚酮抗生素的结构具有相当大 的可塑性，因此可以通过模块内或模块间的重组，设计出新的基因( 簇) 组成结构 或生物合成途径，这是i 型p k s 作为组合生物学主要研究对象的重要原因之一【汪 星明等，2 0 0 3 ；赵文英等，2 0 0 6 】。 i i 型p k s 是一个多酶复合体，含有一套可重复使用的结构域，由m a l p a r t i d af 于1 9 8 4 年首次报道 m a l p a r t i d af e ta 1 ，1 9 8 4 。研究最为深入的是放线紫红素，美 达霉素也属此类型。i i 型p k s 的起始单位为乙酰c o a ，和i 型p k s 相比，i i 型p k s 在起始单位和延长单位的选择变化性不大，其结构多样性主要来自于聚酮合成后的 不同修饰步骤，产物多为带芳香环的聚酮类。由于其整体基因簇短小，操作方便， 而且负责前期母体聚酮链合成的基因也非常简单，同时负责后期结构修饰( t a i l o r i n g m o d i f i c a t i o n ) 的基因具有功能多样性( 决定生物活性和化学结构的多样性) ，所以近 年来在基因工程药物开发方面成了重要的研究对象 r i xu e ta 1 ，2 0 0 2 1 。 型p k s 是f u n a 等于1 9 9 9 年发现的 f u n an e ta 1 ，1 9 9 9 ，与另外两种p k s 不同，型p k s 并不依赖于作为酰基载体的a c p 及其上的4 磷酸泛酰巯基乙胺， 而是直接作用于酰基c o a 活化的简单羧酸。 三种p k s 尽管在结构和作用机制上有所不同，但却都是通过酰基c o a 的脱羧缩 合和酮基合成酶结构域( 或亚基) 催化形成c c 键。近年来越来越多的报道表明这 三种类型的p k s 并不能完全囊括不断涌现出的新的聚酮合酶，更多更精彩的内容正 等待着我们去揭示【白林泉等，2 0 0 6 。 肽类抗生素的结构一般是由几个氨基酸通过肽键连接组成，肽键的形成由非核 糖体指导肽类合成酶( n o n r i b o s o n m lp e p t i d es y n t h c t a s e s ，n r p s ) 催化而成。n r p s 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 酶系是一类多功能蛋白质复合体，能识别、激活、转运氨基酸底物并按特定顺序合 成多肽，也是呈模块化结构，它同时具有酶和模板的功能，因此又被称为蛋白质模 板，具有氨基酸激活功能域( a ) 、氨酰载体功能域( t ) 和缩合功能域( c ) 。其作 用过程如下：1 、氨基酸的载入和活化：2 、酰氨键的形成，肽链的转位，转移到延 伸单位的t 上；4 、循环往前延伸；5 、硫酯键水解引起产物释放；6 、通过以上过程 合成的产物通常还要经过复杂的修饰反应。 1 2 3 抗生素合成调控方式 链霉菌中抗生素的生物合成受到许多基因的调控，形成一个复杂的网络系统， 由“多效性的全局调控因子”控制抗生素合成途径中的“途径专一性调控基因的 表达，后者直接决定抗生素的产生水平。除此之外，还有一些其他调控因子参与的 方式未知的调控等等。 1 2 3 1 全局性调控( g l o b a lr e g u l a t i o n ) b l d a 是天蓝色链霉菌中位于染色体上的一个多效调控因子，编码有效阅读稀有 亮氨酸密码子u u a 的t r n a ，在翻译水平上调控着为数众多的含有稀有密码子t t a 的基因的表达 f e r n a n d e zm e ta 1 ，1 9 9 4 。在链霉菌中，许多抗生素抗性基因和调 控基因及一些参与形态分化和生理分化的基因当中都含有t t a 密码子，而已知的参 与基础代谢的基因都不含t t a 密码子。天蓝色链霉菌的b l d a 缺失菌株营养生长正 常，但不能形成气生菌丝或分生孢子，在琼脂平皿上形成“光秃型”菌落，次生代谢 被阻断，不能合成四种抗生素。这个调控基因在多种链霉菌中都有发现。 a 因子( a f a c t o r ) ：2 辛酰3 r - 羟甲基丁内酯，是在灰色链霉菌形态分化和次 级代谢中具有调节作用的自主调节因子( a u t o r e g u l a t o r yf a c t o r ) 。它可以诱导气生菌 丝的形成，同时调控链霉素的生物合成。目前在链霉菌的许多种中也发现了一系列 的a 因子类似物的存在，它们的共同特点是都具有一个t 丁酸内酯结构。其作用机 制 h o r i n o u c h is 1 9 9 7 如下：在灰色链霉菌生长初期，a 因子浓度很低，a - 因子 的特异受体a r p a 便与调控次级代谢和形态分化的基因a d p a 的启动子区域结合 m i y a k ek e ta 1 ，1 9 8 9 ，从而抑制了该基因的转录。随着链霉菌的生长，a - 因子 不断积累，浓度升高。当a 因子浓度达到某一阀值时，a 因子与a r p a 结合，使其 构型发生变化，从基因a d p a 的启动子区域解离下来，基因a d p a 得以转录，其产 物a d p a 结合在s t r r 启动子上游 r e t z l a f f l e ta 1 ，1 9 9 5 】，激活其转录，表达产物 s t r r 可以和该基因簇中多个位点结合，从而激活下游基因转录 v u j a k l i j ad e t a 1 ，1 9 9 3 】，导致灰色链霉菌开始形态分化和次级代谢【贾素娟等，2 0 0 4 1 。 双因子调控系统是通过两个蛋白组分将外界信号从体外传递到细胞内，从而控 6 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 制细胞生理代谢过程，在链霉菌次生代谢中起到全局调控的功能。相对于链霉菌次 生代谢中其他的调控模式而言，双因子调控是一种更为精细的信号调控模式，且存 在调控机制的多样性、复杂性和分布的普遍性。根据氨基酸序列、立体结构以及作 用模式的不同，链霉菌中的双因子调控系统可分为两种类型：原核型双因子调控系 统和真核型双因子调控系统。在链霉菌中，已有研究的双因子调控系统多为原核型 双因子调控系统，分别以正效或负效方式参与次生代谢的调控： i 原核型双因子调控系统，也称为组氨酸天冬氨酸磷酸化蛋白调控系统，其中 感应因子( 组氨酸激酶) 的保守的组氨酸残基是自体磷酸化的位点( 且是效应蛋白的 磷酸供体) ，而效应因子保守性相对较差，但一般至少有2 个天冬氨酸残基和1 个赖 氨酸残基作为磷酸受体，因此，通过两步蛋白磷酸化反应来传递外界信号，完成对 靶基因的表达调控。组氨酸激酶中的a t p a s e 结构域和效应因子中的c h e y ( 磷酸化 位点) 结构域都非常保守 h u t c h i n g s m i e t a l 。2 0 0 4 1 。目前这类系统中报道较多的 有c u t r c u t s 、a b s a 2 a b s a l 、a f s q l a f s q 2 以及p h o p p h o r 等【宫彩霞等，2 0 1 0 。 真核型双因子调控系统，即丝氨酸苏氨酸酪氨酸磷酸化蛋白调控系统，在 环境信号刺激下，其中两个蛋白组分中保守的丝氨酸苏氨酸和酪氨酸残基会发生可 逆的磷酸化或去磷酸化的一系列级联反应，来完成信号传递。这类信号传递中磷酸 化反应存在可逆性，所以可以随时打开或关闭，对环境信号的感应和调节更加灵活 【张艳娟等，2 0 0 4 】。这些含丝氨酸苏氨酸和酪氨酸的蛋白组分中都存在一个较为保 守的核心催化功能结构域，由2 5 0 3 0 0 个氨基酸组成，并可进一步分成1 2 个亚功能 结构域【杨旭等，2 0 0 8 】。在这类双因子调控系统中，除天蓝色链霉菌的a f s 眦k 研究较为深入外，只有几个仅限于体外功能分析( 如天蓝色链霉菌中的p k a b p k a a ， 以及仅一个组分得到鉴定的p k a g 以及新近发现的p k a d ) ，绝大部分系统还未展开 深入研究。不同双因子调控系统之间也存在交叉对话( c r o s st a l k ) ，即不同双因子 调控系统之间存在相互联系和相互作用【宫彩霞等，2 0 1 0 1 。 1 2 3 2 途径特异性调控( p a t h w a y s p e c i f i cr e g u l a t i o n ) 途径特异性的调节因子主要参与特定代谢产物的生物合成过程，包括s a r p 家 族( s t r e p t o m y c e sa n t i b i o t i cr e g u l a t o r yp r o t e i n s ) 、l u x r 家族、l y s r 家族、t e 依家 族以及一些未知家族等。 第一类s a r p 家族的研究最为透彻，此家族的蛋白结构具有鲜明的特征，它们 的n 末端都有两个特征结构域o m p rd n a 结合结构域和细菌转录激活结构域 ( b a c t e r i a lt r a n s c r i p t i o n a la c t i v a t i o nd o m a i n ，b t a d ) 【t 觚a k aa e ta 1 。2 0 0 7 ，通过 该结构域与相应的d n a 序列结合从而激活抗生素生物合成基因的转录。天蓝色链 7 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 霉菌中放线紫红素、十一烷基灵菌红素、钙依赖抗生素和次甲霉素生物合成基因的 表达分别由特异转录激活蛋白a c tl i o r b 4 、r e d d 、m m y r 调控 a r i a sp e ta l ，1 9 9 9 t a k a n oe e ta 1 ，1 9 9 2 ，它们都是这个家族的成员。其他的s a r p s 家族成员还有 调控尼可霉素产生的s a n g 、头孢霉素c 和棒酸生物合成途径的c e a r 、灰色链霉菌 中链霉素合成的s t r r s t r s d i s t l e rj e ta 1 ，1 9 9 2 、以及弗氏链霉菌中( & f r a d i a e ) 调控泰乐菌素产生的t y l s 和t y l r 等。 第二类为l u x r 家族，这类调控蛋白n 端有a t p a d p 结合结构域、w a l k e r a b 基序，c 端有与l u x r 相似的d n a 结合结构域【赫卫清等，2 0 0 8 】。在群体感应系统 中作为受体蛋白，目前发现的此家族蛋白包括s t r e p t o m y c e sh y g r o s c o p i c u s ( 雷帕霉 素产生菌) 的r a p h k u s c e re e ta 1 ，2 0 0 7 】、s t r e p t o m y c e sc i n n a m o n e n s i s ( 莫能霉素 产生茵) 的m o n h 、s t r e p t o m y c e sv e n e z u e l a e ( 苦霉素产生菌) 的p i k d 、s t r e p t o m y c e s n a t a l e n s i s ( 匹马菌素产生菌) 的p i m r 以及s t r e p t o m y c e sn o u r s e i ( 制霉菌素产生菌) 的n y s r i 和n u s r i i 等。 第三类为l y s r 家族，在其c 和n - 端都含有l y s r 家族高度保守的d n a 结合 域，数量不是很多，作用机制不很了解 r o d r i g u e z m ，e t a l ，2 0 0 8 ；s o n gj y e t a l 2 0 0 9 ； o s t a s hi 鲥a 1 ，2 0 0 8 。 第四类为t e t r 家族，含有4 7 个氨基酸组成的t e t r 家族保守的d n a - 结合域， 多以同源二聚体形式与靶位点结合进行负调控 o ux e ta 1 ，2 0 0 9 ；i c h i n o s ek e ta 1 ， 2 0 0 3 】。 还有一些蛋白以未知方式参与次生代谢产物的生物合成，比如生二素链霉菌 ( s t r e p t o m y c e sa m b o f a c i e n s ) 中的s r m r 基因负责调控螺旋霉素的产生，但是s r m r 与其他调控蛋白并没有序列同源性。还有本文正在研究的美达霉素生物合成基因簇 中的新型调控基因m e d - o r f l o ( 未发表) ，以及放线紫红素( a c t i n o r h o d i n ，a c t ) 合 成途径中的调控基因a c t i - o r f a 可能代表一类新型的转录调控基因 t a g u c h it e ta 1 ， 2 0 0 7 1 。 其实，链霉菌抗生素的合成调控远比目前研究更复杂，比如以前认为有些途径 专一性调控基因功能不专一，可能会调控其它代谢物的合成 r o d r i g u e zm ，e ta 1 ， 2 0 0 8 ；o ux e ta 1 ，2 0 0 9 】；还有代谢产物会以自调控模式作用于基因簇中的调控基 因，参与自身合成的调控 w a n gl e ta 1 ，2 0 0 9 ；群感效应( q u o r u ms e n s i n g ) 也参与 这些代谢途径 v i c e n t ec m e ta 1 ，2 0 0 9 ，导致抗生素生物合成的调控网络系统更为 复杂，阐明这些系统的机制可以使我们更好地了解链霉菌次生代谢产物合成过程中 复杂的调控模式。 8 硕士学位论文 m a s t e r st h e s l s 随着基因组学和蛋白质组学等领域的新技术日趋成熟，可以对链霉菌基因组和 蛋白质组进行分析，定量分析调控基因的表达，链霉菌次级代谢调控机制的研究必 将取得突飞猛进的发展。 1 3 抗生素产生菌菌种鉴定 抗生素的巨大应用价值决定了对其产生菌进行菌种鉴定的必要性和迫切性，在 过去的四十多年里，微生物生态学发展迅猛，主要有传统的分类方法和现代分类方 法两类。 1 3 1 传统分类法 传统的微生物分类依据主要有：形态特征( 形状、大小、革兰氏染色反应和特 殊构造，比如链霉菌的分枝及孢子形态) 、培养特征( 菌落边缘、透明度、质地和 颜色等) 、生理生化特征( 营养要求、代谢产物、分泌物和细胞壁成分等) 和生态 特征( p h 、温度等) 等。随着生物学的迅猛发展，传统分类法的一些缺陷已经不能 满足微生物生态研究的需要，主要表现在以下几个方面【雷正瑜，2 0 0 6 1 - ( 1 ) 传统的微生物分类法主要为纯培养分离鉴定的方法，通过对菌株形态特 征、生理生化反应和细胞壁型等进行分类，这种方法不但实验周期长，工作量大， 关键是忽略了气候变化和生物间相互作用的影响，而人工培养环境与自然界存在很 大偏差，这就使得难以分离到样品中的所有微生物，大量具有科研和应用价值的 新基因无法被研究利用【r o n d o nm r e t 以，2 0 0 0 1 ；某些在自然环境中大量存在 的菌群在人工培养基上无法培养生长，这也给微生物分离鉴定工作带来很大不便： ( 2 ) 由于微生物形态较小，需要借助显微镜观察，而很多同属菌株在 形态特征和理化特性等方面往往大同小异，实验结果只能依赖人的主观判断，容易 得出错误结论。 鉴于传统分类鉴定法的局限性，目前1 6 sr r n a 序列分析技术已经广泛应用于 各种微生物的遗传特征和分子差异的研究工作中。 1 3 21 6 sr r n a 序列分析技术 原核生物含有三种类型的r r n a ，分别是5 sr r n a 、1 6 sr r n a 和2 3 sr r n a 。5 s r r n a 和2 3 sr r n a 含有的核苷酸分别太少或太多，只有1 6 sr r n a ，约1 5 4 0 b p ，长度 适中，信息量大且较易分析【周德庆，1 9 9 3 】。1 6 sr r n a 基因序列作为生物系统发 育指标依据如下：( 1 ) 原核生物均含有1 6 sr r n a ，功能同源，有“细菌石”之称； ( 2 ) 1 6 sr r n a 既有高度保守序列，又有高度变化的序列。保守性可以反映亲缘关 9 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 系，有利于构建系统发育树；高变区序列随细菌的不同发生变化，与进化距离相适 应【陈文新，1 9 9 8 ，能体现不同菌属的特征及其之间的差异；( 3 ) 1 6