（茶学专业论文）施肥对藤茶品质的影响及其主要活性成分黄酮的提取、纯化研究.pdf

i i t llli ll l i ii lll ul1 11 y 1812 5 7 5 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 跹 如需保密 解密时间们口号年7 月 日 是否保密 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果 尽我所知 除了文中特别加以标注和致谢的地方外 论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果 也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料 指导教师对此进行了审定 与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明 并表示了谢意 研究生签名 磊密谈 时间 习年 月加日 学位论文使用授权书 本人完全了解 华中农业大学关于保存 使用学位论文的规定 即学生必须按 照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本 学校有权保存提交论文的印刷版和电 子版 并提供目录检索和阅览服务 可以采用影印 缩印或扫描等复制手段保存 汇 编学位论文 本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表 传播学位论 文的全部或部分内容 注 保密学位论文在解密后适用于本授权书 学位论文作者签名 彦痿波 导师鲐p 辱移落 签名日期 砷年 月2 日签名日期 叫0 7 年乡月沙日 注 请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 施肥对藤茶品质的影响及j e 主要活性成分黄酮的提取 纯化研究 目录 摘要 1 a b s t r a c t 第一章文献综述 5 1 藤茶的研究进展 一5 1 1 藤茶的栽培管理 5 1 2 藤茶基本化学成分的种类与含量 5 1 3 藤茶黄酮的研究 6 1 4 藤茶的开发利用 7 2 黄酮类化合物的研究现状 8 2 1 黄酮类化合物提取工艺的研究 8 2 1 1 热水提取法 8 2 1 2 有机溶剂提取法 8 2 1 3 碱液提取法 8 2 1 4 微波萃取法 9 2 1 5 超声波提取法 9 2 1 6 酶法提取 9 2 1 7 超临界c 0 2 萃取法 9 2 2 黄酮类化合物的分离纯化方法的研究 一1 0 2 2 1 胶束动电毛细管电泳 m e k c 法 1 0 2 2 2 聚酰胺薄层色谱法 1 0 2 2 3 硅胶柱层析法 l0 2 2 4 高效液相色谱 1 0 2 2 5 大孔树脂吸附法 10 2 3 黄酮类化合物的资源开发 1 2 2 3 1 止咳平喘药 1 2 2 3 2 抗心血管病药物 1 2 2 3 3 抗肝脏毒药物 1 2 2 3 4 天然抗氧化剂 1 2 2 3 5 无公害农药 1 2 3 课题研究的目的和意义 1 2 华中农业大学2 0 0 7 届硕 学位论文 第二章施肥条件对藤茶品质成分的影响 1 5 1 引言 15 2 材料与方法 1 5 2 1 试剂与仪器设备 1 5 2 1 1 主要试剂 1 5 2 1 2 主要设备与仪器 1 6 2 2 实验方法 1 6 2 2 1 试验设计 1 6 2 2 2 取样 17 2 3 分析方法 1 7 2 4 数据处理 17 3 结果与分析 1 7 3 1 不同类型肥料对藤茶黄酮 多酚类化合物的影响 1 7 3 2 不同类型肥料对藤茶中其它品质成分的影响 一1 8 3 2 1 不同类型肥料对藤茶可溶性蛋白质和氨基酸含量的影响 1 8 3 2 2 不同类型肥料对藤茶中可溶性糖含量的影响 1 9 3 2 3 不同类型肥料对藤茶中水浸出物含量的影响 2 0 3 2 4 不同类型的肥料对藤茶中矿质元素的含量的影响 2 0 4 讨论 2 l 4 1 不同施肥类型对藤茶黄酮 多酚含量的影响 2 l 4 2 不同施肥类型对藤茶矿质元素含量的影响 2 1 5 结论 2 2 第三章藤茶中黄酮类化合物提取工艺的研究 2 5 1 引言 2 5 2 材料与方法 2 5 2 1 试剂与仪器设备 2 5 2 1 1 主要试剂 2 5 2 1 2 主要设备与仪器 2 5 2 2 藤茶原料 2 6 2 3 实验方法 2 6 2 3 1 单因素试验 2 6 i i 施肥对藤茶品质的影响及j e 主要活性成分黄酮的提取 纯化研究 2 3 2 二次回归正交旋转组合实验设计 2 7 2 3 3 分析方法 2 7 2 3 4 数据统计分析 2 7 3 结果与分析 2 7 3 1 单因素试验结果 2 7 3 1 1 不同浸提溶剂对黄酮的影响 2 7 3 1 2 乙醇浓度的选择 2 8 3 1 3 浸提温度的选择 2 8 3 1 4 浸提时间的选择 2 9 3 1 5 料液比的选择 2 9 3 1 6 浸提次数的选择 3 0 3 2 正交试验结果 3 0 3 2 1 藤茶黄酮提取工艺回归模型的建立与检验 3 0 3 2 2 藤茶黄酮提取工艺的优化 3 3 3 2 3 双因素交互作用对浸提液中黄酮含量的影响 3 3 4 讨论 3 4 5 结论 3 5 第四章藤茶中黄酮类化合物分离纯化工艺的优化 3 6 1 引言 3 6 2 材料与方法 一3 6 2 1 实验材料 3 6 2 2 主要试剂 一3 7 2 3 主要设备 3 7 2 4 实验方法 3 8 2 4 1 大孔吸附树脂试验方法 3 8 2 4 2 黄酮的s e p h a d e xl h 2 0 分离纯化 3 9 2 5 分析方法 3 9 2 5 1 黄酮含量 3 9 2 5 2 高效液相色谱分析实验 4 0 2 6 数据处理 4 0 3 结果与分析 4 0 i i i 华中农业大学2 0 0 7 届顾f 二学位论文 3 1 静态试验结果 4 0 3 2 动态试验结果 4 l 3 2 1 乙醇浓度的选择 4 1 3 2 2 洗脱流速的选择 4 2 3 2 3 供试液浓度的选择 4 3 3 2 4 供试液体积的选择 4 4 4 4 4 5 4 5 4 5 4 6 4 7 5 3 施肥对藤茶品质的影响及j e 主要活性成分黄酮的提取 纯化研究 摘要 藤茶 a m p e l o p s i sg r o s s e d e n t a t aw t w a n g 是葡萄科蛇葡萄属的一种藤本植物 广泛分布于我国长江流域以南等省区 是我国民间一茶用 药用植物 富含二氢杨 梅素等黄酮类物质 我国壮族和瑶族人民将其幼嫩茎叶制成保健茶 用于治疗感冒 发热 咽喉肿痛 黄疸型肝炎等症 有关藤茶的研究主要集中在藤茶活性成分的分 离鉴定及黄酮的功能活性等方面 本文首次探讨了施肥条件对藤茶黄酮等主要品质 成分的影响 采用二次正交旋转组合设计法研究了藤茶主要活性成分黄酮的提取条 件 筛选了利用大孔吸附树脂纯化藤茶黄酮的分离纯化条件以及葡聚糖凝胶对藤茶 黄酮的纯化效果 以期为藤茶的开发应用提供理论基础 1 施肥条件对藤茶品质成分的影响 采用田间随机区组试验设计 研究了氮肥 磷肥 钾肥 复合肥 农家肥5 种 肥料对藤茶黄酮等主要品质成分的影响 结果表明 不同类型的肥料对藤茶中黄酮 多酚类物质 氨基酸 可溶性糖 可溶性蛋白质 水浸出物以及矿质元素的含量的 影响均达到显著水平 施磷 钾肥的藤茶中黄酮 多酚 可溶性糖及水浸出物的含 量增加显著 c a m g c u z n 等矿质元素也显著提高 施用氮肥有利于藤茶中可 溶性蛋白质 氨基酸及水浸出物含量的提高 复合肥有利于藤茶中c a m g z n f e 等矿质元素的积累 2 黄酮类化合物的提取条件的优化 在单因素试验的基础上 采用二次回归正交旋转组合设计方法研究了温度 时 间 料液比 乙醇浓度对藤茶黄酮提取率的影响 结果表明 温度 时间 料液比 极显著影响藤茶黄酮的提取率 建立的回归模型显著性检验达极显著水平 回归模 型的预测值与实测值能较好地拟合 确定藤茶黄酮的最佳浸提条件 提取温度为7 7 5 乙醇浓度6 5 料液比l 4 0 浸提时间9 0 m i n 3 黄酮类化合物的分离纯化工艺的优化 选用1 1 种大孔吸附树脂对藤茶黄酮进行了静态吸附与解吸附试验 结果表明 1 号树脂适宜于藤茶黄酮的分离纯化 对黄酮的吸附量为4 1 1 2 m g g 解吸率为 华中农业人学2 0 0 7 届硕j 二学位论文 9 2 1 2 通过动态吸附试验对1 号树脂有关参数进行了优化 结果表明 黄酮上样 浓度6 7 m g m l 上样体积为柱体积的l 3 流速1 8 m l m i n 用9 5 的乙醇进行洗 脱 可达到较好的洗脱与纯化效果 黄酮的洗脱率可达9 0 左右 洗脱出的黄酮纯 度达6 5 左右 进一步利用s e p h a d e xl h 2 0 层析柱进行分离纯化 制得的黄酮纯度 达7 4 4 0 二氢杨梅素含量达6 7 1 2 关键词 藤茶 施肥 品质 黄酮 提取 纯化 2 a b s t r a c t t e n g c h a a m p e l o p s i sg r o s s e d e n t a t aw t w a n g b e l o n g s t o a m p e l o p s i sm i c h xo f v i t a c e a e i ti sg r o w na b r o a di nt h es o u t ho ft h ey a n g t z er i v e r i t su s e df o rd r i n k i n ga n d d r u ga m o n gt h ep e o p l e w h i c hc o n t a i n sr i c hf l a v o n e s s u c ha sd i h y d r o m y r i c e t i n d m y t h et e n d e rs t e m sa n dl e a v e so ft e n g c h ah a v eb e e nm a d ei n t oa h e a l t h yd r i n kw h i c hi s c a l l e d m y s t i ct e a f o rt r e a t i n gr h e u m f e v e r g a l lo ff a u c e s h e p a t i t i sa n ds oo n w i t ha l o n gh i s t o r yo fs e v e r a lh u n d r e dy e a r sa m o n gy a oa n dz h u a n gn a t i o n a l i t yi nc h i n a m u c ha t t e n t i o no nt e n g c h af o c u s e do ni d e n t i f i c a t i o no fa c t i v ec o n s t i t u e n t sa n d b i o l o g i c a la c t i v i t i e so ff l a v o n e si nr e c e n ty e a r s i nt h i ss t u d y t h ee f f e c t so ff e r t i l i z a t i o nf o r t e n g c h a sm a i nb i o c h e m i c a lc o m p o n e n t ss u c ha sf l a v o n e sw e r es t u d i e d m e a n w h i l e t h e c o n d i t i o n so fe x t r a c t i o nb ym e a n so fq u a t e m i o n s q u a r er e g r e s s i o n r o t a t i o no r t h o g o n a l e x p e r i m e n t a ld e s i g n a n dp u r i f i c a t i o nw i t hr e s i n sa n ds e p h a d e xl h 2 0w e r er e p o r t e d 1 t h ee f f e c to ff e r t i l i z a t i o nf o rt e n g c h a sq u a l i t y w i t ht h es t o c h a s t i ca r e ae x p e r i m e n ti nt h ef i e l d sd e s i g n t h ee f f e c t so f5k i n d so f f e r t i l i z e r s n i t r o g e nf e r t i l i z e r p h o s p h a t ef e r t i l i z e r p o t a s s i u mf e r t i l i z e r c o m p o u n d f e r t i l i z e ra n df a r m y a r dm a n u r e o nt h ec o n t e n t so ft e n g c h a sm a i n b i o c h e m i s t r y c o m p o n e n t ss u c ha sf l a v o n e sw e r es t u d i e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ed i f f e r e n tk i n d so f f e r t i l i z e r sh a ds i g n i f i c a n te f f e c t so nt h ec o n t e n t so f f l a v o n e p o l y p h e n o l s a m i n oa c i d s s o l u b l es u g a r s o l u b l ep r o t e i n w a t e re x t r a c t i o na n dm i n e r a le l e m e n t so ft e n g c h a t h e c o n t e n t so ff l a v o n e s p o l y p h e n o l s s o l u b l es u g a r w a t e re x t r a c t i o na n de l e m e n t so fc a m g c u z no ft e n g c h af e r t i l i z e dw i t hp h o s p h a t ef e r t i l i z e ra n dp o t a s s i u mf e r t i l i z e rw e r e m o r et h a nt h ec o n t r o l sa n do t h e r s n i t r o g e nf e r t i l i z e rw a sp r o p i t i o u st oi n c r e a s et h e c o n t e n t so fs o l u b l ep r o t e i n a m i n oa c i d sa n dw a t e re x t r a c t i o no f t e n g c h a i na d d i t i o n c o m p o u n df e r t i l i z e rw a sg o o dt oa c c u m u l a t et h ec o n t e n t so fm i n e r a le l e m e n t sc a m g c u z n 2 t h ee x t r a c t i o nc o n d i t i o n so ff l a v o n e so nt e n g c h a t h ee f f e c t so fe x t r a c t i n gt e m p e r a t u r e t i m e t h er a t i oo ft e n g c h aa n dw a t e r e t h a n o l c o n s i s t e n c yo nt h ee x t r a c t i n gr a t e so ff l a v o n e sw e r es t u d i e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e f a c t o r so ft e m p e r a t u r e t i m e t h er a t i oo ft e n g c h aa n dw a t e rh a ds i g n i f i c a n te f f e c t so n e x t r a c t i o n so ff l a v o n e s t h em o d e lo fr e g r e s s i o no ff l a v o n e s e x t r a c t i n gr a t ew a s s t a t i s t i c a l l ys i g n i f i c a n ta tl l e v e la n dw a sa p p r o p r i a t et oe x p r e s sr e s p o n s ev a r i a b l e s c o n s i d e r i n gh i g he x t r a c t i n gr a t e t h eb e t t e rv a r i a b l el e v e l sw e r e6 5 e t h a n o lc o n s i s t e n c y 7 7 5 ct e m p e r a t u r e 9 0 m i nh e a t i n gt i m e l 4 0r a t i oo f t e n g c h aa n dw a t e r 3 华中农业人学2 0 0 7 屈硕j 学位论文 3 p u r i f i c a t i o no ff l a v o n e so nt e n g c h a e x p e f i m e m so f11k i n d so fm a c r o p o r o u sa d s o r b i n gr e s i n sa d s o r b i n ga n dd e s o r b i n g f l a v o n e si n d i c a t e dt h a tn o 1w a so n eo ft h em o s ta p p r o p r i a t er e s i n si na l lf o rp r e l i m i n a r y p u r i f i c a t i o no ff l a v o n e s i t sa d s o r b i n gc a p a c i t y w a s41 12 m g g d e s o r b i n gr a t ew a s 9 2 1 2 i nt h ec o l u m no fn o 1 t h eo p t i m u mc o n d i t i o n sw e r et h a tt h ec o n c e n t r a t i o no f c r u d ef l a v o n e sw a s6 7 m g m l t h ev o l u m eo fs a m p l ew a s1 3t h a to fc o l u m n f l o w i n g v e l o c i t yw a s1 8 m l m i n e l u t i n gs o l u t i o nw a s9 5 e t h a n o l w h i c hl e dt o6 5 p u r i t yo f t h e f l a v o n e sa n d9 0 d e s o r b i n gr a t eo ff l a v o n e s t h ep u r i t yo ff l a v o n e sw i t hf u r t h e r p u r i f i c a t i o nb ys e p h a d e xl h 2 0w a s7 4 4 0 a n dt h ec o n t e n to fd m y w a s6 7 12 k e y w o r d s t e n g c h a f e r t i l i z a t i o n q u a l i t y f l a v o n e s e x t r a c t i o n p u r i f i c a t i o n 4 藤茶 系葡萄科 v i t a c e a em i c h x 蛇葡萄属 a m p e l o p s i s 显齿蛇葡萄 学名为 a m p e l o p s i s g r o s s e d e n t a t a 彤z 肠馏 广泛分布于我国长江流域以南的广西 广东 云 南 贵州 湖南 湖北 江西及福建等省区 在民间俗称山甜茶 白茶 甘露茶 白毛猴 白茶等 王文采 1 9 7 9 中国科学院植物研究所 1 9 8 3 藤茶具有清热 解毒 祛风湿 强筋骨 消炎 抑菌 止咳 祛痰 镇痛 保肝 消脂 降血糖 抗高血压 消除自由基和增强免疫力等药理作用 莫国艳 2 0 0 3 y a b ee ta 1 1 9 9 7 民间常用于治疗感冒发热 咽喉肿痛 黄疸型肝炎 疱疖等症 广西植物研究所 1 9 9 4 王文采 1 9 7 9 中国科学院植物研究所 1 9 8 3 中草药汇编 1 9 9 7 是我国 长期使用的一种茶用 药用植物 1 1 藤茶的栽培管理 藤茶主要呈野生状态分布 多生长在海拔2 0 0 一1 3 0 0 m 的山地灌木丛中 呈匍 匐状态攀岩在杂木 灌木表面 中国科学院植物研究所 1 9 8 3 据不完全统计 全 国野生藤茶分布的面积大约3 0 0 多万亩 上世纪9 0 年代初期 湖南吴应邦等人开始 对显齿蛇葡萄进行小面积人工栽培试验 郑道君 刘国民 2 0 0 6 宋纬文等 1 9 9 7 以细砂或细土作为苗床 以三年生野生枝条带2 3 个节的插穗进行扦插育苗试验 并获得了成功 并简单介绍了扦插苗的田间管理技术 刘国民2 0 0 2 年从湖南通道侗 族自治县和湖南江华瑶族自治县引进野生藤茶的藤蔓至海口地区进行扦插育苗和人 工栽培试验 并取得初步成功 郑道君 刘国民 2 0 0 6 易诚等 2 0 0 3 使用不同 浓度的萘乙酸 n a a 吲哚乙酸 i a a 吲哚丁酸 i b a 生根粉 a b t 等生 长调节物质在不同的基质进行扦插育苗试验 为藤茶种苗的规模化生产提供了可能 郑小江等 2 0 0 4 从鄂西地区生长的显齿蛇葡萄植株中选育出了优良无性系 绿凤 品种 为藤茶的人工栽培奠定了基础 目前在湖北 湖南等地已有大面积的人工栽 培藤茶园 有关藤茶的栽培管理技术都处在摸索阶段 还没有相关的研究报道 施 肥技术对藤茶品质的影响也未见相关报道 一些藤茶栽培区主要参考茶树的施肥情 况或凭经验进行施肥 无科学依据 1 2 藤茶基本化学成分的种类与含量 为了很好地开发藤茶 许多学者对其化学成份进行了比较系统地研究 目前 已从其中分离出了数1 0 种化合物 且各种营养成份都已基本清楚 据分析 薛慧 2 0 0 4 张友胜等 2 0 0 1 在藤茶中 粗蛋白含量1 3 9 4 水溶性蛋白质含量0 5 5 华中农业大学2 0 0 7 届硕f 学位论文 氨基酸总含量2 3 含有1 7 种氨基酸 其中包含人体必需的8 种氨基酸和y 一氨基 丁酸 蛋氨酸等特殊氨基酸 总灰分6 0 总多酚1 8 5 无机营养元素如f e c u z n m g s e n a f 及i 的含量比常用绿茶高 熊皓平等 2 0 0 4 分析了不同季节 藤茶幼嫩茎叶主要化学成分的含量 表明 其春 夏幼嫩茎叶的水浸出物含量高 接 近5 0 水溶性糖含量约为1 0 氨基酸含量约为5 多酚类化合物含量约为2 0 黄酮类化合物含量在4 1 2 左右 其中双氢杨梅树皮素含量在3 0 左右 自周天达首次从显齿蛇葡萄中分离鉴定出二氢杨梅素 杨梅素两种物质后 有 关藤茶成分的分离鉴定工作进一步深入 周天达 周雪仙 1 9 9 6 张友胜等先后从 藤茶中分离出槲皮素 槲皮素葡萄糖甙 花旗松素 洋芹素 藤茶甙和藤茶素 杨 梅黄素 杨梅甙等黄酮类物质以及龙涎香醇 b 一谷甾醇 棕榈酸 p 一谷甾醇 大 黄素 没食子酸甲酯等化合物 张友胜等 2 0 0 3 王定勇 许素英 1 9 9 9 王定勇 1 9 9 9 q i z h e nd u 2 0 0 4 采用高速逆流色谱 h s c c c 溶剂系统为 正己烷一乙 酸乙酯一甲醇一水 1 6 1 5 7 5 v v 分离出2 种黄酮苷5 7 一羟基一3 4 5 一三羟基黄酮一3 一o 一6 一鼠李糖和5 7 一羟基一3 4 一二羟基黄酮一3 一o 一6 一 鼠李糖 符史良等 2 0 0 4 从藤茶乙醇萃取物中分离出4 0 个组分挥发性化学成份 鉴定出其中3 4 种化合物 主要为酚类和酯类化合物 此外 王华夫等 1 9 9 6 从藤 茶中分离并鉴定出2 8 种香气成份 占香精油总量的6 4 张友胜等 2 0 0 1 从藤茶 春季和夏季幼嫩茎叶分别鉴定出2 6 和1 7 种挥发油化合物 其春季样 夏季样的挥 发油成分差别大 其中仅有7 种成分相同 但该7 种成分占较大比例 尤其是叶绿 醇 正十六酸和雪松醇占主要地位 1 3 藤茶黄酮的研究 黄酮类化合物为藤茶的主要成份 也是藤茶的主要有效成份 因此 近年对藤 茶化学成份的研究主要集中于黄酮类化合物方面 藤茶黄酮成分以二氢杨梅素 杨 梅素为主 有研究表明 藤茶叶片中双氢杨梅素的含量最高 高于茎的3 4 倍 茎 中含量次之 根中最低 而叶中以老叶最高 5 月份的藤茶叶以双氢杨梅素含量最 高 达2 7 8 一3 1 2 何桂霞等 2 0 0 4 覃洁萍等 2 0 0 2 魏捷 2 0 0 2 不少学者还对其提制工艺进行了研究 由于藤茶黄酮大多溶于水 低碳醇等极 性溶剂 因此 藤茶黄酮及二氢杨梅素的提取大多采用水提 醇提 再重结晶的方 法 王岩等 2 0 0 2 采用l 9 3 4 正交实验法初步研究了乙醇浓度 乙醇用量 提取 时间和提取次数4 个因素对蛇葡萄素提取率的影响 结果选用8 0 乙醇 乙醇用量 为药材量的1 0 倍 加热回流2 次 每次6 0 m i n 为最佳方案 李卫等 2 0 0 4 则利用 逆流法提取二氢杨梅素 通过对提取温度 料液比 p h 时间等因素的研究 优化 出沸水提取 料液比l 1 0 提取时间6 0 m i n 用偏碱性水溶液提取的分离条件 得 6 施肥对藤茶品质的影响及其主要活件成分黄酮的提取 纯化研究 到较好效果 赖力等 1 9 9 5 采用甲醇回流提取 浓缩至有白色沉淀 加入适量水 用氯仿萃取 萃取液浓缩至干 用甲醇和水加活性炭反复重结晶 得二氢杨梅素 收率为1 0 覃洁萍等 2 0 0 0 对藤茶中黄酮类成分提取工艺进行初步探讨 表明 采用水煎煮 冷却结晶 结晶再经丙酮 乙醇回流提取 再用水重结晶 可得n 氢杨梅素 杨梅素2 种晶体 平均收率可达1 9 6 和0 5 1 杨铃等 2 0 0 5 采用 微波萃取二氢杨梅素正交实验优选出最佳提取工艺条件 成凤桂和欧知义 2 0 0 5 分别以甲醇 乙醇和水作提取剂 比较3 者的黄酮提取率 还讨论了在不同温度 时间 体积比的条件下 以水作提取剂 对总黄酮提取得率的影响 张友胜等 2 0 0 2 进一步采用 增温溶解 保温过柱 温水解吸 法从显齿蛇 葡萄中提纯二氢杨梅素 分析了温度 料液浓度 过柱速度 解吸柱水流速度等影 响因素 经此法后再重结晶的二氢杨梅素可达到较高纯度要求 q i z h e nd u 等 2 0 0 2 采用高速逆流色谱和高效液相色谱联合法分离纯化的二氢 杨梅素纯度可达9 9 以上 1 4 藤茶的开发利用 挚 有关藤茶的研究近年来多集中于化学成分及药理功能等方面 而应用性研究则 相对较少 现在尚处于藤茶开发利用的初级阶段 目前藤茶的开发利用主要以传统 的饮用为主 还有部分深加工的产品 目前藤茶的开发利用主要以原料经初加工后直接冲泡饮用的形式为主 传统的 加工工艺较简单 大多为 鲜茎叶洗净一沸水潦烫 揉捻 捣碎 成形 晒 干或烘干 宋纬文 1 9 9 6 生产的产品往往 青气 重 汤色浑浊 滋味粗涩 消 费者难以接受 为改善藤茶的香气和滋味品质 陈加勇等人 2 0 0 0 曾将藤茶和红 茶 绿茶进行拼配 但未从本质上改善藤茶的品质 也有将藤茶加工成复方藤茶 即在藤茶中添加山楂 甘草 罗汉果 胖大海 桑椹 桔梗 荷叶 酸枣仁 薄荷 人参 芦荟 车前草等 以达到营养 保健的目的 杨英雄等 2 0 0 5 潘利华等 2 0 0 5 为克服藤茶因其味微苦而后回甜这一缺陷 经过多次试验 发现随着叶 茎比增大 苦味逐渐递减 口感变好 最后确定叶 茎的最佳配比为l 5 他们还提出了2 个 比较理想的藤茶饮料配方 由不同配比的花椒 薄荷 甘草为配料制备的新配方藤 茶调整了口味 提高了产品质量 增强了保健功能 有关藤茶的深加工及综合利用方面研究也有少量的报道 张雁以功能性甜味剂 和食品凝胶剂为载体 引入显齿蛇葡萄提取液 通过合理的制作工艺 制成了低热 量 具有保健功能的显齿蛇葡萄果冻和藤茶含片 张雁 2 0 0 2 2 0 0 4 赵宝忠 2 0 0 1 选用苦丁茶 藤茶为主要原料 重量比例为苦丁茶3 8 份 藤茶2 7 份 加工制 成苦保降脂胶囊 黄宏全 1 9 9 8 也以藤茶为原料制成茅岩莓消炎制剂 7 华中农业人学2 0 0 7 届硕i 学位论文 2 黄酮类化合物的研究现状 黄酮类化合物 f l a v o n e s 是植物经光合作用产生的一大类化合物 其结构母核是 以c 6 3 c 6 为骨架的2 一苯基色原酮 它的存在形式有2 种 一种是游离的苷元 另一种是与糖等结合的苷 宛晓春主编 1 9 7 9 黄酮类化合物在植物界分布很广 泛 如银杏叶 山楂 沙棘 蔷薇果 枸杞 杜仲 茶叶 藤茶等 目前国际上对黄酮类化合物的研究开发十分活跃 其产品的种类很多 而且相 继开发出天保宁 银杏叶片 银杏叶袋泡茶 山植叶冲剂 黄酮类口香糖 黄酮类 牙膏等多种药品和保健品 所以对黄酮提取分离纯化等工艺的研究意义重大 2 1 黄酮类化合物提取工艺的研究 黄酮类化合物的提取工艺主要有以下几种 热水提取法 有机溶剂提取法 碱 液提取法 微波萃取法 超声波法 酶解法和超临界c 0 2 萃取法等 2 1 1 热水提取法 陈海光 2 0 0 2 从荷叶中提取黄酮时 采用提取水量3 0 倍 提取温度8 0 提 取时间为1 5 h 可得较好浸提结果 此工艺成本低 安全 适合工业化大生产 但 由于水的极性大 易把蛋白质 糖类等溶于水的成分浸提出来 从而使提取液存放 时 易腐败变质 为后续的分离带来困难 2 1 2 有机溶剂提取法 利用黄酮类化合物与混入的杂质极性不同 选用不同的溶剂萃取可达到精制纯 化目的 有机溶剂提取法是目前国内使用最广泛的方法 常用的有机溶剂有甲醇 乙醇 丙酮等 但由于甲醇 丙酮等的毒性较大 因此一般采取乙醇为提取溶剂 可用冷浸或加热抽提法提取 醇的浓度在6 0 9 5 之间 提取次数一般为2 4 次 毛莉娟 2 0 0 2 采用乙醇对苦丁茶中的黄酮浸提时发现 当乙醇浓度为7 0 乙醇 用量为1 0 倍于苦丁茶质量 浸提时间为4 h 提取温度为7 0 7 5 时 得到的总黄 酮含量最高 王岩等 2 0 0 2 采用正交实验法确定了藤茶中总黄酮提取的最佳方案 8 0 的乙醇作提取剂 按l 1 0 的固液比 加热回流2 次 每次提取6 0 m i n 2 1 3 碱液提取法 黄酮类化合物分子中多有酚羟基 显酸性 可用碱性溶液提取 碱液提取时 所用碱的浓度不宜过高 以免在强碱条件下加热破坏黄酮类化合物的母核 当有邻 二酚羟基时可加硼酸保护 张彬等 2 0 0 5 张永煜等 1 9 9 9 根据葛根黄酮结构 中酚羟基易溶于碱水的性质 应用饱和c a o h 2 水溶液作提取剂 分别以8 倍量提取1 次及6 倍量提取2 次 将提取液调p h 值为5 减压浓缩后得总黄酮 施肥对藤茶品质的影响及j e 主要活性成分黄酮的提取 纯化研究 2 1 4 微波萃取法 微波技术在人们的生产生活中应用越来越广泛 微波萃取的机理可从两方面考 虑 一方面微波辐照过程是微波射线自由透过透明的萃取介质 到达生物材料的内 部维管束和腺胞系统 使物料内部温度突然升高 而发生细胞破裂 位于细胞内的 有效成分从细胞壁周围自由流出 传递转移至萃取介质周围 被萃取介质捕获并溶 解于其中 过滤分离残渣 即得萃取物 另一方面 微波所产生的电磁场加速被萃 取组分由物料内部向萃取溶剂界面的扩散速率 缩短萃取组分的分子由物料内部扩 散到萃取溶剂界面的时间 从而提高萃取速率 刘忠英等 2 0 0 4 利用微波辅助提 取法提取刺五加中的黄酮类化合物 通过正交实验考察了微波提取条件 结果表明 用5 0 乙醇为溶剂 提取压力为7 0 0 k p a 提取时间为l o m i n 料液比为l 2 0 时黄酮 提取率最佳 且与索氏提取法相比 提取率可提高4 0 2 1 5 超声波提取法 用超声波法提取黄酮类物质 是目前比较新的方法 其利用产生的冲击波和射 流破坏植物细胞和细胞膜结构 增加细胞内容物通过细胞膜的穿透能力 有助于黄 酮类化合物的释放与溶出 这种方法缩短了提取时间 提高了有效成分的提出率和 原料的利用率 杨梅叶中提取总黄酮类化合物 用料液比为1 4 5 的4 0 乙醇中浸泡 2 4 h 然后用超声波提取4 5 m i n 连续提取2 次 黄酮的浸出率可达9 9 3 而用醇提 法黄酮的浸出率仅为7 3 胡静丽 2 0 0 3 2 1 6 酶法提取 对于一些黄酮类物质被细胞壁包围不易提取的原料可以采用酶法提取 此提取 原理是复合酶充分破坏了以纤维素为主的细胞壁结构及其细胞间相连的果胶物质 将原料中的果胶完全分解成小分子物质 使提取传质阻力减小 使其中的黄酮类物 质充分地释放出来 吴梅林等 2 0 0 4 研究了纤维素酶酶解法提取银杏总黄酮的工 艺 发现与传统的乙醇提取工艺相比 总黄酮得率提高了1 8 9 2 2 1 7 超临界c 0 萃取法 超临界c 0 2 萃取技术是9 0 年代国际最新的高科技项目 该技术是以液态c 0 2 为溶剂进行提取的 是一种不同于传统黄酮类物质提取的新工艺 它的提取率与提 取温度 提取压力 c 0 2 消耗量等因素有关 它既有与气体相当的高渗透能力和低 的粘度 又具有与液体相近的密度和对物质优良的溶解能力 谭天伟 2 0 0 3 该 技术的主要特点是提取率高 产品不含有害物质 无污染 影响超临界c 0 2 萃取的因素很多 如超临界流体的选择 夹带剂的选择 压力 温度 料液比 时间和流体的流量等 雍技等 2 0 0 5 李秋红等 2 0 0 6 采用超 临界c 0 2 萃取杜仲叶总黄酮 确定了最佳工艺条件 温度为4 5 c 时间为2 5 h 压 力为3 0 m p a 夹带剂用量为3 5 m l g 黄酮提取率达7 3 2 6 9 华中农业大学2 0 0 7 届硕 学位论文 2 2 黄酮类化合物的分离纯化方法的研究 黄酮类化合物的分离纯化方法很多 有柱层析 薄层层析 铅盐沉淀 硼酸络 合 p h 梯度萃取 溶剂萃取以及近年来应用的高效液相色谱 h p l c 液滴逆流层 析 d c c c 气相层析 微乳薄层色谱等 而目前采用较多 技术较成熟且具有广 阔市场应用前景的主要有柱层析和高效液相色谱 h p l c 2 2 1 胶束动电毛细管电泳 m e k c 法 m e k c 法是一种将胶束增溶和电动移动结合起来的新型色谱方法 其操作简便 分析速度快 高效低耗 抗污染 抗干扰能力强等 t i n g f u j i a n g 等 2 0 0 4 报导了 胶束动电毛细管电泳 m e k c 法分离鉴定紫花泡桐花中的3 种黄酮 d i p l a c o n e d i m i m u l o n e m i 和a p i g e n i n a p 分离最适电解液为2 0 m m 硼酸钠 1 0 m m 十二烷基 硫酸钠 s d s 和5 甲醇的缓冲溶液 p h 1 0 2 2 2 聚酰胺薄层色谱法 聚酰胺薄层色谱特别适合于分离鉴定有游离酚羟基的黄酮苷及苷元 随展开剂 的极性大小不同 黄酮类化合物有不同的色谱现象 可根据吸附平衡常数k 值的相 对大小理解这些现象 梁淑芳 2 0 0 3 研究了山楂 山里红 c r a t a e g u s p i n n a t i f i d a b g e v a r m a j o rn e b r 中黄酮类化合物新的薄层色谱分离鉴定方 法 以十二烷基硫酸钠一正丁醇一正庚烷一水微乳液为展开剂 利用聚酰胺薄层色 谱法能使山楂黄酮完全分离 从山楂叶中分离得到7 个黄酮斑点 山楂果中得到7 个黄酮斑点 但2 者不完全相同 2 2 3 硅胶柱层析法 硅胶薄层是目前分离与鉴定黄酮类化合物采用较多的一种方法 冯宝民等 2 0 0 1 采用硅胶柱层析分离 从瑞香狼毒根中分得4 个黄酮类化合物 2 2 4 高效液相色谱 自2 0 世纪7 0 年代以来 应用h p l c 技术已成功分离了大量的黄酮类化合物 随着新技术不断使用 新的柱子与流动相的研究 加上计算机系统的辅助 该方法 正在不断完善并将得到更广泛的应用 m k r a u z e b a r a n o w s k a 等 2 0 0 4 研究从一些 裸子植物树叶中使用反相高效液相色谱 h p l c 法分离多种黄酮类化合物 使用不同 的r p 一18 柱以及平放或倾斜的洗脱方式确定最佳分离条件 2 2 5 大孔树脂吸附法 大孔树脂是2 0 世纪6 0 年代末在凝胶型树脂的基础上发展起来的一类有机高分 子聚合物吸附剂 吸附作用的本质是吸附剂与吸附树脂分子间的范德华力 它是一 种不溶于酸 碱及有机溶剂 如乙醇 丙酮及烃类等 对氧 热 化学试剂稳定及 机械强度高的有机高分子聚合物 树脂内部具有三维空间立体孔结构 其孔隙度与 比表面积都比较大 1 0 施肥对藤茶品质的影响及其主要活性成分黄酬的提取 纯化研究 大孔树脂分为大孔离子交换树脂和大孔吸附树脂 一般认为 依靠物理界面力 作用引起溶液中溶质的浓度减少称为吸附 因化学作用引起溶液中溶质的变化称为 离子交换 汪茂田等主编 2 0 0 4 起离子交换与吸附作用的树脂分别称为离子交换 树脂和吸附树脂 大孔吸附树脂具有物化稳定性高 比表面积大 吸附选择性好 不受无机物存 在的影响 再生处理方便 吸附解吸条件温和 使用周期长 节省费用等优点 广 泛应用于物质的分离纯化 由于吸附树脂理化性质不同 不同型号的树脂对黄酮的 精制效果有较大的差异 陆志科等 2 0 0 3 选用6 种不同型号的树脂对竹叶黄酮的 吸附特性进行比较研究 结果表明 弱极性的a b 一8 树脂适宜竹叶黄酮的提取 分 离纯化枸杞叶总黄酮时用h p d l 0 0 型大孔树脂效果较好 雍晓静 2 0 0 5 银杏叶 黄酮的分离纯化采用d m 一1 3 0 型树脂具有较好的效果 卢锦花等 2 0 0 2 除树脂的类型外 溶剂的种类及浓度对纯化的效果也具有很大的影响 有研究 表明 李昀 2 0 0 0 d 一2 0 4 x d a 2 树脂吸附银杏叶黄酮后 用8 0 乙醇洗脱 效果最好 而d 一2 5 4 d 一1 1 3 则以9 5 乙醇洗脱效果最好 洗脱速度也是影响树脂吸附分离特性的一个重要因素 安彩贤等 2 0 0 4 用d 1 0 1 树脂分离纯化葛根与山楂叶中的总黄酮时 选取2 3 4 m l m i n3 个不同的洗脱速度 对洗脱率进行考察 结果表明 葛根黄酮洗脱率在洗脱速度为2 m l m i n 时最高 吸附量与被吸附物浓度的关系符合f r e n d i c h 和a n g m u r 经典吸附式 即被吸附 物浓度增加 吸附量也随之增加 但被吸附物浓度增加有一定的限度 不能超过其 吸附容量 在吸附容量不是很大的情况下 一般低浓度下进行吸附比较有利 郭永 学等 2 0 0 4 任顺成等 2 0 0 3 用a b 一8 树脂对玉米须总黄酮进行吸附和解吸效 果的研究 确定上样液浓度控制在0 5 0 8 m g m l 范围内较好 黄酮类化合物为多羟基酚类 呈弱酸性 因而要达到高效的吸附效果 需在弱 酸性或酸性条件下进行吸附 现已有许多关于这方面的研究 王冬梅等 2 0 0 3 利 用大孔吸附树脂对翅果油树叶中总黄酮进行了分离研究 考察了p h 值分别为2 3 4 5 时的吸附效果 结果p h 为4 时吸附容量最大 吸附过程为一放热过程 温度的变化对吸附效果的影响也很大 若温度过高 解吸速率加大 不利于吸附 而温度过低则有些吸附过程不能在短时间内达到平衡 所以应该保持适当的柱温 张友胜 2 0 0 2 采用 增温溶解 保温过柱 温水解吸 的方法对显齿蛇葡萄中的二氢杨梅素进行提制研究 结果表明 该方法的适宜温度 为5 0 7 0 最好为6 0 该方法能k 很z 好地将7 0 左右的二氢杨梅素提纯到8 0 当然影响大孔吸附树脂洗脱效果的因素还有很多 如被吸附化合物结构的影响 无机盐浓度的影响 树脂柱径高比的影响等 华中农业人学2 0 0 7 届硕 1 学位论文 2 3 黄酮类化合物的资源开发 2 3 1 止咳平喘药 8 0 年代我国研制的1 2 4 种防止气管炎的植物药中就有6 9 种主要成分是黄酮类化 合物 包括黄酮醇 双氢黄酮及其甙 大多是较好的消炎 止咳 平喘活性成分 2 3 2 抗心血管病药物 黄酮类化合物在防止心脑血管疾病方面发挥了重要的作用 国内外先后研制开 发了以银杏叶提取物制成的各种银杏制剂 内含2 4 的黄酮 主要由异鼠李素 山 奈酚等组成 适用于脑功能障碍 智力功能衰退 末梢血管血流障碍并伴随的肢 体血液不畅 临床上用于治疗冠心病 心绞痛 脑血管疾病等均有良好的疗效 高 锦明等 1 9 9 5 2 3 3 抗肝脏毒药物 从紫花水飞蓟种子中提取总黄酮 内含水飞蓟素 s i l y b i n 异水匕蓟素 s i l y d i a n i n 次水飞蓟素 s i l y c h v i s t i n 是常用抗肝素药 益肝宁 利肝隆 以及国外 s i l i m a r i t 的重要有效成分 具有刺激新的肝细胞形成 抗脂质过氧化作 用 用于治疗肝