（植物学专业论文）拟南芥氨基脱氧分支酸裂解酶的生物学功能研究.pdf

中文摘要 叶酸是指四氢叶酸及其衍生物这一类物质 是介导一碳单位转移的重要辅助因子 参 与生物体内许多重要反应 叶酸分子的化学结构由三部分组成 喋啶 对氨基苯甲酸 p a b a 和谷氨酸盐 植物中叶酸的合成过程涉及两个分支 p a b a 分支和喋啶分支 氨 基脱氧分支酸裂解酶 a d c l 在p a b a 分支中催化氨基脱氧分支酸 a d c 芳香化为p a b a 本论文是以突变体d t a d c l 为材料 分别用基因突变 r n a i 超表达和原核表达的方法来 探讨拟南芥中氨基脱氧分支酸裂解酶 a t a d c l 的生物学功能 主要研究结果如下 1 基因a t a d c l 在拟南芥生长的各个时期 各个组织中普遍表达 我们从a b r c 订 购了t d n a 插入突变体s a l k1 1 1 9 8 1 经p c r 鉴定得到了a t a d c l 的纯合突变体 命名 为a t a d c l 并分析了基因a t a d c l 的转录水平的表达情况 当采用跨t d n a 插入位点的基 因特异性引物时突变体a t a d c l 中该基因的转录本几乎检测不到 当采用不跨t d n a 插入 位点的基因特异性引物时突变体中的转录本丰度与野生型相比明显下降 突变体a t a d c l 在 营养生长和生殖生长阶段与野生型并无明显差异 统计了不同发育时期的莲座叶叶片数 目 发现突变体与野生型的莲座叶叶片数目没有差异 在黑暗诱导离体叶片凋亡的过程中 突变体与野生型的叶片凋亡速率无明显差异 生长在正常1 2m s 和氮限制培养基上的突变 体幼苗的状态均比野生型好 而且 r t p c r 分析显示参与氮代谢途径中的某些基因在突 变体中的转录本丰度比同样条件下的野生型中的高 通过微生物法检测 我们发现突变体 中的总叶酸含量是野生型的1 3 4 6 另外 h p l c m s m s 分析结果显示突变体中的四氢 叶酸含量是野生型的1 7 9 3 5 甲基 四氢叶酸含量是野生型的1 2 5 2 5 甲酰 四氢叶酸 含量是野生型的1 1 4 7 2 与野生型相比 基因a t a d c l 在5 个不同的r n a i 转基因株系中的转录水平均明显 降低 在4 个不同的超表达转基因株系中的转录水平均明显升高 3 采用微生物法检测了突变体 r n a i 和超表达转基因株系的总叶酸含量 我们发现 5 个不同的r n a i 转基因株系的总叶酸含量与野生型相比均提高 分别是野生型的1 4 6 9 1 7 2 2 1 3 6 0 1 2 6 1 和1 3 2 0 四个不同的超表达转基因株系的总叶酸含量与野生 型相比也均提高 分别是野生型的1 8 4 3 1 7 3 2 1 3 6 8 和1 4 4 7 4 将a t a d c l 的c d s 序列构建到载体p e t 3 0 a 上 在r o s s e t t e d e 3 感受态细胞中通 过i p t g 诱导进行重组蛋白的原核表达 然后通过s d s p a g e 分析 结果表明重组蛋白只 在沉淀中表达即以包涵体形式存在 为了检测a t a d c l 在拟南芥中是否具有酶学活性 就 i i i 必须得到可溶性的重组蛋白 我们将a t a d c l 的c d s 序列构建到融合了一段超酸序列的载 体p e t y d r b 上 并通过i p t g 诱导和s d s p a g e 分析 结果重组蛋白成功地在上清液中 表达 接下来 我们将收集大量的可溶性重组蛋白 测定a t a d c l 在植物体内的酶学活性 以上结果说明无论t d n a 插入还是r n a 干扰都不能阻断拟南芥中叶酸的合成途径 而且令我们惊奇的是 突变体和r n a 干扰转基因株系中的总叶酸含量与野生型相比均有 提高 可能的原因是 1 t d n a 插入和r n a 干扰并没有使基因的功能完全沉默 仍然保 留一定的酶学活性 2 因为叶酸对植物的生长发育起着关键的作用 而p a b a 又是叶酸 合成的一个前体 所以当基因a t a d c l a t 5 g 5 7 8 5 0 在植物中突变了 一定有其他基因在起 作用 从而保证p a b a 正常合成 或者甚至增加了p a b a 的合成量 关键词 拟南芥 叶酸 拟南芥氨基脱氧分支酸裂解酶 r n a 干扰 超表达 原核表达 i v a b s t r a c t t e t r a h y d r o f o l a t e t h f a n d i t s d e r i v a t i v e s c o m m o n l yg r o u p e d u n d e rt h en a m e o f f o l a t e s a r ev i t a lc o f a c t o r sf o re n z y m e st h a tm e d i a t eo n e c a r b o nt r a n s f e rr e a c t i o n s f o l a t e sa r e i n v o l v e di naw i d er a n g eo fk e ym e t a b o l i cf u n c t i o n s t h ec h e m i c a ls t r u c t u r eo ff o l a t ec o n s i s t so f t h r e ep a r t s p t e r i d i n e p a m i n o b e n z o i ca c i d p a b a a n dg l u t a m a t e t h e r ea r et w ob r a n c h e si nt h e p l a n tf o l a t eb i o s y n t h e s i sp a t h w a y p a b a a n dp t e r i d i n eb r a n c h r e s p e c t i v e l y t h ea m i n o d e o x y c h o r i s m a t el y a s e a d c l i si nt h ep a b ab r a n c hc a t a l y t i ca m i n oa c i do x y g e n a d c a r o m ai n t o p a b a i nt h i ss t u d y a na t a d c lm u t a n tw a su s e dt oi n v e s t i g a t et h eb i o l o g i c a lf u n c t i o no f a m i n o d e o x y c h o r i s m a t el y a s e 口t a d c l b yg e n em u t a t i o n r n ai n t e r f e r i n g o v e r e x p r e s s i o n a n dp r o k a r y o t i ce x p r e s s i o n a n dt h er e s u l t sa r eh i g h l i g h t e da sf o l l o w s 1 a t a d c lw a se x p r e s s e du b i q u i t o u s l yb o t hi nd i f f e r e n td e v e l o p m e n ts t a g e sa n di nv a r i o u s t i s s u e s w eo r d e r e dt h et d n ai n s e r t i o nm u t a n ts a l k 一1 1 19 8 1f i o ma b r c n a m e da t a d c l h o m o z y g o u sm u t a n ta t a d c lw a si d e n t i f i e db yp c i la n da n a l y z e df o rt r a n s c r i p t i o n a le x p r e s s i o n o fa t a d c l w h e nu s i n gt h eg e n es p e c i f i cp r i m e r st h a ts p a nt h et d n ai n s e r t i o ns i t et h e t r a n s c r i p t sc o u l dn o tb ed e t e c t e di nt h em u t a n t w h e nu s i n gt h eg e n es p e c i f i cp r i m e r st h a td o n t s p a nt h et d n a i n s e r t i o ns i t et h et r a n s c r i p ta b u n d a n c ed e g r e ed e c r e a s e ds i g n i f i c a n t l yc o m p a r e d w i t ht h ew i l dt y p e t h e r ew a sn e a r l yn od i f f e r e n c ei nv i s i b l ep h e n o t y p e sb e t w e e nw i l dt y p e p l a n t sa n da t a d c lm u t a n tp l a n t sd u r i n gv e g e t a b l ea n dr e p r o d u c t i v eg r o w t h w ec a l c u l a t e dt h e r o s e t t el e a fn u m b e ra td i f f e r e n td e v e l o p m e n t a ls t a g e s a n df o u n dt h a tt h en u m b e ro fr o s e t t e l e a v e so fm u t a n td i dn o td i f f e rs i g n i f i c a n t l yf r o mw i l dt y p e i nt h ep r o c e s so fd a r k i n d u c e d s e n e s c e n c e t h er a t e so fs e n e s c i n gl e a v e sw e r en os i g n i f i c a n t l yd i f f e r e n tb e t w e e nt h em u t a n ta n d w i l dt y p e w h e nt h em u t a n ts e e d l i n g sw e r eg r o wo nn o r m a l1 2m sa n dn i t r o g e nl i m i t a t i o n s m e d i u m t h em u t a n tg r e wb e t t e rt h a nw i l dt y p eo nb o t hm e d i u m s m o r e o v e r r t p c ra n a l y s i s d e t e c t e dah i g h e re x p r e s s i o no fs o m eo f t h eg e n e si n v o l v e di nn i t r o g e nm e t a b o l i s mi nt h em u t a n t u n d e rt h es a m eg r o w t hc o n d i t i o n s b yu s i n gt h em i c r o b i o l o g i c a lm e t h o d w ef o u n dt h a tt h et o t a l f o l a t ei nt h em u t a n tw a s1 3 4 6 1 o f w i l dt y p e i na d d i t i o n h p l c m s m sa n a l y s e sr e v e a l e dt h a t t h et e t r a h y d r o f o l a t ei nt h em u t a n tw a s17 9 2 6 o fw i l dt y p e t h e5 m e t h y l e n e t e t r a h y d r o f o l a t e w a s1 2 5 1 8 o f w i l dt y p e t h e5 f o r m y l m e t h e n y l t e t r a h y d r o f o l a t e tw a s11 4 6 8 o f w i l dt y p e 2 r e g a r d i n gt h ea t a d c lt r a n s c r i p tl e v e l i tw a sl a r g e l yr e d u c e di n f i v ei n d e p e n d e n t v a t a d c lr n a it r a n s g e n i cl i n e s a n dm a r k a b l yi n c r e a s e di nf o u r i n d e p e n d e n ta t a d c l o v e r e x p r e s s o r s a sc o m p a r e dt ot h ew i l dt y p e 3 u s i n gm i c r o b i o l o g i c a lm e t h o dt om e a s u r et h et o t a lf o l a t ec o n t e n to ft h em u t a n t r n a i a n do v e r e x p r e s s i o nt r a n s g e n i cl i n e s w ef o u n dt h a tt h et o t a lf o l a t ec o n t e n t so ft h ef i v er n a i t r a n s g e n i cl i n e sw e r ei n c r e a s e da sm u c ha s1 4 6 8 5 1 7 2 1 5 1 3 6 0 1 1 2 6 j1 2 a n d1 3 2 0 3 r e s p e c t i v e l y a sc o m p a r e dt ow i l dt y p e t h et o t a lf o l a t ec o n t e n to ft h ef o u ro v e r e x p r e s s i o nl i n e s w e r ei n c r e a s e da sm u c ha s18 4 2 7 1 7 3 2 9 1 3 6 7 6 a n d1 4 4 7 6 r e s p e c t i v e l y a sc o m p a r e d t ow i l dt y p e 4 t h ea t a d c lc d sw a sc l o n e di n t op e t 3 0 a a n dp r o k a r y o t i ce x p r e s s i o no ft h e r e c o m b i n a n tp o l y p e p t i d ew a sa c h i e v e db yi p t gi n d u c e di nr o s s e t t e d e 3 c e l l s f o l l o w e db y s d s p a g ea n a l y s i s t h er e s u i t ss h o w e dt h a tt h er e c o m b i n a n tp r o t e i nw 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e dr e c o m b i n a n tp r o t e i n t og e n e r a t ea t a d c l a n t i b o d yw h i c hw i l lb eu s e dt od e t e c tt h ee x p r e s s i o no f t h ea d c l i np l a n t t h er e s u l t sa b o v ei n d i c a t et h a tn e i t h e rt h et d n ai n s e r t i o nm u t a t i o nn o rr n a i n t e r f e r i n g b l o c kt h ef o l a t es y n t h e s i sp a t h w a yi na r a b i d o p s i s a n ds u r p s i n g l yw ef o u n dt h a tt h et o t a lf o l a t e c o n t e n t sb o t hi nm u t a n ta n di nr n a it r a n s g e n i cl i n e si n c r e a s e da sc o m p a r e dt ow i l dt y p e t h e s p e c u l a t i o n sa r e 1 t d n ai n s e r t i o na n dr n ai n t e r f e r i n gd i dn o ts i l e n c et h eg e n ef u c t i o n c o m p l e t e l yw h i c hs o m e w h a tr e t a i ne n z y m a t i ca c t i v i t y 2 w h e nt h eg e n ea t a d c l a t 5 g 5 7 8 5 0 m u t a t e di np l a n t s t h e r em u s tb eo t h e rg e n e sf u n c t i o n i n ga n db e i n gr e s p o n s i b l ef o rm a t a i n i n g p a b as y n t h e s i sn o r m a l l y o re v e ni n c r e a s i n gp a b as y n t h s i si nt u r n a sp a b ai sap r e c u r s o rf o r t h es y n t h s i so f f o l a t ew h i c hi se s s e n c i a lf o rp l a n tg r o w t ha n d d e v e l o p m e n t k e yw o r d a r a b i d o p s i st h a l i a n a f o l a t e a t a d c l r n ai n t e r f e r i n g o v e r e x p r e s s i o n p r o k a r y o t i c e x p r e s s i o n v i 缩略词表 缩写英文全称中文名称 a d c a d c l a d c s a m p a s n a s p a t c d n a d e p c d h f d h f s d h p s d h n d h n 丁p g d h g s g o g a t f p g s g f p g t p g t p c h i h p p k h m d h p h y g k a n a m s a m i n o d e o x y c h o r i s m a t e a m i n o d e o x y c h o r i s m a t el y a s e a m i n o d e o x y c h o r i s m a t es y n t h a s e a m p i c i l l i n a s p a r a g i n es y n t h e t a s e a s p a r t a t ea m i n o t r a n s f e r a s e c o m p l e m e n t a r yd n a d i e t h y l p y r o c a r b o n a t e d i h y d r o f ol a t e d i h y d r o f o l a t es y n t h e t a s e d i h y d r o p t e r o a t es y n t h a s c d i h y d r o n e o p t e r i n d i h y d r o n e o p t e r i nt r i p h o s p h a t e g l u t a m a t ed e h y d r o g e n a s e g l u t a m i n es y n t h e t a s e g l u t a m a t es y n t h a s e f o l y l p o l y g l u t a m a t es y n t h a s e g r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n g u a n o s i n et r i p h o s p h a t e g u a n o s i n et r i p h o s p h a t ec y c l o h y d r o l a s ei 6 h y d r o x y m e t h y l 一7 8 d i h y d r o p t e r i n p y r o p h o s p h o k i n a s e h y d r o x y m e t h y l d i h y d r o p t e r i n h y g r o m y c i n k a n a m y c i n m u r a s h i g ea n ds k o o g i 氨基脱氧分支酸 氨基脱氧分支酸裂解酶 氨基脱氧分支酸合成酶 氨苄青霉素 天冬酰胺合成酶 谷草氨基酸转移酶 互补d n a 焦碳酸二乙酯 二氢叶酸 二氢叶酸合成酶 二氢喋酸合成酶 二氢新喋呤 二氢新喋呤三磷酸 谷氨酸脱氢酶 谷氨酰胺合成酶 谷氨酸合酶 叶酰多谷氨酸合成酶 绿色荧光蛋白 三磷酸鸟苷 g t p 环化水解酶i 羟甲基二氢喋呤焦磷酸激酶 羟甲基二氢新喋呤 潮霉素 卡那霉素 m u r a s h i g e 和s k o o g 培养基 5 m t h f 5 f t h f m t x n i a l n l a 2 n t p n i r n t r p c r r i f r t p c r s h m t s p e t 耶 t s 5 m e t h y l t e t r a h y d r o f o l a t e 5 甲基 四氢叶酸 5 f o r m y l t e t r a h y d r o f o l a t e 5 一甲酰一四氢叶酸 m e t h o t r e x a t e氨甲喋呤 n i t r a t er e d u c t a s el 硝酸还原酶l n i t r a t er e d u c t a s e2硝酸还原酶2 n i t r a t et r a n s p o r t e ro l i g o p e p t i d et r a n s p o r t硝酸盐转运肽 n r r i t er e d u c t a s e亚硝酸还原酶 l o w a f f i n i t yn i t r a t eu p t a k e 硝酸盐运载体 p o l y m e r a s ec h a mr e a c t i o n 聚合酶链式反应 r i f a m p i c i n 利福平 r e v e r s e t r a n s c r i p t i o np o l y m e r a s e 反转录聚合酶链式反应 s e r i n e h y d r o x y m e t h y l t r a n s f e r a s e 丝氨酸羟基转移酶 s p e c t i n o m y c i n 壮观霉素 t e t r a h y d r o f ol a t e 四氢叶酸 t h y m i d y l a t es y n t h a s e 胸苷酸合成酶 原创性声明 本人郑重声明 本人所呈交的学位论文 是在导师的指导下独立进行 研究所取得的成果 学位论文中凡引用他人已经发表或未发表的成果 数 据 观点等 均已明确注明出处 除文中已经注明引用的内容外 不包含 任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果 对本文的研究成果做 出重要贡献的个人和集体 均已在文中以明确方式标明 本声明的法律责任由本人承担 论文作者签名 超盘宣日期 翌 笪 圣 关于学位论文使用授权的声明 本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品 知识产权归属兰 州大学 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植物体内叶酸的合成途径如图1 2 所利1 1 r h 域 o 图1 2 拟南芥中叶酸合成途径 1 1 l f i g 1 2s c h e m a t i cr e p r e s e n t a t i o no f f o l a t eb i o s y n t h e s i si na r a b i d o p s i s l l l l 1 1 1 1 喋啶分支 g t p 环化水解酶 g t p c h i 催化三磷酸鸟苷 g t p 生成三磷酸二氢新喋呤 d h n ppp 这是生物喋呤合成的第一步反应 编码该酶的基因已分别从大肠杆菌 酵 母和哺乳动物中得到克斛1 2 14 1 基因组证据显示 植物体内的g t p c h i 没有信号肽 所以 它可能定位于细胞质中 g t p c h i 除了可以参与四氢叶酸的合成 在哺乳动物细胞中还参 与喋啶的合成 1 5 植物中g t p c h i 的主要结构是很独特的 16 1 有活性的g t p c h i 是一个 二聚体 每个单体是由两个g t p c h i 结构域串联而成 g t p c h i 要具有催化活性 需要有 一套完整的氨基酸残基序列 所以只有这几个结构域串联结合在一起 才能组成一个完整 的有活性的催化位点 由于g t p c h i 催化喋啶分支的第一步反应 因此g t p c h i 被认为是 喋啶分支的限速酶 d h n ppp 的去磷酸化经历两步 第一步是去焦磷酸 这个反应主要是由一个特异的 焦磷酸酶介导的 1 7 去除剩余的一个磷酸的反应是由一个非特异的磷酸酶介导的 1 引 最后 2 兰州大学研究生学位论文 7 8 二氢新喋呤由d h n 醛缩酶 d h n a 催化合成磷酸6 羟基二氢喋呤 释放出二氢喋 啶 同细菌中相似 植物中的d h n a 也是一个同源八聚体 1 9 该酶在原核生物中大多数 都是单一功能蛋白 在链球菌中则是双功能蛋白 同时具有磷酸 6 羟基二氢喋呤合成酶的 活性 2 0 而在真菌中则是三功能蛋白 除具有上述两种酶活性外 还具有二氢喋呤合成酶 的活性 2 l 1 1 1 2p a b a 分支 同细菌一样 在植物中氨基脱氧分支酸合成酶 a d c s 催化分支酸转化成氨基脱氧分支 酸 a d c 细菌中的氨基脱氧分支酸合成酶是一个异源二聚体 而植物中的a d c s 是由 和细菌中的两个亚基同源的结构域串联形成的二分体融合蛋白 亚细胞定位实验表明其定 位于质体 9 1 2 2 1 在细菌中 a d c 合成p a b a 是由p a b c 催化的 在植物中 则是由氨基脱 氧分支酸裂解酶 a d c l 介导的 已经通过g f p 融合实验证实它也定位于质体中 2 3 1 植 物中的大部分p a b a 都是以其葡萄糖酯的形式存在的 2 4 1 酯化反应是由胞质中的葡萄糖转 移酶将p a b a 逆向转变成其葡萄糖酯的形态 p a b a 葡萄糖酯化是植物所特有的 但p a b a 葡萄糖酯的功能现在还不是很清楚 它可能是p a b a 的贮存形式 也可能是细胞内的运输 形式 2 4 1 1 1 3 线粒体中四氢叶酸的合成 植物中叶酸合成途径的最后五个反应都是在线粒体中完成的 2 5 2 7 首先 二氢喋啶被 活化成其焦磷酸化形式 接着与p a b a 相连接形成二氢喋酸 这两步反应是由一个双功能 酶催化的 该酶是由几个相同的5 3 k d a 的亚基组成的3 0 0 k d a 的蛋白分子 2 5 1 该双功能酶 其中的一个活性是羟甲基二氢喋呤焦磷酸化酶 h p p k 催化线粒体中叶酸合成的第一个 反应 另外一个活性是二氢喋酸合成酶 d h p s 催化喋啶与p a b a 相结合 h p p k 和 d h p s 在拟南芥和豌豆中已得到纯化 2 6 2 8 1 豌豆中的h p p k d h p s 是双功能蛋白 同时具 有h p p k 和d h p s 两个结构域 由于豌豆叶片只在线粒体内检测到了h p p k 和d h p s 活性 表明线粒体可能是h p p k 和d h p s 作用的主要或者唯一的场所 分子杂交结果显示 豌豆 中h p p k d h p s 基因序列只有一个拷贝 2 5 加1 第三步反应是二氢喋酸经二氢叶酸合成酶 d h f s 催化形成单谷氨酸二氢叶酸 d h f g l u l 在拟南芥中 经检测证明d h f s 只有一个拷贝 其分子和生化数据均显示 它只存在于线粒体中 这就使得线粒体成为植物细胞合成d h f 的唯一场所 2 7 2 9 第四步反应 二氢叶酸还原酶 d h f r 在n a d p h 作为电子供体的条件下 将单谷氨酸 二氢叶酸还原成单谷氨酸四氢叶酸 d h f g l u l 植物d h f r 同时还具有胸苷酸合成酶 t s 3 兰州大学研究生学位论文 的活性 因此 d h f r 具有双重功能 它既能在叶酸合成的过程中还原d h f 生成t h f 又能将t h f g l u n 氧化 在马铃薯块茎和豌豆叶片中只在线粒体内检测到了d h f r 活性 由此表明 d h f r 定位于线粒体内 2 5 编码d h f r i s 的基因已在拟南芥 3 0 胡萝i t 3 1 t 和 大豆 3 2 中得到克隆 研究表明d h f r 和t s 的编码区分别位于n 端和c 端 而且氨基酸 序列与已报道的其他真核生物中的单功能d h f r 蛋白的序列具有明显的同源性 第五步反应 加多聚谷氨酸尾 在所有的有机体中 t h f g l u n 的多聚谷氨酸尾都是通 过多聚谷氨酸合成酶 f p g s 的催化逐一连接到单谷氨酸的丫位 在植物细胞的细胞质 叶绿体和线粒体中 叶酸主要是以其多谷氨酸的形式存在 2 6 1 因此 可能是在完成最后一 步谷胺酰化前 线粒体中一但合成t h f g l u l 就把其输送到细胞的其他区室中 在f p g s 的催化下完成加尾反应 与这个假说相吻合的是 分子杂交结果显示 拟南芥中有3 个拷 贝的f p g s 基因 w e s t e r nb l o t 结果和序列分析表明 三个不同的f p g s 分别位于细胞质 叶绿体和线粒体内口7 1 这与细菌中的不同 细菌中的f p g s 同时还具有d h f s 活性 3 3 1 1 1 2 植物中叶酸的提取 由于叶酸对光敏感 在叶酸的提取过程中 所有的操作都要在暗中进行 防止叶酸降 解 叶酸的提取方法主要有煮沸法和超声波法 但超声波法会不同程度的破坏叶酸的某些 组分 导致叶酸含量检测结果偏低 所以目前大多数都采用煮沸法提取叶酸 然而 植物 中的叶酸主要是以多聚谷氨酸的形式存在的 但是微生物法中的酪乳酸杆菌或高效液相色 谱法只对单谷氨酸叶酸或含2 或3 个谷氨酸尾的叶酸敏感 所以植物中的叶酸在检测前需 要加入叶酸轭合酶对其进行水解 使各种形式叶酸均转变成单谷氨酸叶酸或含2 或3 个谷 氨酸尾的叶酸 否则检测结果不能代表其叶酸总含量 3 4 1 叶酸轭合酶的来源很多 包括人 类或大鼠的血清 鸡胰脏和猪肾脏等 3 5 1 人们经常选用的是大鼠血清 因为它的来源广泛 1 3 6 用叶酸轭合酶酶解4h 即可使叶酸的释放达到最大值 为了保证叶酸稳定性 提取液 中需加入1 o 的抗坏血酸和0 1 的2 巯基乙醇 叶酸早期解离和匀浆过程中的最适p h 值是6 5 所以一定要保证提取缓冲液的p h 值是6 5 样品在1 0 0 c 煮沸1 0 m i n 即可阻止 叶酸衍生物进一步的转化 所以不需要煮沸更久 1 1 3 叶酸的检测方法 目前 叶酸的检测方法主要有微生物法 免疫法 高效液相色谱法和比色法 每种方 法的应用各不相同 主要根据检测样品的种类来决定 最早发展的是微生物法 灵敏度高 4 兰州大学研究生学位论文 但重复性相对较差 其优点是检测样品种类范围比较广 尤其适用于植物材料的叶酸含量 测定 2 i 上世纪7 0 年代发展的免疫法虽然快速 简便 但不适用于检测单谷氨酸叶酸衍生 混合物 只能测定纯叶酸制品或药品制剂中的叶酸含量1 3 副 同时期也发展了另一种快速 灵敏的叶酸检测方法 即高效液相色谱法 天然存在的叶酸有多种衍生物 用一般的化学 分析方法不能将各种衍生物分别进行检测 采用高效液相色谱法就可将它们分离开 此方 法灵敏度高 适合于低含量物质的检测 3 引 比色法虽然操作比较简单 但其影响因素较多 不够灵敏 准确f 3 9 1 综合以上分析 目前国内国际流行的检测植物中的叶酸含量的方法学 是微生物法和高效液相色谱法 前者用来检测叶酸的总含量 后者用来分析单独的各种叶 酸组分的含量 为解析叶酸的合成与代谢提供了可能 1 2p a b a 分支合成途径的研究进展 p a b a 是合成重要的芳香族化合物所必需的 包括苯丙氨酸 酪氨酸 色氨酸以及它 们的衍生物 4 0 啦 p a b a 合成的第一步是从分支酸形成氨基脱氧分支酸 a d c 在这一 反应中 谷氨酰胺是氨的来源h 3 彤1 第二步是a d c 芳香化去掉丙酮酸盐而转变为 p a b a 4 5 4 6 1 在细菌中例如大肠杆菌 p a b a 的合成需要三个独立的蛋白 p a b a 即酰胺 转移酶 p a b b 即a d c s 和p a b c 即a d c l 在细菌中a d c 的合成需要p a b a 和p a b b 形成的二聚体共同起作用 4 7 其中 p a b b 蛋白结合分支酸并利用氨催化形成a d c 而氨 又是通过p a b a 催化谷氨酰胺脱氢产生的 4 7 棚 然而 在提供氨的条件下 p a b b 在没有 p a b a 的情况下也可以起作用 4 4 5 0 l 但是 一般情况下 p a b a 和p a b b 并没有分开而是作 为一个稳定的聚合物起作用的 5 0 1 同时也有关于p a b a 和p a b b 之间结合程度的相关报道 5 t 5 2 1 但可以肯定的是这两个酶至少在依赖谷氨酰胺生成a d c 的反应中是结合在一起的 5 2 起初 植物中的p a b a 的合成过程中只了解清楚了一个酶 即a d c s 该酶对p a b a p a b a 类似物和叶酸代谢的最终产物都不敏感h 们 它定位在质体中 2 羽 和细菌中的不同 植物中的a d c s 是由一个单一的多肽形成的 这一多肽具有大肠杆菌p a b a 和p a b b 蛋白 的融合结构域 这一双功能酶并没有裂解活性 b a s s e t 等人蚴已经证明a d c s 缺乏a d c l 的活性 所以猜测植物体内应该具有一个独立介导a d c 芳香化的酶 然而 也存在另外 一种可能 即植物根本不需要a d c l 去催化合成p a b a 因为a d c 非常不稳定 它可以 自发地芳香化为p a b a 5 3 1 n a k a i 等人 5 4 1 对拟南芥氨基脱氧分支酸裂解酶 a t a d c l 进行 了初步研究 预测a t a d c l 蛋白序列的前序列有一段叶绿体定位的信号肽 他们将其氨基 5 兰州大学研究生学位论文 酸序列与番茄 大肠杆菌和枯草杆菌的氨基酸序列进行比对发现 a t a d c l 的蛋白序列与 大肠杆菌的蛋白序列具有2 2 2 6 的同源性 图1 3 a 有趣的是 系统发育分析表明拟南 芥和番茄蛋白与支链氨基酸氨基转移酶 b c a t 的亲缘关系很远 反而与细菌的氨基脱 氧分支酸裂解酶的关系很近 图1 3 b 为了验证a t a d c l 的亚细胞定位 2 0 0 4 年 b a s s e t 等人 2 3 l 将基因a t a d c l 的全长序列转入分离的豌豆叶绿体中 然后与g f p 融合进行瞬时表 达实验 结果表明a d c l 和a d c s 一样定位在叶绿体中 他们通过互补大肠杆菌p a b c 突 变体实验证明了番茄和拟南芥的a d c l 的c d n