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第六章酶工程 Outline 绪论 1酶的发酵生产 2酶的分离纯化 3 酶分子改造 4酶的固定化 5生物传感器 基因工程 用 剪刀 糨糊 创造新物种的工程 细胞工程 微观水平的嫁接技术 酶工程 让工厂高效 安静 美丽如画的工程 发酵工程 把微生物或细胞造就成无数微型工厂 将神话变为现实的桥梁 绪论 定义 酶是生物细胞产生的 具有催化能力的生物催化剂 酶具有一般催化剂的特征 1 只能进行热力学上允许进行的反应 2 可以缩短化学反应到达平衡的时间 而不改变反应的平衡点 3 通过降低活化能加快化学反应速度 酶的催化高效性 通常要高出非生物催化剂催化活性的106 1013倍 一 酶的定义 酶的高度催化效率 本质 酶的催化具有高度特异性酶促反应的条件温和酶促反应无副反应酶的催化受调控 酶促反应的特点 一般催化剂反应活化能 反应总能量变化 酶促反应活化能 非催化反应活化能 初态 终态 能量改变 活化过程 酶促反应活化能的改变 过渡态 公元前两千多年 我国已有酿酒记载 一百余年前 Pasteur认为发酵是酵母细胞生命活动的结果 1877年 Kuhne首次提出Enzyme一词 1897年 Buchner兄弟用不含细胞的酵母提取液 实现了发酵 1926年 Sumner首次从刀豆中提纯出脲酶结晶 1947年诺贝尔奖 1982年 Cech首次发现RNA也具有酶的催化活性 提出核酶 ribozyme 的概念 1986年诺贝尔奖 1995年 JackW Szostak研究室首先报道了具有DNA连接酶活性DNA片段 称为脱氧核酶 deoxyribozyme 一 酶学研究历史 二 有关历史 酶 活细胞产生的 能在细胞内外起作用的 催化 生理活性物质 enzyme organicchemicalsubstance acatalyst formedinlivingcells abletocausechangesinothersubstancewithoutbeingchangeditself 核酶的发现 改变了有关酶的概念 即 酶是具有生物催化功能的生物大分子 蛋白质或RNA 酶分两大类 主要由蛋白质组成 蛋白类酶 P酶 主要由核糖核酸组成 核酸类酶 R酶 酶的化学本质 酶工程即利用酶的催化作用 在一定的生物反应器中 将相应的原料转化成所需的产品 酶工程是现代酶学理论与化工技术的交叉技术 它的应用主要集中于食品工业 轻工业和医药工业等领域 酶工程 二 酶工程研究简史 应用研究 1894年 日本的高峰让吉用米曲霉制备得到淀粉酶 开创了酶技术走向商业化的先例 1908年 德国的Rohm用动物胰脏制得胰蛋白酶 用于皮革的软化及洗涤 1908年 法国的Boidin制备得到细菌淀粉酶 用于纺织品的褪浆 1911年 Wallerstein从木瓜中获得木瓜蛋白酶 用于啤酒的澄清 1949年 用微生物液体深层培养法进行 淀粉酶的发酵生产 揭开了近代酶工业的序幕 1960年 法国科学家Jacob和Monod提出的操纵子学说 阐明了酶生物合成的调节机制 通过酶的诱导和解除阻遏 可显著提高酶的产量 在酶的应用过程中 人们注意到酶的一些不足之处 如 稳定性差 对强酸碱敏感 只能使用一次 分离纯化困难等 解决的方法之一是固定化 三 固定化技术的发展经历1916年 Nelson和Griffin发现蔗糖酶吸附到骨炭上仍具催化活性 1969年 日本千佃一郎首次在工业规模上用固定化氨基酰化酶从DL 氨基酸生产L 氨基酸 1971年 第一届国际酶工程会议在美国召开 会议的主题是固定化酶 由酶学与化学工程技术 基因工程技术 微生物学技术相结合而产生的一门新的技术科学 它从应用目的出发 研究酶的产生 酶的制备与改造 酶反应器以及酶的各方面应用 分为 化学酶工程与生物酶工程 化学酶工程 初级酶工程 酶化学与化学工程技术相结合的产物 主要研究内容 酶的制备 酶的分离纯化 酶与细胞的固定化技术 酶分子修饰 酶反应器和酶的应用 2 生物酶工程 高级酶工程 在化学酶工程基础上发展起来的 酶学与现代分子生物学技术相结合的产物 生物酶工程主要研究内容如 尿激酶原和尿激酶是治疗血栓病的有效药物 用DNA重组技术将人尿激酶原的结构基因转移到大肠杆菌中 可使大肠杆菌细胞生产人尿激酶原 从而取代从大量的人尿中提取尿激酶 如 酪氨酰 tRNA合成酶 用Ala5 第5位的丙氨酸 取代Thr51 第51位的丝氨酸 使该酶对底物ATP的亲和力提高了100倍 1 用基因工程技术大量生产酶 克隆酶 2 用蛋白质工程技术定点改变酶结构基因 突变酶 3 设计新的酶结构基因 生产自然界从未有过的性能稳定 活性更高的新酶 1961年国际酶学委员会 EnzymeCommittee EC 根据酶所催化的反应类型和机理 把酶分成6大类 三 酶的分类与命名 1 氧化还原酶Oxidoreductase 2 转移酶Transferase 3 水解酶hydrolase 4 裂合酶Lyase 5 异构酶Isomerase 6 合成酶LigaseorSynthetase 酶的分类与命名 1961年以前酶的命名采用习惯命名法 其依据的原则主要有 1 根据酶所作用的底物命名 如催化水解淀粉的酶叫淀粉酶 催化水解蛋白质的酶叫蛋白酶 有时还加上来源以区别不同来源的同一种酶 如木瓜蛋白酶 胃蛋白酶 胰蛋白酶等 2 根据催化反应的性质及类型命名 如氧化酶 转移酶 水解酶等 3 结合上述两个原则综合命名 如催化琥珀酸脱氢反应的酶叫琥珀酸脱氢酶等 在许多情况下 这种习惯的 非系统的或末指明催化性质的命名法是不甚合理的 经常会出现一种酶多个名称或一个名子多个酶共用的情况 为了适应酶学的发展 避免上述情况的发生 国际酶学委员会于1961年提出了一套系统的命名方案和分类原则 2 国际系统命名法按照国际系统命名法 每一种酶有一个系统名称和一个习惯名称 酶的系统名称应当明确标明酶的底物及催化反应的类型 例如乳酸脱氢酶的反应为 L 乳酸 NAD 丙酮酸 NADH H 这个反应的底物是L 乳酸和NAD 类型是氧化还原反应 因此这个酶的系统名称为 L 乳酸 NAD 氧化还原酶 3 国际系统分类法及编号 酶的命名有两种方法 系统名 惯用名 系统名 包括所有底物的名称和反应类型 乳酸 NAD 丙酮酸 NADH H 乳酸 NAD 氧化还原酶 惯用名 只取一个较重要的底物名称和反应类型 乳酸 NAD 氧化还原酶 乳酸脱氢酶 对于催化水解反应的酶一般在酶的名称上省去反应类型 核酸类酶 R酶 的分类 自1982年以来 被发现的核酸类酶越来越多 对它的研究越来越广泛和深入 但是对于分类和命名还没有统一的原则和规定 根据酶催化反应的类型 可以将R酶分为剪切酶 剪接酶 和多功能酶等三类 根据R酶的结构特点不同 可分为锤头型R酶 发夹型R酶 含I型IVS的R酶 含II型IVS的R酶等 根据酶催化的底物是其本身RNA分子还是其它分子 可以将R酶分为分子内催化 incis 也称为自我催化 和分子间催化 intrans 两类 酶的分类与命名的基础是酶的专一性 酶是一类具有催化功能的生物大分子 亦称生物催化剂 生物大分子 蛋白质 核酸 RNA 蛋白类酶 核酸类酶 核酶 漫长的认识过程 催化剂 反应前后不变化 ribozyme 四 酶的化学性质与催化特性 酶促反应 底物 产物 酶的 活性 酶失活 酶所催化的化学反应 被酶催化的物质 S 酶催化产生的物质 P 酶所具有的催化能力 酶丧失催化能力 目前研究内容 一 化学酶研究内容1自然酶的开发2酶的化学修饰3酶的固定化4人工合成酶的研究 二 生物酶研究内容1酶基因的克隆表达2酶的遗传修饰3酶的遗传设计 二 酶的组成 酶 单纯酶 结合酶 全酶 酶蛋白 辅因子 辅因子 辅酶 辅基 金属激活剂 金属离子作为辅助因子 单聚体蛋白酶蛋白寡聚体蛋白 谷酰胺合成酶多聚体蛋白 丙酮酸脱氢酶酶辅基 血红素辅因子辅酶 NAD FAD 生物素等激活剂 金属离子胞内酶酶胞外酶 酶的分子组成 酶的催化专一性主要决定于膜蛋白部分 辅因子通常是作为电子 原子或某些化学基团的载体 三 单体酶 寡聚酶和多酶复合物 1 单体酶 monomericenzyme 仅有一条具有活性部位的多肽链 全部参与水解反应 2 寡聚酶 oligomericenzyme 由几个或多个亚基组成 亚基牢固地联在一起 单个亚基没有催化活性 亚基之间以非共价键结合 3 多酶复合物 multienzymesystem 几个酶镶嵌而成的复合物 这些酶催化将底物转化为产物的一系列顺序反应 酶的不同形式 四 活性部位和必需基团 必需基团 这些基团若经化学修饰使其改变 则酶的活性丧失 活性部位 酶分子中直接与底物结合 并和酶催化作用直接有关的部位 必需基团 活性部位 维持酶的空间结构 结合基团 催化基团 专一性 催化性质 底物 活性中心以外的必需基团 结合基团 催化基团 活性中心 ActivesiteofChymotrypsin胰凝乳蛋白酶 五 酶作用的专一性 族专一性 可作用于一类或一些结构很相似的底物 绝对专一性 只能作用于某一底物 酶的催化作用受到底物浓度 酶浓度 温度 pH值 激活剂浓度 抑制剂浓度等诸多因素的影响 在酶的应用过程中 必须控制好各种环境条件 以充分发挥酶的催化功能 六 影响酶催化的各种因素 3 酶活力单位1961年国际生物化学与分子生物学联合会规定 在特定条件下 温度可采用25 或其它选用的温度 pH等条件均采用最适条件 每1min催化1 mol的底物转化为产物的酶量定义为1个酶活力单位 这个单位称为国际单位 指每毫克酶蛋白所含的酶活力单位数 比活力是酶制剂纯度的常用指标 比活力越大 表示酶越纯 纯化倍数 每次比活力 第一次比活力 产率 回收率 每次总活力 第一次总活力 100 例题 1 在37 pH7 0的条件下 将浓度为0 5mol L的底物溶液5ml与5ml酶液混合反应 准确反应10min用三氯醋酸终止 测得底物浓度为0 01mol L 求5ml酶液的酶活力 求每毫升酶液的酶活力 酶活力单位的定义 在上述条件下 每分钟催化1 mol底物转化为产物的酶量 解 1 5ml酶液的酶活力酶活力 底物减少量 t 0 5 5 10 3 0 01 10 10 3 106 10 240 U 2 每毫升的酶活力酶比活力 酶活力 V 240 5 48 U ml 例2 有一袋500g的酶制剂 取1g酶溶于1000ml缓冲液中制得酶液 再取1ml酶液在37 的条件下与5mlpH7 00 05mol L的底物溶液混合 准确反应10分钟终止反应 测得底物浓度为0 02mol L 问1ml酶液的酶活力是多少 那1g酶的酶活力呢 该袋酶的酶活力及比活力呢 注 酶活力单位 U 定义 在37 pH7 0的条件下 每分钟催化1 mol底物转化为产物的酶量定义为一个酶活力单位 解 1 底物减少量 0 05 5 10 3 0 02 6 10 3 106 130 mol1ml酶液的酶活力 酶活力 底物减少量 t 130 10 13U ml 2 1g酶的酶活力 酶活力 13U ml 1000ml g 13000U g 3 该袋酶的酶活力 酶活力 13000U g 500g 6 5 106U 4 该酶的比活力 酶比活力 酶活力 酶质量 13000 1000 13 U mg 或酶比活力 酶活力 酶质量 6 5 106 500 1000 13 U mg 酶的变性 是指酶分子结构中的氢键 二硫键及范德华力被破坏 酶的空间结构也受到破坏 原来有序 完整的结构变成了无序 松散的结构 失去了原有的生理功能 酶的失活酶的自身活性受损 包括辅酶 金属离子受损 失去了与底物结合的能力 酶的变性与酶的失活 测定酶活力的一般方法 终点法 终止法 也称化学反应法 将酶和底物混合后 让其反应一定时间 然后停止犯疑 定量测定第五的减少或产物生产生成量 一般测产物的生成量比较好动力学方法 连续法 将酶和底物混合后间隔一段时间 间断或连续测定酶反应过程中产物 底物或辅酶的变化量 如光密度的增加或减少 可以直接测定酶反应的初速度 灵敏度较高 酶活力测定分两个阶段 1 酶与底物反应 1 确定底物及最佳反应条件 无测定方法时 2 底物溶液及酶液的准备 缓冲液 新鲜 预热 3 酶与底物反应 恒温 及时终止 2 测底物或产物变化量 测定酶活力时应注意几点 1 应测反应初速度 initialvelocityorinitialspeed 2 酶的反应速度一般用单位时间内产物的增加量来表示 3 测酶活力时应使反应温度 pH 离子强度和底物浓度等因素保持恒定 4 测定酶反应速度时 应使 S E 酶活力的测定方法 分光光度法 spectrophotometry 该法要求酶的底物和产物在紫外或可见光部分光吸收不同 1 要有台自动记录的紫外可见分光光度计 能使比色杯内的反应在恒温条件 0 2度 下进行 2 酶的底物和产物对光的吸收波长不同 优点 简便 迅速 准确 一个样品可多次测定 有利于动力学研究 可检测到10 9mol L水平的变化 例 人血清乳酸脱氢酶活力的测定 分光光度法 spectrophotometry 荧光法 fluorometry 该法要求酶反应的底物或产物有荧光变化 主要的优点 灵敏度很高 可以检测10 12mol L的样品酶蛋白分子中的Tyr Trp Phe残基以及一些辅酶 辅基 如NADHNADPH FMN FAD等都能发出荧光 酶偶联分析法 enzymecouplingassay 第一个酶的产物为第二个酶的底物 这两个酶系统在一起反应 P1无光吸收或荧光变化 偶联后 P2有光吸收或荧光变化 例 测己糖激酶的活性 一 酶工程原理和基本过程 菌种 扩大培养 发酵 发酵酶液 酶的提取 酶成品原料 前处理 杀菌 酶反应器 反应液 产品提取 产品 1酶的发酵生产 酶的生产方法 提取分离法 Extraction 生物合成 Biosynthesis 化学合成 chemicalsynthesis SOD bloodPapain PapayaChymotrypsin Pancrea organ tissue cell AmylasefromBacillusProteasefromBacillusPhosphatasefromBacillusGlucoamylasefromAspergillus PlantcellcultureAnimalcellculture Fewexample 二 常见产酶微生物CommonmicroorganisminEnzymeProduction 基本要求 不是致病菌 发酵周期短 产酶量高 不易变异退化 最好是产生胞外酶的菌种 利于分离 对医药和食品用酶 还应考虑安全性 凡从可食部分或食品加工中传统使用的微生物生产的酶 安全 由非致病微生物制取的酶 需作短期毒性实验 非常见微生物制取的酶 需做广泛的毒性实验 包括慢性中毒实验 大肠埃希氏杆菌 简称为大肠杆菌 是最为著名的原核生物 形态 短杆或长杆状 0 5 1 0 1 0 3 0um 革兰氏阴性 运动 周毛 或不运动 无芽孢 一般无荚膜 菌落呈白色至黄白色 扩展 光滑 闪光 Escherich属菌株和大多数大肠杆菌是无害 但也有些大肠杆菌是致病的 会引起腹泻和尿路感染 大肠杆菌的名声主要因它易于在实验室操作 生长迅速 而且营养要求低 应用 大肠杆菌能作为宿主供大量的细菌病毒生长繁殖大肠杆菌也是最早用作基因工程的宿主菌工业上生产谷氨酸脱羧酶 天冬酰胺酶和制备天冬氨酸 苏氨酸及缬氨酸等 醋酸杆菌 Acetobacter 菌体从椭圆至杆状 单个 成对或成链 革兰氏阴性 运动 周毛 或不运动 不生芽孢 好气 含糖 乙醇和酵母膏的培养基上生长良好 应用 有机酸 食醋等 葡萄糖异构酶 高果糖浆 山梨糖 维C中间体 枯草芽孢杆菌 Bacillussubtilis 直状 近直状的杆菌 周生或侧生鞭毛 革兰氏阳性 无荚膜 芽孢0 5 1 5 1 8 m 中生或近中生 枯草芽孢杆菌是工业发酵的重要菌种之一 生产淀粉酶 蛋白酶 5 核苷酸酶 某些氨基酸及核苷 放线菌1987年以后 Bucher发现酶的细胞外作用现象 从而导致了酶的商品化生产 链霉菌 Streptomyces 链霉菌是一种放线菌 形成分枝的菌丝体 有气生菌丝和基内菌丝之分 基内菌丝体不断裂 只有气生菌丝体形成孢子链 链霉菌是生产葡萄糖异构酶的主要菌株 还可以用于生产青霉素酰化酶 纤维素酶 碱性蛋白酶 中性蛋白酶 几丁质酶等 此外 链霉菌还含有丰富的16 羟化酶 可用于甾体转化 曲霉 Aspergillus 分类 多数属于子囊菌亚门 少数属于半知菌亚门 分布 广泛分布于土壤 空气和谷物上 可引起食物 谷物和果蔬的霉腐变质 有的可产生致癌性的黄曲霉毒素 代表种 黑曲霉Asp Niger 黄曲霉Asp flavus应用 是制酱 酿酒 制醋的主要菌种 是生产酶制剂 蛋白酶 淀粉酶 果胶酶 的菌种 生产有机酸 如柠檬酸 葡萄糖酸等 农业上用作生产糖化饲料的菌种 霉菌最初的商品酶制剂主要以动植物为原料提取 如从牛胃中提取凝乳酶 从胰脏中提取胰酶 从血液中提取凝血酶 从植物材料中提取淀粉酶等 之后 Takamine利用霉菌来生产淀粉酶使得酶制剂工业取得突破 其方法至今仍被采用 黑曲霉可用于生产多种酶 有胞外酶也有胞内酶 如糖化酶 淀粉酶 酸性蛋白酶 果胶酶 葡萄糖氧化酶 过氧化氢酶 核糖核酸酶 脂肪酶 纤维素酶 橙皮苷酶 柚苷酶等 根霉 Rhizopus 分类学上属于藻状菌纲 毛霉目 根霉属 根霉因有假根 Rhizoid 而得名 假根的功能是在培养基上固着 并吸收营养 分布于土壤 空气中 常见于淀粉食品上 可引起霉腐变质和水果 蔬菜的腐烂 代表种 米根霉 R oryzae 黑根霉 R nigrican 等 应用 根霉能产生一些酶类 如淀粉酶 果胶酶 脂肪酶等 是生产这些酶类的菌种 在酿酒工业上常用做糖化菌 有些根霉还能产生乳酸 延胡索酸等有机酸 青霉 Penicillium 青霉属半知菌纲 营养菌丝无色 淡色 有横隔 分生孢子梗亦有横隔 顶端形成扫帚状的分枝 小梗顶端串生分生孢子 分生孢子球形 椭圆形或短柱形 光滑或粗糙 大部分在生长时呈蓝绿色 青霉菌分布广泛 种类很多 其中产黄青霉 Penicilliumchrysogenum 用于生产葡萄糖氧化酶 苯氧甲基青霉素酰化酶 主要作用于青霉素V 果胶酶 纤维素酶CX等 桔青素 Penicilliumcitrinum 用于生产5 磷酸二酯酶 脂肪酶 葡萄糖氧化酶 凝乳蛋白酶 核酸酶S1 核酸酶P1等 三 酶的发酵工艺条件与控制Thefermentationprinciplesanditscontrolofenzymeproduction 1 培养基 2 发酵条件及控制 3 提高产酶的措施 Go Go Go 1 培养基 各种生物对营养的需求 1 选择适宜的营养物质2 营养物的浓度及配比合适3 物理 化学条件适宜4 经济节约5 精心设计 试验比较 培养不同的微生物必须采用不同的培养条件 培养目的不同 原料的选择和配比不同 不同阶段 培养条件也有所差异 培养基的设计原则 五大要素 碳源 氮源 无机盐 生长因子 水 培养基几乎是一切对微生物进行研究和利用工作的基础 培养基 medium 是人工配制的 适合微生物生长繁殖或产生代谢产物的营养基质 任何培养基都应该具备微生物生长所需要五大营养要素 构成细胞物质或代谢产物中碳架 碳源可作能源 为生命活动提供能量 常用碳源 糖类 醇类 脂类 有机酸 烃类 蛋白质及其降解物 异养微生物 糖类是最好碳源 葡萄糖最为通用 水是微生物最基本的组成分 水是微生物体内和体外的溶剂 吸收营养成分和代谢废物 水是细胞质组分 直接参与各种代谢活动调节细胞温度和保持环境温度的稳定 比热高 传热快 水 碳源 选择合适碳源 以适应目的酶的合成调节机制 构成细胞物质和代谢产物中氮素 不能用作能源 氮源 有机氮源 蛋白胨 酵母膏 牛肉膏 无机氮源 铵盐 硝酸盐 参与酶的组成 构成酶活性基 激活酶活性维持细胞结构的稳定性调节细胞渗透压控制细胞的氧化还原电位有时可作某些微生物生长的能源物质 常用 硫酸盐 磷酸盐 氯化物以及含有钾 钠 钙 镁 铁等元素的化合物 氮源 无机盐 需要注意合适的碳氮比 生长因子 生长因子是指某些微生物不能用普通的碳源 氮源物质进行合成 而必须另外加入少量的生长需求的有机物质 分类 化学结构分成维生素 氨基酸 嘌呤 或嘧啶 及其衍生物和类脂成分等四类 功能 以辅酶与辅基的形式参与代谢中的酶促反应 实验室中常用酵母膏 蛋白胨 牛肉膏等作为各种生长因子的的需要 麦芽汁 米曲汁等天然培养基中本身含有各种生长因子 实验室的常用培养基 细菌 牛肉膏蛋白胨培养基 或简称普通肉汤培养基 放线菌 高氏1号合成培养基培养 酵母菌 麦芽汁培养基 霉菌 查氏合成培养基 例如枯草芽孢杆菌 一般培养 肉汤培养基或LB培养基 自然转化 基础培养基 观察芽孢 生孢子培养基 产蛋白酶 以玉米粉 黄豆饼粉为主的产酶培养基 2 发酵条件及控制 培养基的pH必须控制在一定的范围内 以满足不同类型微生物的生长繁殖或产生代谢产物 为了维持培养基pH的相对恒定 通常在培养基中加入pH缓冲剂 或在进行工业发酵时补加酸 碱 通常培养条件 细菌与放线菌 pH7 7 5酵母菌和霉菌 pH4 5 6范围内生长 pH值的控制 细胞发酵产酶的最适pH值与生长最适pH值往往有所不同 细胞生产某种酶的最适pH值通常接近于该酶催化反应的最适pH值 有些细胞可以同时产生若干种酶 在生产过程中 通过控制培养基的pH值 往往可以改变各种酶之间的产量比例 通常在生物学范围内每升高10 生长速度就加快一倍 所以温度直接影响酶反应 对于微生物来说 温度直接影响其生长和合成酶 温度的控制 有些细胞发酵产酶的最适温度与细胞生长最适温度有所不同 而且往往低于生长最适温度 这是由于在较低的温度条件下 可以提高酶所对应的mRNA的稳定性 增加酶生物合成的延续时间 从而提高酶的产量 枯草杆菌的最适生长温度为34 37 黑曲霉的最适生长温度为28 32 溶解氧的控制 在酶的发酵生产过程中 处于不同生长阶段的细胞 其细胞浓度和细胞呼吸强度各不相同 致使耗氧速率有很大的差别 因此必须根据耗氧量的不同 不断供给适量的溶解氧 调节通气量调节氧的分压调节气液接触时间调节气液接触面积改变培养液的性质 控制溶解氧方法 3 提高酶产量的措施 添加诱导物 对于诱导酶的发酵生产 在发酵过程中的某个适宜的时机 添加适宜的诱导物 可以显著提高酶的产量 例如 乳糖诱导 半乳糖苷酶 纤维二糖诱导纤维素酶 蔗糖甘油单棕榈酸诱导蔗糖酶的生物合成等 诱导物一般可以分为3类酶的作用底物酶的催化反应产物作用底物的类似物 控制阻遏物的浓度 阻遏作用根据机理不同 可分为 产物阻遏和分解代谢物阻遏两种 1 产物阻遏作用是由酶催化作用的产物或者代谢途径的末端产物引起的阻遏作用 2 分解代谢物阻遏作用是由分解代谢物 葡萄糖等和其它容易利用的碳源等物质经过分解代谢而产生的物质 引起的阻遏作用 为了减少或者解除分解代谢物阻遏作用 应当控制培养基中葡萄糖等容易利用的碳源的浓度 采用其他较难利用的碳源 如淀粉等 采用补料 分次流加碳源 添加一定量的环腺苷酸 cAMP 对于受代谢途径末端产物阻遏的酶 可以通过控制末端产物的浓度的方法使阻遏解除 添加表面活性剂 表面活性剂可以与细胞膜相互作用 增加细胞的透过性 有利于胞外酶的分泌 从而提高酶的产量 将适量的非离子型表面活性剂 如吐温 Tween 特里顿 Triton 等添加到培养基中 可以加速胞外酶的分泌 而使酶的产量增加 由于离子型表面活性剂对细胞有毒害作用 尤其是季胺型表面活性剂 如 新洁而灭 等 是消毒剂 对细胞的毒性较大 不能在酶的发酵生产中添加到培养基中 添加产酶促进剂 产酶促进剂是指可以促进产酶 但是作用机理未阐明清楚的物质 例如 添加一定量的植酸钙镁 可使霉菌蛋白酶或者桔青霉磷酸二酯酶的产量提高1 20倍 添加聚乙烯醇 Polyvinylalcohol 可以提高糖化酶的产量 产酶促进剂对不同细胞 不同酶的作用效果各不相同 现在还没有规律可循 要通过试验确定所添加的产酶促进剂的种类和浓度 一 酶的提取 分离纯化技术路线 细胞破碎 酶提取 酶分离纯化 酶浓缩 酶贮存 动物 植物或微生物细胞 发酵液 离心分离 过滤分离 沉淀分离 层析分离 电泳分离 萃取分离 结晶分离等 2酶的分离纯化 酶和杂蛋白的性质差异大体上可有以下几个方面 根据这些差异 其分离方法有 1 根据分子大小轻重设计的方法 如离心分离法 筛膜分离法 凝胶过滤法等 2 根据溶解度大小分离的方法 如盐析法 有机溶剂沉淀法 共沉淀法 选择性沉淀法 等电点沉淀法等 3 按分子所带正负电荷多少分离的方法 如离子交换分离法 电泳分离法 聚焦层析法等 4 按稳定性差异建立的分离方法 如选择性热变性法表面变性法等 5 按亲和作用的差异建立的分离方法 如亲和层析法等 酶分离纯化不同阶段 酶的纯化过程 约可分为三个阶段 1 粗蛋白质 crudeprotein 采样 均质打破细胞 抽出全蛋白 多使用盐析沉淀法 可以粗略去除蛋白质以外的物质 2 部分纯化 partiallypurified 初步的纯化 使用各钟柱层析法 3 均质酶 homogeneous 目标酶的进一步精制纯化 可用制备式电泳或HPLC 例 糖化酶分离纯化 一 糖化酶的浸出 称糖化酶2g 加20mL水 弃沉淀 上清液为酶浸出液 搅拌15min 4000r min 15min 二 硫酸铵盐析 量上清液体积 加472g L硫酸铵 静置30min 4000r min 15min 弃上清 留沉淀 加水4mL于小烧杯备用 三 分子筛层析 脱盐 四 酒精沉淀 1mol L盐酸调节至pH4 0 2 5倍体积冷乙醇 静置 30min 4000r min 15min 无水乙醇洗一次 离心 5min 酶泥 六 酶的浓缩 干燥与结晶 浓缩与干燥都是酶与溶剂 通常是水 分离的过程 在酶的分离纯化过程中是一个重要的环节 离心分离 过滤与膜分离 沉淀分离 层析分离等都能起到浓缩作用 用各种吸水剂 如硅胶 聚乙二醇 干燥凝胶等吸去水分 也可以达到浓缩效果 蒸发浓缩是通过加热或者减压方法使溶液中的部分溶剂汽化蒸发 使溶液得以浓缩的过程 由于酶在高温条件下不稳定 容易变性失活 故酶液的浓缩通常采用真空浓缩 即在一定的真空条件下 使酶液在60 以下进行浓缩 在固体酶制剂的生产过程中 为了提高酶的稳定性 便于保存 运输和使用 一般都必须进行干燥 常用的干燥方法有 真空干燥冷冻干燥喷雾干燥气流干燥吸附干燥 结晶是溶质以晶体形式从溶液中析出的过程 酶的结晶是酶分离纯化的一种手段 它不仅为酶的结构与功能等的研究提供了适宜的样品 而且为较高纯度的酶的获得和应用创造了条件 酶在结晶之前 酶液必须经过纯化达到一定的纯度 如果酶液纯度太低 不能进行结晶 通常酶的纯度应当在50 以上 方能进行结晶 总的趋势是酶的纯度越高 越容易进行结晶 要说明的是 不同的酶对结晶时的纯度要求不同 有些酶在纯度达到50 时就可能结晶 而有些酶在纯度很高的条件下也无法析出结晶 所以酶的结晶并非达到绝对纯化 只是达到相当的纯度而已 盐析结晶有机溶剂结晶透析平衡结晶等电点结晶 通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变 从而改变酶的某些特性和功能的技术过程称为酶分子修饰 即 在体外将酶分子通过人工的方法与一些化学基团 物质 特别是具有生物相容性的物质 进行共价连接 从而改变酶的结构和性质 3 酶分子改造 一 酶的分子修饰 天然酶的缺陷 易于变性失活 酸 碱 有机溶剂 热 容易受产物和抑制剂的抑制 工业反应要求的酸度和温度并不总是在酶反应的最适酸度和温度范围内 底物不溶于水 或酶的米式常数过高 酶做为药物在体内的半衰期较短等因素限制了酶制剂的应用 酶化学修饰的目的 研究酶的结构与功能的关系 50年代末 人为改变天然酶的某些性质 扩大酶的应用范围 70年代末之后 1 提高酶的生物活性 酶活力 2 增强酶的稳定性 热稳定性 体内半衰期 3 消除抗原性 针对特异性反应降低生物识别能力 4 产生新的催化能力 酶化学修饰的种类 酶的表面化学修饰酶分子的内部修饰 酶分子修饰的意义 酶的表面化学修饰 目前应用最广的酶分子修饰方法 水溶性大分子通过共价键与酶分子表面结合 形成覆盖层 修饰剂 聚乙二醇 PEG 右旋糖酐 dextran 肝素 heparin 蔗糖聚合物 Ficoll 等 如 PEG 超氧化物歧化酶 SOD PEG 溶血类蛋白质 链激酶 尿激酶等 PEG 天门冬酰胺酶 ASNase 大分子修饰 大分子结合修饰 小分子修饰 酶蛋白侧链基团修饰 侧链基团 组成蛋白质氨基酸残基上的功能团 包括氨基 羧基 胍基 巯基 酚基 咪唑基 主要反应 烷基化反应 酰化反应 氧化还原反应 芳香环取代反应修饰剂 采用的各种小分子化合物 如2 4 二硝基氟苯 碘乙酸 乙酸酐 邻苯二酸酐 H2O2 2 巯基乙醇 四硝基甲烷 卤素 烷基化反应 酰基化反应 连四硫酸盐氧化巯基 DTT还原逆回 用于保护巯基 氧化还原反应 四硝基甲烷 芳香环取代反应 碘代 硝化 NO2 4C NO2 3CH I2 HI 交联修饰 交联法 用双功能基团试剂 如戊二醛 与酶分子内不同肽链部分共价交联 使酶分子空间构象更加稳定 固定化修饰 共价偶联法 通过酶表面的酸性或碱性残基 将酶共价连接到惰性载体上 由于酶所处的微环境发生改变 使酶的最适pH 最适温度和稳定性发生改变 酶分子内部修饰 一 蛋白主链修饰 肽链有限水解修饰 二 氨基酸置换修饰 催化和非催化活性基团的修饰 三 金属离子置换修饰 辅因子修饰 二 酶的蛋白质工程 以重组DNA技术为基础 结合X 衍射分析技术 蛋白质溶液构象理论及计算机辅助设计发展起来的一种定点定位修饰技术体系 也是在基因水平进行蛋白质改造的技术科学 常用 化学全合成法 限制酶酶切片断取代法等 蛋白质工程在酶的改造方面目前研究比较系统的例子是组织型血纤维蛋白溶酶原激活剂 TpA 基因水平上进行蛋白质改造 固定化酶 ImmobilizedEnzyme 是20世纪60年代发展起来的一项新技术 以往使用的酶绝大多数是水溶性的酶 这些水溶性酶催化结束后 极难回收 因而阻碍了酶工业的进一步发展 60年代后 在酶学研究领域内涌现出固定化酶 它是通过物理的或化学的手段 将酶束缚于水不溶的载体上 或将酶柬缚在一定的空间内 限制酶分子的自由流动 但能使酶充分发挥催化作用 过去曾称其为水不溶酶或固相酶 1971年第一届国际酶工程会上正式建议采用固定化酶的名称 4酶的固定化 固定化酶的优缺点 1 极易将固定化酶与底物 产物分开 产物溶液中没有酶的残留 简化了提纯工艺 2 可以在较长时间内反复使用 有利于工艺的连续化 管道化 3 酶反应过程可以严格控制 有利于工艺自动化和微电脑化 4 在绝大多数情况下提高了酶的稳定性 5 较能适应于多酶反应 6 酶的使用效率提高 产物得率提高 产品质量有保障 成本低 优点 固定化酶的优缺点 缺点 1 酶固定化时酶的活力有所损失 同时也增加了固定化的成本 使工厂开始投资大 2 比较适应水溶性底物和小分子底物 3 与完整细胞比较 不适于多酶反应 特别是需要辅因子的反应 同时对胞内酶需经分离后 才能固定化 酶的固定化方法 载体结合法 共价交联法 包埋法 物理吸附法 离子吸附法 螯合法 共价结合法 固定化方法 1 吸附法 通过载体表面和酶分子表面间的次级键相互作用而达到固定目的的方法 是固定化中最简单的方法 吸附法又可分为物理吸附法和离子吸附法 物理吸附法 physicaladsorption 是通过非特异性物理吸附作用将酶直接吸附在水不溶性载体表面上而使酶固定化的方法 包括范德华力 疏水相互作用 氢键 物理吸附法常用的载体 有机载体 纤维素 胶原 淀粉及面筋等 无机载体 活性炭 氧化铝 皂土 多孔玻璃 硅胶 二氧化钛 羟基磷灰石等 物理吸附法 离子吸附法 ionadsorption 是通过离子键使酶与含有离子交换基团的水不溶性载体相结合的固定化方法 此法固定的酶有葡萄糖异构酶 糖化酶 淀粉酶 纤维素酶等 在工业上用途较广 离子吸附法常用的载体 阴离子交换剂 DEAE 纤维素 四乙氨基乙基 TEAE 纤维素等 阳离子交换剂有羧甲基 CM 纤维素 纤维素柠檬酸盐 Dowex 50等 其吸附容量一般大于物理吸附剂 离子吸附法具有操作简便 条件温和 酶活力不易丧失等优点 此外 吸附过程同时可以纯化酶 离子吸附法 2 包埋法 包埋法 entrapment 是将酶包埋在高聚物的细微凝胶网格中或高分子半透膜内的固定化方法 前者又称为凝胶包埋法 酶被包埋成网格型 后者又称为微胶囊包埋法 酶被包埋成微胶囊型 1 凝胶包埋法将聚合物的单体与酶溶液混合 再借助于聚合促进剂 包括交联剂 的作用进行聚合 酶被包埋在聚合物中以达到固定化 凝胶包埋法常用的载体有海藻酸钠凝胶 角叉菜胶 明胶 琼脂凝胶 卡拉胶等天然凝胶以及聚丙烯酰胺 聚乙烯醇和光交联树脂等合成凝胶或树脂 2 微胶囊包埋法微胶囊包埋即将酶包埋在各种高聚物制成的半透膜微胶囊内的方法 它使酶存在于类似细胞内的环境中 可以防止酶的脱落 防止微囊外的环境直接接触 从而增加了酶的稳定性 常用于制造微胶囊的材料有聚酰胺 火棉胶 醋酸纤维素等 3 共价键结合法 共价键结合法 covalentbinding 是将酶与聚合物载体以共价键结合的固定化方法 1 酶蛋白N末端的 氨基或赖氨酸残基的 氨基 2 酶蛋白C末端的 羧基 天门冬氨酸残基的 羧基以及谷氨酸残基的 羧基 3 苯丙氨酸和酪氨酸残基的苯环 4 其他 半胱氨酸残基的巯基 丝氨酸 苏氨酸和酪氨酸残基的羟基 组氨酸残基的咪唑基 色氨酸残基的吲哚基 酶蛋白上可供载体结合的功能基团 酶共价偶联的载体的功能基团 芳香氨基 羟基 羧基和羧甲基等 载体活化的主要反应 重氮法叠氮法溴化氰法芳香烃化法 1 重氮法重氮法是将酶蛋白与水不溶性载体的重氮基团通过共价键相连接而固定化的方法 是共价键法中使用最多的一种 常用的载体有多糖类的芳族氨基衍生物 氨基酸的共聚体和聚丙烯酰胺衍生物等 2 叠氮法即载体活化生成叠氮化合物 再与酶分子上的相应基团偶联成固定化酶 含有羟基 羧基 羧甲基等基团的载体都可用此法活化 如CMC CM sephadex 交联葡聚糖 聚天冬氨酸 乙烯 顺丁烯二酸酐共聚物等都可用此法来固定化酶 其中使用最多的是羧甲基纤维素叠氮法 3 溴化氰法即用溴化氰将含有羟基的载体 如纤维素 葡聚糖凝胶 琼脂糖凝胶等 活化生成亚氨基碳酸酯衍生物 然后再与酶分子上的氨基偶联 制成固定化酶 任何具有连位羟基的高聚物都可用溴化氰法来活化 4 烷基化和芳基化法以卤素为功能团的载体可与酶蛋白分子上的氨基 巯基 酚基等发生烷基化或芳基化反应而使酶固定化 此法常用的载体有卤乙酰 三嗪基或卤异丁烯基的衍生物 优点 共价键的键能高 酶和载体之间的结合相当牢固 即使用高浓度底物溶液或盐溶液 也不会使酶分子从载体上脱落下来 具有酶稳定性好 可连续使用较长时间的优点 缺点 载体活化的难度较大 操作复杂 反应条件较剧烈 制备过程中酶直接参与化学反应 易引起酶蛋白空间构象变化 4 交联法 交联法 cross linking 是使用双功能或多功能试剂使酶分子之间相互交联呈网状结构的固定化方法 常用的双功能试剂有戊二醛 己二胺 异氰酸衍生物等 戊二醛和酶蛋白中的游离氨基发生Schiff反应 形成薛夫碱 从而使酶分子之间相互交联形成固定化酶 5 选择性热变性法 专用于细胞固定化 是将细胞在适当的温度下处理使细胞膜蛋白变性 但不使酶变性而使酶固定于细胞内的方法 6 固定化活细胞 将活细胞限制或定位于特定空间位置的方法 无需进行酶的分离和纯化 减少酶的活力损失 同时大大降低了成本 保持了酶的原始状态 比固定化酶的稳定性更高 对污染的抵抗力更强 细胞本身含多酶系统 可催化一系列反应 且不需添加辅助因子 细胞生长停滞时间短 细胞多 反应快等 固定化活细胞的优越性 缺点必须保持菌体的完整 需防止菌体的自溶 否则影响产物的纯度 必须抑制细胞内蛋白酶对目的酶的分解 胞内多酶的存在 会形成副产物 载体 细胞膜或细胞壁会造成底物渗透与扩散的障碍等 制备方法 固定化活细胞的制备条件比固定化酶更要温和 其制备方法主要有物理吸附法和包埋法两种 固定化酶的特性 固定化酶的形状 固定化酶的形式多样 依不同用途有颗粒状 纤维状 酶膜和酶管等形状 其中颗粒占绝大多数 它和纤维状主要用于工业发酵生产 如装成酶柱用于连续生产 或在反应器中进行批式搅拌反应 固定化酶的性质 酶活力酶稳定性酶学特性 固定化酶的活力在多数情况下比天然酶的活力低 其原因可能是 酶活性中心的重要氨基酸残基被载体结合 高级结构和空间构象的改变 空间位阻的影响 内扩散阻力 半透膜的隔离 个别情况下 酶经固定化后其活力升高 固定化酶的酶活力 操作稳定性 体内半衰期贮藏稳定性 低温放置热稳定性 耐热性提高对蛋白酶的稳定性 空间位阻其他 对有机溶剂 pH 酶抑制剂等的稳定性均有提高 固定化酶的稳定性 底物特异性 对高分子底物的活性明显下降 最适pH 最适pH和pH曲线常会发生偏移 最适温度 多数较游离酶高 动力学常数 Km均增大 增大幅度视情况而定 最大反应速度 与游离酶大多数是相同或相近 固定化酶的酶学特性 五 酶反应器 酶和固定化酶在体外进行催化反应时 都必需在一定的反应容器中进行 以便控制酶催化反应的各种条件和催化反应的速度 用于酶进行催化反应的容器及其附属设备称为酶反应器 酶反应器是用于完成酶促反应的核心装置 它为酶催化反应提供合适的场所和最佳的反应条件 以便在酶的催化下 使底物 原料 最大限度地转化成产物 它处于酶催化应过程的中心地位 是连接原料和产物的桥梁 P132 4 应具有最佳的无菌条件 否则 杂菌污染使反应器的生产能力下降 1 所用生物催化剂应具有较高的比活和酶浓度 或细胞浓度 才能得到较大的产品转化率 2 能用电脑自动检测和调控 从而获得最佳的反应条件 3 应具有良好的传质和混合性能 传质是指底物和产物在反应介质中的传递 传质阻力是反应器速度限制的主要因素 理想的酶反应器的要求 按结构区分搅拌罐式反应器 StirredTankReactor STR 鼓泡式反应器 bubblecolumnreactor BCR 填充床式反应器 packedcolumnreactor PCR 流化床式反应器 FluidizedBedReactor FBR 膜反应器 MembraneReactor MR 按操作方式区分分批式反应 batch 连续式反应 continuous 流加分批式反应 feedingbatch 混合形式连续搅拌罐反应器 ContinuousStirredTankReactor CSTR 分批搅拌罐反应器 BatchStirredTankReactor BSTR 常见的酶反应器类型 各种酶反应器的特点 各种酶反应器的特点 这类反应器结构简单 造价较低 传质阻力很小 反应能迅速达到稳态 主要应用在饮料和食品工业中 其缺点是操作麻烦 在反复回收过程中固定化酶容易损失 所以工业规模的固定化酶很少采用 常用于游离酶 BSTR 间歇式搅拌罐反应器 BSTR 这种反应器在运转过程中 底物以恒定的流速流入反应器 与此同时 反应液则以同样的流速流出反应器 反应桶内装有搅拌器 使反应组分与固定化酶颗粒混合均一 出口处有过滤膜 可使不断补充新鲜底物与反应液流量维持动态平衡 CSTR 连续流动搅拌罐反应器 CSTR 优点 反应液混合良好 各部位的成分相同 并与流出液的组成也一致 CSTR的开放结构使得调换固定化酶比较容易 而且有利于控制温度和调节pH 还能够处理胶态或不溶性底物 受底物抑制的固定化酶采用CSTR有较高的转化率 缺点 由搅拌产生的剪切力较大 易打碎磨损固定化酶颗粒 需改良的CSTR 填充床反应器 PBR PBR 又称固定床反应器 可填充多向异性半透性中空纤维制成管状 内部填充酶膜 酶片等 在填充床反应器内 底物在一定方向上以恒定的速度通过固定化酶柱 以近似活塞式流动反应器 PlugFlowReactor PFR 运转 流化床反应器 FBR FBR FBR 种装有较小颗粒的垂直塔式反应器 反应时 底物溶液以足够大的流速 从反应器底部向上通过固定化酶柱床 便能使固定化酶颗粒始终处于流化状态 其混合程度介于CSTR的全混型和PFR的平推流型之间 由于反应器内混合程度高 因此 传热 传质情况良好 可处理粘性大 含有固体颗粒的底物 连续搅拌罐 超滤膜反应器 CSTR UFR CSTR UFR CSTR UF结构是CSTR与超滤装置联用的酶膜反应器 在CSTR出口处设置一个超滤装置 通过超滤装置 酶可以循环使用 该超滤器中的半透性超滤膜只允许小分子产物通过 不允许大分子酶和底物通过 该反应器适用于颗粒较细的固定化酶 游离酶和细胞以及小分子产物与大分子底物 循环式反应器 RCR 外循环反应器 内循环反应器 循环操作仍能为底物与酶提供足够的接触机会 以达到所需的转化率 这种反应器可用于难溶或者不溶性底物的转化反应 固定化细胞法生产6 氨基青霉烷酸 青霉素G经青霉素酰化酶作用 水解除去侧链后的产物称为6 氨基青霉烷酸 也称无侧链青霉素 6 APA结构式 基本原理 工艺路线 大肠杆菌的培养 大肠杆菌固定化 固定化大肠杆菌反应堆制备 转化反应 6 氨基青霉烷酸的提取 工艺要点 大肠杆菌的培养菌种 大肠杆菌D816斜面培养基 普通肉汤琼脂培养基发酵培养基 蛋白胨 氯化钠 苯乙酸 自来水发酵条件 通气搅拌培养 28 pH7 0 大肠杆菌固定化取湿菌体100kg 置于40 反应罐中 在搅拌下加入50L10 戊二醛5升 在转移至搪瓷盘中 使之成为3 5cm厚的液层 室温放置2小时 再转移至4 冷库过夜 待形成固体凝胶后 通过粉碎和过筛 使其成为直径为2mm左右的颗粒状固定化大肠杆菌细胞 用蒸馏水以pH7 5和0 3mol L磷酸缓冲液先后充分洗涤 抽干 备用 固定化大肠杆菌反应堆制备将上述充分洗涤后的固定化大肠杆菌细胞装填于带保温夹套的填充式反应器中 即成为固定化大肠杆菌反应堆 反应器规格为直径70 160cm 转化反应取20kg青霉素G钾盐 加入到1000L配料罐中 用0 03mol L pH7 5的磷酸缓冲液溶解并使青霉素G钾盐浓度为3 用2mol L氢氧化钠溶液调pH至7 5 7 8 然后将反应器及pH调节罐中反应液温度到0 维持反应体系的酸度在7 5 7 8范围内 以70L min流速使青霉素G钾盐溶液通过固定化大肠杆菌反应堆进行循环转化 直至转化液酸度不变为止 循环时间一般为3 4h 反应结束后 放出转化液 再进入下一批反应 6 氨基青霉烷酸的提取上述转化液经过滤澄清后 滤