碱磷酸酶-基因实验.doc

编号 内蒙古大学生命科学学院生物系基因工程实验室本科基因工程实验论文开题报告论文题目：碱性磷酸酶基因表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达学生姓名： 年 级： 专 业： 指导教师： 二一三年八月十二日学生姓名论文题目开题时间项目来源本科生基因工程大实验课一、立论依据项目的研究意义，国内外研究现状及发展趋势分析，主要参考文献及出处：碱性磷酸酶 (alkaline phosphatase, ALP, ALKP) (EC 3.1.3.1)属磷酸单脂酶族，底物专一性较低，广泛应用于表位连锁图谱，探针标记测序和免疫组织化学等领域。分子生物学中，ALP分解寡聚核甘酸的末端单酯化磷酸，是常用的遗传工程酶。1产碱性磷酸酶的生物有很多，从细菌到高等哺乳动物均有分布。人血液中的碱性磷酸酶含量是重要的指标之一，其检验结果及异位表达对癌症等许多疾病有着指导意义。2，3目前商业碱性磷酸酶主要来源于动物（小牛肠碱性磷酸酶）、植物（麦芽）和微生物（细菌碱性磷酸酶）(Bacterial alkaline phosphatase, BAP)。在革兰氏阴性细菌中，BAP表达于细胞膜外的周质空间。相比表达于胞内使其更机动和高效。BAP的功能已基本揭示，简单来说BAP是细菌产生摄取应用的自由磷酸基团的一种方式，4被大量的实验证据所支持。然而，缺乏BAP的E. coli 仍然能够存活，所以应该还存在相关的替代机制。5目前，对BAP的研究热点主要由于其海洋有机磷利用的酶特性等集中于海洋微生物领域。海洋细菌碱性磷酸酶的亚细胞研究揭示了其相关合成基因及表达特性对于海洋有机磷循环及海洋生物多样性的贡献。研究人员证实了3733种BAP序列(包括 PhoA, PhoD, and PhoX )，包含胞质分泌及胞外位于不同支载结构。大量的实验数据支持了细菌于海洋表面部分光耦合的磷摄取机制。6鉴于磷对于海洋维持初级产能的重要性，并且考虑到其最主要的来源之一有机磷分解，海洋生物BAP的分子生物学研究也是热点之一。相关的酶动力学研究表明，与藻青菌相关的碱性磷酸酶来说，钙对于维持其基本活性是必须的。有假说称其与浮游植物可能是锌-P共限制的，一些海洋细菌的BAP可选形式即PhoX是于此相关的。7此外，分子研究表明，移除BAP的3磷酸集团能够促进碰撞诱导解离时RNase消化产物分析对的寡核苷酸覆盖。8另外，ALP于哺乳动物的分子酶动力学研究与海洋BAP也取得了相应的结果。外生碱性磷酸酶处理补充了结肠炎的内生酶保护机制以及抑制了细菌对大鼠的转座。为AP抵制细菌转座作用补充了证据。9本研究对BAP进行克隆及表达研究，能够为进一步的科研研究提供原料，具有一定的经济价值，并无较大科研价值。参考文献： 1.Tams, L., Huttov, J., Mistrk, I., Kogan, G. (2002) Eect of Carboxymethyl Chitin-Glucan on the Activity of Some Hydrolytic Enzymes in Maize Plants. Chem. Pap. 56 (5): 326-329.2.Stolbach, L. L., Krant, M. J., Fishman, W. H. (1969) Ectopic Production of an Alkaline Phosphatase Isoenzyme in Patients with Cancer. N Engl J Med. 281:757-762.3.Diener, H.C., Bogousslavsky, J., Brass, L. M. (2004) Aspirin and clopidogrel com- pared with clopidogrel alone after recent ischaemic stroke or transient ischaemic attack in high-risk patients (MATCH): ran- domised, double-blind, placebo-controlled trial. Lancet. 364:331-733.4.Horiuchi, T., Horiuchi, S., Mizuno, D. (1959). A Possible Negative Feedback Phenomenon controlling Formation of Alkaline Phosphomonoesterase in Escherichia coli. Nature. 183:1529-1530.5.Wanner, B. L., Patrick L. (1980). Mutants Affected in Alkaline Phosphatase Expression: Evidence for Multiple Positive Regulators of the Phosphate Regulon in Escherzchza Coli. Genetics 96 (2): 353-366.6.Luo, H.W., Bennera, R., Long, R.A., and Hu, J.J. (2009) Subcellular localization of marine bacterial alkaline phosphatases. Proc Natl Acad Sci 106: 21219-21223.7.Kathuria, S., Martiny, A. C. (2012) Prevalence of a calcium-based alkaline phosphatase associated with the marine cyanobacterium Prochlorococcus and other ocean bacteria. Env Microbiol. 13:4-83.8. Krivos, K. L., Addepalli, B., Limbach, P. A. (2011) Removal of 3-phosphate group by bacterial alkaline phosphatase improves oligonucleotide sequence coverage of RNase digestion products analyzed by collision-induced dissociation mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom. 25:3609-3616.9. Martinez-Moya, P., Ortega-Gonzalez, M., Gonzalez, R., Anzola, A., Ocon, B., Hernandez-Chirlaque, C., et al. (2012). Exogenous alkaline phosphatase treatment complements endogenous enzyme protection in colonic inflammation and reduces bacterial translocation in rats. Pharmacol Res. 66:144-153.二、实验方案1 实验内容和实验目标，拟解决的关键问题： 实验内容：包括质粒提取、PCR扩增、转化大肠杆菌、凝胶回收、感受态制备、IPTG诱导、SDS-PAGE鉴定等。 关键问题：IPTG诱导量及诱导时间的优化； 超声破碎的方案优化。2. 实验思路、方法、技术路线、实验方案及可行性分析： 实验思路：依据技术路线完成试验。 实验方法： 实验室常用技术。 技术路线： 实验方案：详细方案已于讲义给出。 可行性分析：实验室相关技术成熟，实验人员熟悉相关的实验内容以及方法，实验的可行性很高。3. 实验进度（10天之内）： 前一夜摇菌。 第一天： 1 提取pET-His, pCDNA-BAP； 2 琼脂糖凝胶电泳鉴定pET-His, pCDNA-BAP； 3 以pCDNA-BAP为模版扩增目的基因片段。 4 酶切pET-His。 第二天 1 凝胶回收酶切片段； 2 PCR产物连接； 3 转化E. coli； 4 摇菌。 第三天 1 IPTG诱导表达； 2 提BAP蛋白； 3 SDS-PAGE鉴定。4. 预期实验成果： 1 获得目的产物BAP； 2 成功构建BAP表达载体； 3 撰写实验报告。5. 曾参与与本实验有关的学习和研究工作积累以及已取得的工作成绩：（学过基因工程课程、读过相关的文献、写过有关的综述、参加过相关的实验设计或研究课题、获得学术奖励情况等）1学习基因工程，期末测评93；读过分子克隆，GENE IX等文献； 2于 生物技术通报(C) 发表综述 蛋白质组学在研究细胞信号转导中的应用，第一作者；于 J. Anim. Sci. (SCI) 接收论文 Molecular Characterization and Expression Analysis of ELOVL1 Gene in the Cashmere Goat (Capra hircus) ，第一作者；于 Dna Cell Bio.l接收改稿 Connecting mTORC1 signaling to SREBP1 activation thorough lipids synthesis in mammals，第三作者；3按时间排序：参与国家创新基金 绒山羊成纤维细胞中超表达转录因子Krox20对IGFBP5启动子活性的影响 完成3种细胞组成型表达检测；参与内蒙古自然科学基金项目No. 2011MS0521完成免疫组化工作；主