临床免疫学凝集反应.doc

第五章凝集反应本章考点1.概述2.直接凝集反应3.间接凝集反应 第一节概述 细菌、红细胞等颗粒抗原，或可溶性抗原（或抗体）与载体颗粒结合成致敏颗粒后，它们与相应抗体（或抗原）在适当电解质存在下，形成肉眼可见的凝集现象，称凝集反应。凝集反应分为两个阶段：抗原抗体的特异性结合；出现可见的颗粒凝聚。凝集反应的特点：凝集试验是一个定性的检测方法，即根据凝集现象的出现与否判定结果阴性或阳性；也可以进行半定量检测，即将抗体作一系列稀释，与抗原结合产生凝集的最高稀释倍数作为其效价或滴度。由于凝集反应灵敏度高、方法简便，因而在临床检验中被广泛应用。 第二节直接凝集反应 直接凝集反应：其原理是细菌、螺旋体和红细胞等颗粒性抗原，在适当的电解质参与下可直接与相应抗体结合出现凝集，称直接凝集反应。参加凝集反应的抗原称凝集原，抗体则称为凝集素。从方法上来讲，有玻片法和试管法两类。玻片法凝集主要用于抗原的定性分析，短时间便能观察结果，一般用来鉴定菌种或分型；也用于人类AB0血型的测定。试管凝集反应是用定量抗原悬液与一系列递度倍比稀释的待检血清混合，保温静置后，根据每管内颗粒凝集的程度，以判断待检血清中有无相应抗体及其效价，可以用来协助临床诊断或流行病原调查研究。例如Widal反应、Well-Felix反应、输血时也常用于受体和供体两者间的交叉配血试验。 第三节间接凝集反应 间接凝集反应是将可溶性抗原（或抗体）先吸附于适当大小的颗粒载体表面，然后与相应抗体（或抗原）作用，在适宜电解质存在的条件下，出现特异性凝集现象，称间接凝集反应。根据致敏载体用的是抗原或抗体以及凝集反应的方式，间接凝集反应分为4类：正向间接凝集反应；反向间接凝集反应；间接凝集抑制反应；协同凝集反应。图14 （正向）间接凝集反应（查抗体）图15 （反向）间接凝集反应（查抗原）图16 间接凝集抑制试验（查抗原）（上图为标本中含有待测抗原，下图为标本中无待测抗原，注意凝集说明标本中没有待测抗原）间接凝集反应适用于各种抗体和可溶性抗原的检测。以载体来分，常用的为红细胞、胶乳颗粒及明胶颗粒等。常用的试验有：1.间接血凝试验：其原理是将抗原（或）抗体包被于红细胞表面，成为致敏载体，然后与相应的抗体（或抗原）结合，从而使红细胞被动地凝聚在一起，出现可见的凝集现象。间接血凝试验可分为三类：红细胞包被抗原，用以检测抗体的血凝，称为正向间接血凝反应（PHA）；红细胞包被抗体，用以检测抗原的血凝反应，称为反向间接血凝反应（RPHA）；先将可溶性抗原（或抗体）与相应的抗体（或抗原）混合然后再加入抗原（或抗体）致敏的红细胞，则能抑制原先的血凝现象，称为正向（或反向）间接血凝抑制试验。间接血凝抑制试验可用于检测抗体、自身抗体、变态反应性抗体，也可测定抗原。间接血凝试验：红细胞沉积于管底；1+：红细胞沉积于管底，周围有散在少量凝集；2+：红细胞形成片层凝集，面积较小，边缘较松散；3+：红细胞形成片层凝集，面积多于2+；4+：红细胞形成片层凝集，均匀布满孔底，或边缘皱缩如花边状。2.胶乳凝集试验：胶乳凝集试验也是一种间接凝集试验，所用载体为聚苯乙烯胶乳，是一种直径约为0.8m大小的圆形颗粒，带有负电荷，可物理性吸附蛋白分子，但这种结合牢固性差。胶乳凝集试验分试管法和玻片法两种。胶乳凝集试验用于检测抗溶血素O、RF等。3.明胶凝集试验：将全病毒抗原及重组抗原吸附在粉红色明胶颗粒上，来检测相应抗体。间接凝集反应具有快速、敏感、操作简便、无需特殊的实验设备等特点，而且能用于抗原或抗体的测定，因此在临床检验中广为应用。（1）抗原的检测：反向间接凝集试验用于检测病原体可溶性抗原，也可用于检测各种蛋白质成分。（2）抗体的检测：可用于检测细菌、病毒和寄生虫等感染后产生的抗体，例如间接凝集试验或明胶颗粒凝集试验用于检测抗人类免疫缺陷病毒（HIV）抗体以诊断艾滋病、乳胶凝集试验用于检测抗溶血素O等。 第四节自身红细胞凝集试验其基本原理是抗人O型红细胞的单克隆抗体能与任何种血型的红细胞结合，但不引起凝集反应，这种抗体与另一特异性抗体连接成的双功能抗体，可用于检测标本中的抗原；如与特异性抗原连接，则可用于检测标本中的抗体。这一试验与上述血凝试验的区别在于反应中的红细胞是未经致敏的受检者新鲜红细胞，因此反应中的标本为受检者的全血。自身红细胞凝集可用于HIV抗体、HBsAg的检测，灵敏度与间接血凝试验相仿。 第五节抗人球蛋白参与的血凝试验抗人球蛋白参与的血凝试验，称Coombs试验，是检测抗红细胞不完全抗体的一种很有用的方法。包括直接Coombs试验和间接Coombs试验，分别检测红细胞上的不完全抗体和游离在血清中的不完全抗体。Coombs试验除广泛应用于血液病的检测，如自身免疫性溶血性贫血、药物诱导的溶血、新生儿溶血症等。还可采用专一特异性的抗球蛋白的血清如抗IgG血清、抗IgA或抗IgM以及抗补体血清等，分析结合于红细胞上的不完全抗体的免疫球蛋白亚类。图18 Coombs试验（上图为直接试验，下图为间接试验）习题29 ABO血型鉴定最常采用的方法是A.正向间接凝集反应B.反向间接凝集反应C.玻片凝集法D.试管凝集法E.间接凝集抑制反应答疑编号500734050101正确答案C（属于直接凝集反应）习题30 外裴试验最常采用的方法是A.正向间接凝集反应B.反向间接凝集反应C.玻片凝集反应D.试管凝集法E.间接凝集抑制反应答疑编号500734050102正确答案D习题31 SPA协同凝集试验中的抗体类别是A.IgM B.IgG C.IgA D.IgE E.IgD 答疑编号500734050103正确答案B答案解析SPA协同凝集反应属于间接凝集反应，但所用载体既非天然红细胞，也非人工合成的聚合物颗粒，而是一种金黄色葡萄球菌。它的菌体细胞壁中含有A蛋白（SPA）。SPA具有与IgG的Fc段结合的特性，因此当这种葡萄球菌与IgG抗体连接时，就成为抗体致敏的颗粒载体。如与相应抗原接触，即出现反向间接凝集反应。 习题32 下列有关协同凝集试验中的叙述中，错误的是A.属于间接凝集反应B.以金黄色葡萄球菌作为颗粒性载体C.菌体的细胞壁中含有SPA，可与IgG特异性结合D.IgG通过其Fab段结合菌体E.主要应用于可溶性抗原的检出答疑编号500734050104正确答案D习题33-1 不能促使凝集现象出现的措施是A.增强溶液离子强度B.增加溶液的粘度C.增加蛋白质或电解质D.通过离心使复合物沉沉E.降低溶液离子强度答疑编号500734050105正确答案A答案解析除了A之外，其他措施均可促使凝集现象的出现。本题超出教材内容。习题33-2 凝集试验中，为促成凝集现象出现，可采用多种方法，但不包括A.增加溶液离子强度B.增加蛋白质或电解质C.增加溶液粘度D.用胰酶或神经胺酸酶处理E.离心使复合物沉淀答疑编号500734050106正确答案A习题34 IgG抗体难以直接与红细胞发生凝集反应的原因是IgG A.抗体亲和力不够B.分子量太小C.不能同时连接两个红细胞D.抗体分子数量太少E.特异性不强答疑编号500734050107正确答案B答案解析参与直接凝集反应的抗体主要是IgM抗体，它是五价的，分子量大；而IgG是二价的，分子量小。第六章沉淀反应本章考点1.概念2.液相内沉淀反应3.凝胶内沉淀反应4.免疫浊度法概念：沉淀反应是可溶性抗原与相应抗体在特定条件下特异性结合所出现的沉淀现象。第一节沉淀反应的特点 1.沉淀反应中的抗原多为蛋白质、多糖、血清、毒素等可溶性物质。2.沉淀反应分两个阶段，第一阶段为抗原抗体发生特异性结合，几秒到几十秒即可完成，出现可溶性小复合物，肉眼不可见；第二阶段为形成可见的免疫复合物，约需几十分钟到数小时才能完成。如沉淀线、沉淀环。图19 两种抗血清形成的沉淀带第二节液体内沉淀试验一、絮状沉淀试验 抗原抗体溶液在电解质的存在下结合，形成絮状沉淀物，这种絮状沉淀受抗原和抗体比例的直接影响，因此产生最适比例的测定方法，常见有：1.抗原稀释法：抗原进行一系列稀释与恒定浓度抗血清反应。2.抗体稀释法：抗体进行一系列稀释与恒定浓度抗原反应。3.为了保证抗原抗体在最适比例条件下进行反应，达到最大沉淀反应的效果，就必须对抗原和抗体最佳工作浓度做出选择。将上述我们讲过的抗原稀释法和抗体稀释法结合起来就是方阵滴定法，又称为棋盘格法。从上表中可以看出，Ab用1：40稀释时，Ag则应按1：320稀释；反之，Ag按1：160稀释，则Ab应按1：20稀释。又如在进行ELISA试验时，反应试剂多，其工作浓度不同对结果影响较大，因此必须对包被抗原（抗体）和酶标抗体（抗原）进行最佳工作浓度的滴定和选择，以达到最佳的测定条件，同样需要采用方阵滴定法进行实验找出抗原和抗体最佳稀释度。二、免疫浊度法免疫浊度法本质上属于液体内沉淀反应，其特点是将现代光学测量仪器、自动化检测系统和免疫沉淀反应相结合，可进行液体中微量抗原、抗体及小分子半抗原定量检测。（一）免疫浊度法原理当可溶性抗原与相应抗体在两者比例合适时，抗原抗体在特殊缓冲液中快速形成抗原抗体复合物，使反应液出现浊度，如形成的复合物增加，反应液的浊度随之增加，与一系列的标准品对照，即可计算出受检物的含量。按照仪器设计的不同分为透射比浊仪测定法和散射比浊仪测定法。测定方法又可分为速率法和终点法。1.免疫透射比浊法：根据郎伯-比尔（Lambert-Beer）定律，当光线通过抗原抗体反应系统时，由于溶液中存在抗原抗体复合物，光线被吸收。吸收的量和复合物的量成正比。利用透射比浊仪测量出由于反射、吸收或散射引起的入射光衰减，其浊度以吸光度A表示，A值反映了入射光与透射光的比率。C：溶液浓度K：常数或cdc：分子吸光系数d：光路长通常根据免疫比浊原理取多点（39点），按Y=a+bx+cx2+dx3的3次方取回归曲线进行定标，制定剂量-反应曲线。免疫透射比浊法快速，测量可进行自动化，常用于临床体液蛋白的检测。 2.免疫速率散射比浊法：图20-2 散射免疫浊度法及透射免疫浊度法示意图其原理是指一定波长的光通过溶液遇到抗原抗体复合物时，光线被折射，发生偏转。偏转角度可以从0-90，这种偏转的角度可因光线的波长和复合物大小不同而有所区别。散射光的强度与复合物的含量成正比，即待测抗原越多，形成的复合物也越多，散射光也越强。同时也和散射夹角成正比，和波长呈反比。测定方法有终点法和速率法两种。终点法是在抗原-抗体反应达到平衡时，即复合物形成后作用一定时间，通常是30-60min，复合物浊度不再受时间的影响，但又必须在聚合产生絮状沉淀之前进行浊度测定。速率法是在抗原抗体结合反应的过程中，在单位时间内两者结合的速度。速率法是测最大反应的速度，即反应达到顶峰时的峰值。抗原抗体结合反应在几十秒内得出结果，峰值的高低与抗原的量成正比，峰值出现的时间和抗体浓度、抗原抗体的亲和力直接相关。速率法的灵敏度和特异性都比终点法好。但是，必须指出的是对免疫浊度法存在难以克服的钩状效应。即在定量抗体中加入抗原量达到最佳比例时，形成的IC量最大，反应速度最快。如继续加入抗原，形成IC的量不但不再增加，反而减少；反之，在定量抗原中加入抗体，在抗体过量时也会产生同样的现象。这种后带（抗原过量）和前带（抗体过量），统称为钩状效应（hook effect）。钩状效应可以产生假象的弱阳性或假阴性结果。（二）与免疫浊度法测定密切相关的因素有：1.抗原与抗体的比例：理想状态是抗原与抗体比例合适全部结合，事实上有困难，根据Heidelberger曲线理论，反应液中保持抗体过量时，复合物随抗原量的增加递增至抗原与抗体两者比例最合适时达高峰，因此免疫浊度法中保持抗体过量；2.抗体的质量：应是特异性强、效价高、亲和力强、并使用R型抗血清； 3.抗原抗体反应的溶液：关键是pH及离子种类，通常用磷酸盐缓冲液作反应液；4.增浊剂的应用：通常用非离子型亲水剂，如聚乙二醇（PEG）、吐温-20等。第三节凝胶内沉淀试验 凝胶内沉淀试验是利用可溶性抗原和相应抗体在凝胶内扩散，形成浓度梯度，在抗原与抗体浓度比例恰当的位置形成肉眼可见的沉淀线或沉淀环。凝胶支持物的种类：凝胶支持物的种类有琼脂、琼脂糖、葡聚糖或聚丙烯酰胺凝胶等。不同分子量的物质在凝胶中扩散速度不同，藉此可用以识别不同待测物分子量的差别。1.单向扩散试验：琼脂内混入抗体，待测抗原从局部向琼脂内自由扩散，如抗原和相应抗体结合，则形成沉淀环。（1）试管法：将一定量的抗体混入0.7%琼脂糖溶液中，注入小试管内，上层加抗原溶液使待测抗原在凝胶中自由扩散，在抗原抗体比例恰当位置形成沉淀环。（2）平板法：是将抗体或抗血清混入0.9%琼脂糖内，未凝固前倾注成平板，然后在上打孔，将抗原加入孔中，放37让其自由扩散，2448h后可见孔周围出现沉淀环，测定环的直径或面积计算标本中待测抗原的浓度。有两种计算方法：1）Mancini曲线：适用大分子抗原的和长时间扩散（48h）的结果，沉淀环直径的平方与抗原浓度呈线性关系cd2=k。（其中c为抗原浓度，d为沉淀环直径，k为常数）上排为5个不同的参考：中、下排为病人标本，下排右2为一个异常标本（出现明显扩散环）2）Fahey曲线：适用于小分子抗原和较短时间扩散的结果处理，用半对数纸划线，浓度对数与扩散环直径呈线性关系log cd=k。（其中c为抗原浓度，d为沉淀环直径，k为常数）单向扩散试验检测时的注意点：1）抗血清必须特异性强、效价高、亲和力强，在良好条件下保存。2）每次测定都必须作标准曲线。3）每次测定时必须用质控血清作质控。4）注意双环现象（出现了两种抗原性相同成分）。5）应用单克隆抗体测量多态性抗原时，测定值偏低；用多克隆抗体测量单克隆病时，测定值偏高。2.双向扩散试验：在琼脂内抗原和抗体各自向对方扩散，在最恰当的比例处形成抗原抗体沉淀线，根据沉淀线的位置、形状以及对比关系，可对抗原或抗体作出定性分析。双向扩散试验也分为试管法和平板法。（1）试管法：在含有抗原的溶液和含有抗体琼脂中间，加一层普通琼脂，让下层抗体和上层抗原向中间自由扩散，在抗原、抗体浓度最适时形成沉淀线。（2）平板法：是在琼脂板上相距35mm打一对孔，或者梅花孔、双排孔、三角孔等。在相应孔中加入抗原或抗体，待其自由扩散后，抗原、抗体形成可见的沉淀线。根据沉淀线的位置可作如下分析：抗原、抗体是否存在及其相对含量。一般沉淀线靠近抗原孔，提示抗体量大，沉淀线靠近抗体孔，提示抗原量大。抗原、抗体相对分子量的分析；抗原或抗体在琼脂内自由扩散，其速度受分子量影响。分子量小者，扩散快，反之较慢。由于慢者扩散圈小，局部浓度较大，形成沉淀线弯向分子量大的一方。如若两者分子量相等，则形