细菌产淀粉酶菌种分离与分子鉴定.doc

细菌产淀粉菌种分离与分子鉴定摘要：淀粉酶是水解淀粉和糖原的酶类总称，具有重要的经济利用价值。本实验意在筛选产淀粉酶菌种，并进行16S rDNA的分子鉴定。通过分离纯化rRNA进行测序，最终在数据库中查找确定所属类别。关键字：枯草芽孢杆菌；rRNA；PCR法；序列测定1 引言土壤中含有各种微生物，其中包含淀粉酶的枯草芽孢杆菌。在淀粉作为唯一碳源的鉴别培养基中，只有能产生淀粉酶利用淀粉的菌体才能成为优势菌种。在含淀粉作为唯一碳源的鉴别培养基上的平板上，具有产淀粉酶能力的枯草芽孢杆菌，水解淀粉生成小分子糊精和葡萄糖，在淀粉平板上菌落周围出现水解圈，但肉眼不易分辨，滴加碘液，未水解的淀粉呈蓝色，若菌落周围能形成淀粉水解圈，表明该菌具有产淀粉酶的能力。对于淀粉酶产生菌的筛选分析，强调注意微生物的安全性，防止筛选到一些对人体有害的病原微生物。细菌中的核糖体RNA分为5S rRNA、16S rRNA、23S rRNA,其中16S rRNA相对分子质量适中。16S rDNA由可变区和恒定区组成，不同细菌的恒定区序列基本保守，而可变区序列因细菌而异，故可利用恒定区的序列设计引物将16S rDNA扩增出来，利用可变区序列的差异对不同的细菌进行分类。本文旨在筛选自然界中存在的淀粉酶产生菌，并对其16S rDNA进行序列分析得出菌的种属。2 材料和方法2.1 仪器与材料2.1.1 材料淀粉厂周围土壤2.1.2 培养基实验过程中所采用的培养基，自行配置。配置过程如下：1）产淀粉酶菌分离培养基可溶性淀粉2%；蛋白胨1%；酵母膏0.5%；碳酸氢二钠0.5%；氯化钠0.01%；MgSO47H2O 0.01%；琼脂粉2%。配置好后维持PH为7.0-7.4,121高压灭菌20min。2）菌体培养培养基可溶性淀粉2%；蛋白胨2%；酵母膏0.5%；氯化钠0.01%；MgSO47H2O 0.01%。配置好后维持PH为7.0-7.4,121高压灭菌20min。2.1.3 仪器 高压灭菌锅、恒温培养箱、pH仪、恒温水浴锅、电子天平、锥形瓶、试管、平板、涂布器、玻璃珠、摇床、革兰氏阳性细菌DHA提取试剂盒、细菌16S rRNA PCR鉴定试剂盒、PCR纯化试剂盒、移液枪。2.2 方法 2.2.1细菌淀粉酶菌种的分离按照产淀粉酶菌分离培养基配方制备200ml培养基，121高压灭菌30min，无菌室倒平板。称取0.1g土壤，加入装有10ml蒸馏水的三角瓶中（已灭菌），震荡三角瓶分散菌体，后置于80水浴约15min。吸取0.5ml菌液加入到4.5ml蒸馏水当中混匀，得到10-1浓度的菌液，以此类推制备10-2、10-3浓度梯度菌液。分别吸取梯度浓度菌液100微升，均匀涂布在产淀粉霉菌分离平板上，37培养箱培养24h，最后取出培养好的平皿，在长出的菌落上滴加碘液，菌落周围若有无色透明圈出现，说明淀粉被水解，即菌株能产生淀粉酶。将产透明圈的菌接种后，摇甁培养进行分子鉴定。将产透明圈的菌点接种到另一淀粉平板，培养后第二天检测透明圈和照相。2.2.2 细菌的16S rDNA分子鉴定2.2.2.1 革兰氏阳性菌基因组DNA的提取挑取分离的产淀粉酶单菌落接种到10ml发酵培养基中37震荡过夜培养，然后按照革兰氏阳性菌DHA提取试剂盒指导提取细菌基因组DHA。经过琼脂糖凝胶电泳确认细菌的基因组DNA，控制电压在60-80V，电泳时间在45-60min，Marker为100bp Ladder DNA Marker,由11种长度在100bp至2000bp的DNA片段组成。2.2.2.2 PCR扩增细菌16S rDNA基因片段并纯化按照TaKaRa宝生物工程大连有限公司细菌16S rDNA菌种鉴定试剂盒说明书进行，对16S rDNA基因片段进行PCR扩增。使用1%的琼脂糖凝胶进行PCR产物电泳检测，确认PCR扩增细菌保守基因16S rDNA基因片段。最后按照Omega公司提供的PCR产物纯化试剂盒指导进行PCR产物的纯化，并将纯化产物送至测序公司进行测序。根据所测序列在NCBI数据库中进行同源性对比，所测序序列与数据库中已有的菌种16S rDNA PCR的相似度达99%以上，判断分离菌种属并确定微生物在进化中的位置。3 结果与讨论3.1细菌淀粉酶菌种的分离分析 图3-1 产淀粉酶菌种分离图3.2细菌的16S rDNA分子鉴定分析 1）图3-2 DNA提取后检测电泳图谱2） 图3-3 PCR扩增细菌16S rDNA基因片段电泳图谱3） 图3-4 PCR纯化结果电泳图谱 4）16S rDNA可变区序列的测定结果：GGGCCATGCTAGCAGCTATAGTGTGAGTCTGAGCGCGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCA最终经过NCBI查序可知，实验所得序列与枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）相似度极高，鉴定为杆状菌属 。（Bacillus subtilis strain NS178 16S ribosomal RNA gene, partial sequence）4 总结与体会经过一周的时间，这个实验算是顺利完成了。通过这样的一种实践形式，有效地提高了我们的实验操作能力，对我们实验能力以及日后的毕业设计有相当的促进作用。对于做实验，实验之前应当对实验的目的、原理、方法、操作步骤、实验内容等有一个全面的了解，在实验过程中才能够有条不紊，顺利完成实验。另外，对于涉及到一些比较危险的试剂的实验，应当对该试剂的特性有清楚的认识，了解其操作注意事项，做好相应的预防措施。参考文献1军事医学科学院院刊：叶明亮，袁著忻，李晓娣等细菌随机扩增多态性 DNA分析中模板提