（微生物学专业论文）光合细菌深红红螺菌放氢的研究.pdf

摘要 氢能具有燃烧热值高和产物无污染的特点 因此氢能被认为是最具有开发潜力的清洁能源之 o r h o d o s p i r i l l u mr u b r u m 为紫色非硫光合细菌 能够利用太阳在固氮酶作用下催化放氢 但是 l i 氮酶对光的依赖和吸氢酶对氢气的吸收是r r u b r u m 在光暗交替条件下持续放氢限制因素 为了提高r r u b r u m 的放氢产量和阐明r r u b r u m 在持续光照条件f 的氢代谢途径 本论文 通过缺失突变构建了6 个兄r u b r u m 突变株 分别为 吸氢酶大皿基结构基因h u p l 缺失单突变株 r r u b r u mu r 8 0 1 n i f h h u p l 双突变株u r 8 0 3 d r a t g b h u p l 双突变株u r 8 0 5 吸氢酶正调节冈 子h u p r 缺失单突变株u r 8 1 1 f e 一固氮酶结构基因a n j d g 缺失单突变株u r 8 0 2 以及n i y h a n y d g 烈突变株u r 8 0 4 并构建了丙酮丁醇梭菌f e 氢酶基因在rr u b r u m 中的表达菌株 苄基紫精还原法测定r r u b r u mu r 2 u r 8 0 1 与u r 8 11 的吸氢酶活性 表明h u p l 或h u p r 的 突变使吸氢酶活性明显降低 而且吸氢酶活性的节律性消失 但是h u p r 突变株的吸氨酶活性比 h u p l 突变株的吸氢酶活性高 表明h u p r 突变后 吸氢酶还存在本底水平的表达 在固氮条件下 测定所构建r r u b r u m 突变株与野生型菌株的固氮酶活性 结果表明 吸氧 酶大难基基因h u p l 或f e 固氮酶结构基因a n f d g 的缺失并不影响r m b r a m 的细胞乙炔还原活性 与细胞生k 但是m o 囿氮酶的结构基因n g h 的缺失导致细胞乙炔还原活性的下降 为rr u b r u m u r 2 同氮酶活性的5 7 比较了rr u b r u mu r 2 w t u r 8 0 1 u r 4 7 2 d r a t g b k a n 与u r 8 0 5 在持续光照条件 下产生气体的氢气含最 结果表明在在培养的3 0 8 0 小时内 四个菌株的氢含量都人于8 0 但 是 矿菌株僻r u b u r mu r 2 与u r 4 7 2 的氢含量随着培养时间的增加逐渐降低 而h u p 菌株 u r 8 0 1 与u r 8 0 5 的氢气含量没有显著的r 降 9 0 表明 u p 菌株产生的氢气更纯 光照强度对r r u b r u mu r 2 的氢产量影响较小 但是对h u p l 缺失突变株的氢产最有显著的影 响 r r u b r u mu r 8 0 1 的氢产量随着光照强度的增加而增加 其光合放氢的饱和光照强度为 4 0 0 0 0 6 0 0 0 0l u x 在饱和光照强度下 h u p l 的缺失能够提高r r u b r u m 光台氢产量 在改良m g 培养基中 其氢产量为r r u b r u mu r 2 的1 5 6 倍 在m g 培养基中 其产量为rr u b r u mu r 2 的 3 倍 在光暗交替条件r 模拟自然条件 rr u b r u mu r 8 0 5 的氢产量最高 为相同条件下r r u b r u mu p o 氢产量的1 3 5 倍 该菌株有望作为自然条件下的工业产氢菌株 在持续光照条件下 r r u b r u m 放氢途径有m o 一固氮酶 f e 固氨酶和第三种途径 但主要放 氢由m o 固氮酶催化 吸氢主要由吸氢酶介导 丙酮丁醇梭菌f e 氢酶在rr u b r u m 中表达并不影响细胞的生长 但是也没有明显地提高光照 条件下r r u b r u m 的氢产量 f e 氢酶在r r u b r u m 的超表达影响了rr u b r u m 细胞的生睦 产氢能 力也显著下降 表明丙酮丁醇梭菌f e 氢酶表达菌株并不适用丁光合放氢 关键词 深红红螺菌 光合放氢 同氮酶 吸氢酶 光暗交替 a b s t r a c t h y d r o g e ni sr e g a r d e da s o n eo ft h ec l e a ne n e r g yv e c t o rt od e v e l o p w h i c hp o s s e s s e so fh i g h c o m b u s t i o nh e a ta n dp r o d u c i n gw a t e ra si t so n l yb y p r o d u c t r h o d o s p i r i l l u mr u b r u m n o n s u l f u rp h o t o s y n t h e t i cb a c t e r i u m p r o d u c e sh y d r o g e na sb y p r o d u c to f n i t r o g e n a s eu s i n gs u n l i g h t a se n e r g y h o w e v e r l i g h t d e p e n d e n tn i t r o g e n a s ea c t i v i t ya n dh y d r o g e n c o n s u m e db yh 2u p m k eh y d r o g e n a s ea r el i m i t e df a c t o r st oh y d r o g e np r o d u c t i o nc o n t i n u o u s l yu n d e r l i g h t d a r kc y c l e i no r d e rt oi n c r e a s eh y d r o g e ny i e l d sa n dc l a r i f yh y d r o g e nm e t a b o l i cp a t h w a yu n d e rc o n t i n u o u s l i g h t s i xm u t a n t so fr r u b r u m i n c l u d i n ga h u p lm u t a n t 足r u b r u mu r 8 0 1 1 a c k i n gh 2u p t a k e h y d r o g e n a s e n i j 7 1 k a n z l h u p ld o u b l em u t a n tu r 8 0 3 1 a c k i n gb o t hm o n i t r o g e n a s ea n du p t a k e b y d r o g e n a s e d r a t k a n z l h u p ld o u b l em u t a n tu r 8 0 5 z s h u p rm u t a n tu r 8 1 l d e f i c i e n to fp o s i t i v e r e g u l a t i o na c t i v a t o ro fh 2u p t a k eh y d r o g a n a s e z 3 a n f d gm u t a n tu r 8 0 2 1 a c k i n gf e n i t r o g e n a s e a n d n i f h k a n a a n f d gd o u b l em u t a n tu r 8 0 4 1 a c k i n gb o t hm o n i t r o g e n a s ea n df e n i t r o g e n a s e a n dr r u b r u ms t r a i n se x p r e s s i n ga n do v e r e x p r e s s i n gf e h y d r o g e n a s ef r o mc l o s t r i d i u ma c e t o b u t y l i c u mw e r e c o n s t r u c t e d r e d u c t i o no fb e n z y l v i o l o g e nw a su s e df o rm e a s u r i n gu p t a k eh y d r o g e n a s ea c t i v i t yi nr r u b m t h er e s u l t ss h o w e dt h a td e l e t i o n o fe i t h e rh u p lo rh u p rr e s u l t e di nd e c r e a s e du p t a k eh y d r o g e n a s e a c t i v i t ya n dr h y t h mo fu p t a k eh y d r o g e n a s ea c t i v i t yi nrr u b t r mh u p s t r a i n sd i s a p p e a r e d h o w e v e r a c t i v i t yo fu p t a k eh y d r o g e n a s ei nr r u b r u mu r 8 11w a sh i g h e rt h a nt h a t i nu r 8 0 1 i n d i c a t i n gt h a t u p t a k eh y d r o g e n a s ee x p r e s s e s e di nb a c k g r o u n dl e v e li nh u p rd e l e t i o nm u t a n t n i t m g e n a s ea c t i v i t i e so f r r u b r u mu r 2a n di t sd e r i v a t i v e sw e r em e a s u r e du n d e rn i t r o g e nf i x a t i o n c o n d i t i o n d e l e t i o no fh u p lo ra n f d gh a dn os i g n i f i c a n te f f e c to nb o t hr e d u c t i o no fa c e t y l e n ec a t a l y z e d b yn i t r o g e n a s ea n dc e l lg r o w t h h o w e v e r d e l e t i o no fm f hl e a d st od e c r e a s e dn i t r o g e n a s ea c t i v i t yt o 5 7 c o n c e n t a a t i o n o fh y d r o g e np r o d u c e db yrr u b r u mu r 2 u r 8 0 1 u r 4 7 2 d r a t g b k a n a n d u r 8 0 5e x c e e d e d8 0 a t3 0 培oh o n m w h i c hp r o d u c e db yh u p s t r a i n sm r u b r u mu r 2a n du r 4 7 2 d e c r e a s e da l o n gc u l t i v a t i o n h o w e v e r b yh u p d i dn o td e c r e a s es i g n i f i c a n t l y 9 0 s u g g e s t i n gt h a t h y d r o g e np r o d u c e db yh u p s t r a i n sw e r em o r ep u r e h y d r o g e ny i e l do f rr u b r u mu r 2w a sa f f e c t e dl i t t l eb yl i g h ti n t e n s i t yb u tr r u b r u mu r 8 0 1 w a s n o ta f f e c t e ds i g n i f i c a n t l y h y d r o g e ny i e l do fu r 8 0 1i n c r e a s e dw i t hl i g h ti n t e n s i t ya n di t ss a t u r a t i o n l i g h ti n t e n s i t yw a s4 0 0 0 0 6 0 0 0 0l u xi nm o d i f i e dm gm e d i u m r r u b r u mu r 8 0 1i n c r e a s e dh y d r o g e n 1 5 6t i m e st h a to frr u b r u mu r 2 i nm gm e d i h l n i m p r o v e d3 f o l dt h a to frr u b r u mu r 2 u n d e r l i g h t d a r kc y c l e s i m u l a t i o no f n a t u r a ld a y n i g h tc y c l ec o n d i t i o n h y d r o g e ny i e l do f r r u b r u mu r 8 0 5 w a sm o s th i g h w h i c hw a s1 3 5t i m e st h a to f rr u b r u mu r 2 t h e r e f o r e rr u b r u mu r 8 0 5m i g h tb ea p r o m i s i n gs t r a i n st op r o d u c eh y d r o g e nu n d e rn a t u r a ld a y n i g h tc y c l ec o n d i t i o n u n d e rc o n t i n u o u sl i g h t h y d r o g e np r o d u c t i o np a t h w a y si nrr u b r u mi n c l u d e dm e n i t r o g a n a s e f e n i t r o g e n a s ea n da n o t h e rp a t h w a y h y d r o g e np r o d u c t i o nw a sc a t a l y z e db ym o n i 仃o g e n a s em a i n l y i i a n dh y d r o g e nc o n s u m p t i o nw a sm e d i a t e db yu p t a k eh y d r o g e n a s e t f e n i l r o g e n a s ef r o mc l o s t r i d i u ma c e t o b u t y l i c u me x p r e s s e di nrr u b r u m h a dn oe f f e c to nb o t hc e l l g r o w t ha n dh y d r o g e ny i e l du n d e rc o n t i n u o u sl i g h t h o w e v e r f e n i t r o g e n a s eo v e r e x p r e s s e d i nr r u b r u ma f f e c t e dc e l lg r o w t ha n dd e c r e a s e dh y d r o g e ny i e l ds i g n i f i c a n t l y i n d i c a t i n gt h a tr r u b r u m e x p r e s s i n g 讲o v e r e x p r e s s i n gf e b y d r o g e n a s ef o r mc c e 船6 j y f 记 m w e r en o tf i t t e df o rh y d r o g e n p h o t o p r o d u c t i u n k e y w o r d s r h o d o s p i r i l l u mr u b r u m h y d r o g e np h o t o p r o d u c f i o n n i t r o g e n a s e u p t a k eh y d r o g e n a s e l i 曲 d 盯kc y c l e i i 独创性声明 y 9 3 0 8 9 7 本人声鳃辑璺交豹论文怒我个人在母烬糖譬下邀嚣嬲残究工 乍及取愿的研究成 裂 尽我掰知 赊了文中特别加以捃注和致谢的地方外 论文中不包含其他人已经发 表或撰霉过熬秘宠成果 也不镪含为获褥中露农l 堑大学或其它教育枫撼的学位或诞书 瓣馊耀避豹拱料 我一闲工l 萋的网志对本磺究蹰擞麴任 迥黄歙均已在论文中俸了躜 镄麴说盟著袭示了谢意 一犋却 彩 时间 尊 年翻j 网 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关傈留 使用学位论文的规寇 即 举校有权保留 送交论文的复印件和磁盘 允许论文被整阑和偿阅 可阻采甭影印 缩印或扫描等鬣 钢手段保存 汇编学位论文 嗣意中国农鼗大学可 釜孺不翳方式在不圈媒体上发表 传播学位论文的全部或部分内容 保密的学位论文在解镪感应遵守此协议 研究生签名 导师签名 时间 占 时两 叠峭6 年占月1 6f i 年6 强 q 鬣 第一章生物放氢研究进展 文献综述 前言 化石 能源的日益减少及 泛使用造成了一系列的环境问题 因此 当前在设法降低化石能源 如煤 石油等 造成污染环境的同时 开发利用新型的清洁能源成为了人类实现可持续发展的 关键 氢能被认为是最具有开发潜力的新型能源之一 氢能具有以下的优点 1 氢元素位于元素周期表之酋 在常温常压f 氢气为气态 在超低温 2 3 5 c 1 4 k 和高压下 又可成为液态 氢可以以气态 液态或固态的金属氢化物存在 能适应储存运输及各种应用环境 的不同要求 2 氢具有较高的燃烧热值 为1 4 2 3 5 1k jk 菩1 是等质量汽油燃烧值的3 倍 酒精的3 9 倍 焦 炭的4 5 倍 3 氢是自然界存在最普遍的元素 据估计它构成了宇宙质量的7 5 除空气中含有少量氢气外 它主要以化合物的形态贮存于水中 而水是地球上存在最广泛的物质 4 在所有气体中 氢气具有较好的导热性 比大多数气体的导热系数高l o 倍 氢可以作为很好 的传热载体 5 氢本身无毒 而且燃烧的产物为对环境无污染的水 6 氢能的利用形式多种多样 既可以通过燃烧产生热能 在热力发动机中产生机械功 义可以 作为能源材料用于燃料电池 或转换成同态氢用作结构材料 用氢代替煤和石油 不需对现有的 技术装备作重人改造 现在的内燃机稍加改装即可使用 目前 氢气主要来自化石燃料的转化 d i 氢气来源的9 6 和电解水制氢 4 显然目前大 规模制氢没有摆脱不可再生能源 而且更重要的一点是上述方法制取的氢气的燃烧热值还没有常 规能源直接燃烧的燃烧热值高 所以这种方法不能作为工业生产氢气 开发利用氢能的关键技术包括两方面 一方面要解决制氢问题 另一方面要解决氢的贮存及 运输问题 氢不仅是 种清洁能源而且也是一种优良的能源载体 具有可储的特性 近年来 纳 米碳与金属氢化物在储氢方面已表现出优异的性能 有关的研究在国内外尚处于初始阶段 2 0 0 2 年 宝马公司已经生产出氢能汽车样机 时速2 8 0 公里 j 时 并建有配套的加氢站 每加注一次 氢 可行4 0 0 公里 上个世纪7 0 年代的能源危机 迫使人类开始寻找新型能源 氢能被认为最 具有发展潜力的 未米能源 之一 世界各国投入人量的资金探索各种产氢途径和氢能应用 9 0 年 代的环境污染和温室效应使氢能再次备受关注 越来越多的科学家投身于氢能的研究当中 目前 生物制氢作为新型的制氢方法被提上日程 日本 美国和德国等发达国家成立专 的机构启动了 生物放氢计划 日本每年投入巨资 期望到2 0 2 0 年实现氢能生产 运输和应用一体化的氢能网 络 目前 国外的氢能研究转入了氢能应用方面 而国内的研究起步较晚 研究机构和投入资金 少 尚处于起步阶段 中国农业大学博士学位论文 第一章生物放氢研究进艘 1 1 各种制氢方法 1 1 1 电解水制氢 电解水制氢是目前比较成熟的制氢方法之一 水为原料制氢过程是氢与氧燃烧生成水的逆过 程 因此只要提供一定形式的能量 则可使水分解 电解水制氢的效率一般在7 5 8 5 其 艺 过程简单 无污染 但消耗电虽大 一般每立方米氢气耗电4 5 5 5k w h 通常电水解制得的氢 气燃烧产生的能量还没有直接利用电能产生的能量多 冈此电解水制氢的应用受到一定的限制 1 1 2 矿物燃料制氢 以煤 石油及天然气为原料制取氢气也是当今制取氢气主要的方法之一 所制取的氢气主要 作为化工原料 合成氨 合成甲醇等 用矿物燃料制氢的方法包括 禽氢气体的制造 气体中 c o 组份变换反应及氢气提纯等步骤 用该种方法制得的气体组成中 氢气含量只能达到7 4 体 积 其次作为生产原料的轻质油价格高 反应需在8 0 0 c 8 2 0 c 下进行 造成氢气成本贵 所以 矿物燃料制氢的应用也受到了 制 1 1 3 以重油为原料部份氧化法制取氢气 重油原料包括有常压 减压渣油及 4 i 油深度加1 币的燃料油 重油与水蒸汽及氧气反应制 得含氢气产物 部分重油燃烧提供所需热量及一定的反应温度 气体产物组成 氢气4 6 体积 一氧化碳4 6 二氧化碳6 该法生产氢气的成本中 原料费约占三分之一 而重油价格较低 故为人们重视 但是生产的气体为混合气体 并且氢气的比例比较小 1 1 4 生物质制氢 生物质资源丰富 是重要的可再生能源 生物质可通过气化和微生物两种途径制氢 a 生物质气化制氢 将生物质原料如薪柴 锯未 麦秸 稻草等压制成型 在气化炉 或裂解炉 中进行气化或裂 解可制得含氢气的气体燃料 我国在生物质气化技术领域的研究已取得一定成果 中科院广州能 源所多年来进行了生物质气化的研究 气化产物中氢气约r 与1 0 热值达11m jm 可作为农 村燃料 但氢气含量仍较低 在国外 由丁转化技术的提高 生物质气化已能人规模生产水煤气 其氢气含量人大提高 是具有发展潜力的一 种制氢方法 2 b 微生物制氢 早在1 0 0 多年前 h o p p e s e y l e 发现从江河湖泊淤泥中分离得到的细菌能够分解有机物 并 伴随着h 2 和c 0 2 的产生 a d a m se t a l 1 9 8 0 1 9 3 1 年s t e p h e n s e n 和s t i c k l a n d 发现江河淤泥中的 某些细菌含有一种酶能够利用h 还原亚甲基蓝 并把这种酶命名为氢酶 h y d r o g e n a s e 随后 发现许多细菌 b o w i e na n ds c h l e g e l 1 9 8 1 真核生物 g a f f r o na n dr u b i n 1 9 4 2 和蓝细菌都能放 氢 b r n m a a n 将细菌放氢严格地区分为光台细卣放氢和非光合细菌放氢 并认为光台放氢过程比 非光合放氢过程更优越 微生物放氢都与其能量代谢密切相关 在好氧微生物中 底物氧化所释 放的电子通过电子传递链传递到晟终的电子受体氧 而在厌氧微生物中 厌氧代谢所产生的电子 最终被传递到电子受体如硝酸盐 硫酸盐或者其他的化台物 总之 微生物通过放氢消耗过剩的 还原力 g r a y h g e s t 将产氢微生物分为四类 g r a y a n dh o w a r d 1 9 6 5 1 不包含细胞色素系统的严格厌氧的微生物 如c l o s t r i d i am i c r o c o c c i m e t h a n o b a c t e r i a 2 包含细胞色素系统和甲酸裂解酶的兼性厌氧微生物 ec o n 3 包含细胞色素系统的严格厌氧微生物 女n d e s u l f o v i b r i od e s u l f u r i c a n s 4 依赖光的光合细菌 r h o d o s p i r i l l u mr u b r u m r h o d o b a c t e rc a p s u l a t u s 利用微生物在常温常压下进行酶催化反应可制得氢气 微生物产氢主要包括化能异氧微生物 产氢和光合微生物产氢 化能营养微生物包括各种发酵类型的一些严格厌氧菌和兼性厌氧菌 微 生物放氢的底物是各种碳水化合物 蛋白质等 目前已有利用碳水化台物发酵制氢的专利 并利 用所产生的氢气作为发电的能源 由于微型藻类和光合细菌的产氢过程与光合作用相联系 所以 称为光合产氢 此反应是在微生物作用下 将光能转换成化学能 这个产氢过程可以在1 5 4 0 0 c 的温度r 进行 1 2 绿藻f g r e e na l g a 放氢 绿藻属于真核生物 具有与高等植物相似的两个光合系统 绿藻光解水产生的电子传递给铁 氧还蛋白并进行c 0 2 的吲定 整个过程中伴随有a t p 和n a d p h 的形成 1 9 4 2 年 g a r f f o n j 及其同事 首次发现单细胞栅藻在光照条件下能够释放氢气 g a f f r o na n dr u b i n 1 9 4 2 迄今为止 已经发 现1 6 种绿藻 3 种红藻可以进行光合产氢 莱茵衣藻 c h l a r m y d o m o n a sr e i n h a r d n o 是光合放氢研究 最广泛最深入的绿藻 m e l i se t a l 2 0 0 0 a n t a le t a l 2 0 0 3 f e d o r o v e t a l 2 0 0 5 在已知可光合放氢 的绿藻中 莱茵农藻放氢效率最高 但是其商业开发价值较小 当绿藻的培养体系中不存在氧气 时 诱导表达的氢酶从铁氧还蛋白接受电子 并将质子还原成氢气 氢酶介导的绿藻放氢以及光 合作用电子传递途径如f f i g 1 1 1 f i g 1 1h y d r o g e n a s e r e l a t e de l e c t r o n t r a n s f e r p a t h w a y i n 辩na l g a e m e l i s a n d h a p p e 2 0 0 1 h 2 嬲e 氢酶 f d 铁氧还蛋白 p q 质体醌 p c 质体青苷 f n r f d n a d p 还原酶 r e d n a d p h 氧化 还原酶 c y t 细胞色素 绿藻在厌氧光照条件f 的放氢由氢酶介导 绿藻的氢酶位于叶绿体基质t h 绿藻光合放氧所 需光照强度小于5 0 0l u x 并且绿藻吸收的光谱都在可见光范围内 撮高的光转化率不超过5 0 a l d e r m a n 甜a l 2 0 0 2 测定了蓝细菌的固氮酶活性和绿藻叶绿体中的氢酶活性 得出绿藻氢酶 活性是固氨酶活性的1 0 0 0 倍 t a b l e l 1 v i g n a i se t a l 2 0 0 1 h a p p e e t a l 2 0 0 2 但是氢酶对氧 十分敏感 1 5 的氧浓度即可使氢酶活性在很短的时间内消失 m e l i s e t a l 2 0 0 0 m e l i sa n d h a p p e 2 0 0 1 a 表1 1 固氮酶与氧酶活性比较 t a b l e1 1c o m p a r i s o no f a c t i v i t i e so f n i t r o g e n a s ea n dh y d r o g e n a s e 菌种产氢的酶系统 酶活性 a n a b a e n a 周氮酶6 3n m o 心m v g 叶绿素 s p i n l l n a 同氮酶 6 1n m o lh 2 hi x g 叶绿素 一 n o s t o c 固氨酶2 3r a n o lh 2 i p g 叶绿素 s c e n e d e s m u s氢酶42 m n o lh 2 h l a g 酶 c h l a m y d o m o n a s氢酶5 6n n dh 2 b 腭酶 在绿藻中 参与放氢的主要酶是铁氧酶 o b l i q u u s cr e i n h a r d t i i 和c h l o r e l l a f u s c a 叶1 铁 4 l 曼奎兰查 錾圭 竺篓圭 2 三三二 窒鲨筌墼 彗竺 氢酶l h y d a l 已克隆并测序 f l o r i n e t a l 2 0 0 1 h a p p ea n d k a m i m k i 2 0 0 2 i y d ai 是一个单 体蛋白 其分子量约为4 9k d a 由基因咖删编码 在体内催化可逆反应 在藻类的厌氧能量代 谢过程中起到重要的作用 在s o b 均 w 和cr e i n h a r d h i 中还存在第二种铁氢酶0 t y d a l i f o r e s t i e r e t 口 2 0 0 3 两种铁氢酶晶体结构已被解析 f i g 1 2 两种氢酶的结构非常相似 都具 有 个h 通道 但是两种氢酶的表达受到不同的调节 圈1 2 莱茵衣藻中两种氢酶的结构 f j 吕1 2 脚d a ia n d h y d a l lm o d e l i n cr e i n h a r d t i i t e a a h e l i x c y a n 争s h e e t g r e y 脚d o mc o i l f o r e s f i e r e t a 2 0 0 3 在不同的菌株中 h y d a i i 的表达需要不同的牛理条件 在so b l i q u u s 中 h y d a i i 为组成型表 达f 而h y d ai 的表达需要诱导 在cr e i n h a r d l i i 中 h y d al t 的表达需要在厌氧条件下诱导 m e l i s e ta l 2 0 0 0 cr e i n h a r d t i i 的h y d a l l 与c l o s t r i d i u r ap a s t e u r i a n u m m e y e ra n dg a g n o n 1 9 9 1 l t r i c h o m o n a sv a g i n a l 缸和d e s u l f o v i b r i ov u l g a r i s n i c o l e te a 1 1 9 9 9 的铁氯酶具有较高的相似性 并且与自身的i l y d ai 也具有6 8 的同源性 h a p p ea n dk a m i n s k i 2 0 0 2 cr e i n h a r d t i i 中两种铁 氢酶的启动子区域有很大的差异 可能是为了适应不同生理条件而表达不同铁氢酶的需要 绿藻光解水得到的电子由氢酶介导传递到质子 导致氢气和氧气的同时产生 氢酶对氧十分 敏感 所以直接光解水产生氢气并不能维持很长时间 r e e v e s 等研究用惰性气体持续通入到绿藻 培养液中 可以使放氢时间持续更长一些 但是昂贵的惰性气体并不适用于工业生产 光解水产 生的氧气对氢酶的失活是从发现绿藻能够放氢以来一直来解决的问题 m e l i s 等人采用缺硫两阶段 法培养绿藻解决了这悯题 具体步骤为 1 绿藻在光照条件下生长到细胞浓度为3 6 1 0 6 个m i 2 然后将细胞转移到缺硫的培养基中持续光照培养 缺硫环境导致绿藻的氧化磷酸化效率以 1 5 2 0h o u r s 的半衰期指数下降到原来的1 0 放氢的速度可以达到2 0 2 5m ll t h 放氢的时 间从2 4h o u r s 始持续到7 0h o u r s 随后放氢速度骤然下降 绿藻氢产量仅为理论产量的1 5 m e l i se ta 2 0 0 0 m e l i sa n dh a p p e 2 0 0 1 缺硫两阶段培养绿藻细胞的产氯过程巾 细胞消耗大量的内源性蛋白和淀粉 随着第二阶段 培养时间的延长 l 5 二磷酸核酮糖羧化酶助口氧酶的量明显下降 即c 0 2 固定能力下降 光合 中困农业大学博士学位论文 第一章生物放氢研究进展 复合体的蛋向组成发生变化 细胞的形态也随之发生变化 从正常条什下的椭圆形变成较大的球 形 随后细胞的活性也下降 尽管许多绿藻的铁氢酶的体外活性很高 但是铁氢酶对氧和光都很敏感 c h e l ae ta 1 2 0 0 2 而且相应的细胞光合放氢能力都很低 f l o r i ne ta 1 2 0 0 1 除了光水解产生的氧对氢酶的失活作 用外 氢酶的放氢活性还与物质代谢 能量代谢 电子和质子的产生以及传递密切相关 g h i r a r d i 1 1 s e i b e r t 分别通过不同的方法筛选得到耐氧氢酶 从而延长 放氢时间 g h i m r d ie t a l 2 0 0 0 因此 必须阐明绿藻放氢的机制 才能充分挖掘绿藻放氢的潜力 1 3 蓝细菌 c y a n o b a c t e r i a 放氢 蓝细菌是一类光台自养微生物 所有的监细菌都能够进行氧化磷酸化 但是一些苗株还能够 进行非氧化磷酸化 能够利用h 2 s 作为电子供体 在蓝细菌中 参与氢代谢的关键酶有 同氨酶 n i t r o g e n a s e 吸氢酶 u p t a k eh y d r o g e n a s e o x e l f e l te ta l 1 9 9 8 和双向氢酶 b i d i r e c t i o n a l h y d r o g e n a s e t a m a g n i n ie ta 1 2 0 0 2 蓝细菌中烈向氢酶己被测序 s c b m i t ze t 口f 1 9 9 5 b o i s o ne t 以 1 9 9 6 h o u c h i n s 和b u r r i s 研究了a n a b a e n ap c c 7 1 2 0 的吸氢酶和双向氢酶的性质 发现两种 氢酶对温度的稳定性不同 吸氢酶对较高的温度更敏感 7 0 c 的半衰期为1 2m i n 但是对c o 不 敏感 h o u c h i n sa n db u r r i s 1 9 8 1 o x e l f e l te ta 1 1 9 9 8 矧氮酶是蓝细菌中放氢的主要酶 固氮酶 释放的氢气是生物嘲氮的副产物 吸氢酶能够消耗固氮酶和其他代谢途径放出的氢气 是放氢反 应的逆反应 双向氢酶催化可逆的反应 既能放出氢气也能吸收氢气 b e n e m a n n 1 9 9 8 t a m a g n i n i a l 2 0 0 0 蓝细菌中与氢代谢相关的二种酶的关系如f i g 1 3 6 图1 3 参与蓝细菌氢代谢的酶类 f i g 1 3e n z y m e sp a r t i c i p a t i n gh y d r o g e nm e t a b o l i s md i r e c t l yi nc y a n o b a c t a r i a t m n a g n i n id a l 2 0 0 2 n i f f l n i f da n dn i f ka r cs u b u n i t so fm o c o n t a i n i n gn i t r o g e n a s e h u p sa n dh u p la r ct h es u b u n i t so fu p t a k e h y d r o g e n a s e h o x h h o x y h o x ua n dh o x fa r et h es u b u n i t so f b i d i r e c t i o n a lh y d r o g e n a s e 在某些蓝细菌中 固氮酶是放氢的关键酶 而不是氢酶 固氮酶的放氢需要a t p 并且受到 n 和n h 的抑制 并不是所有的蓝细菌都具有固氮酶 但是具有固氮酶系统的蓝细菌比不存在 固氮酶系统的蓝细菌氢产量要大 蓝细菌具有与真核生物相似的两个光合系统 能够光解水为 h 和o 在具有异形胞的蓝细菌中 固氮酶的放氢活性并不受光照条件卜营养体细胞光解水所 产生的氧气的影响 蓝细菌在放氢过程中 产氧和放氢过程分别被隔离在营养体和异形胞中 实 现了空间上的分离 a n a b a e n ac y l i n d r i c a l 和a n a b a e n av a r i a b i l i s 是蓝细菌中研究放氢最广泛的两 个菌株 d a d a y e t a l 1 9 7 9 z h a n ge t a l 1 9 8 3 b o r o d i n e a l 2 0 0 0 尽管有很多途径研究篮细菌放氢与代谢 但是还没有一种成熟可行的方法用于大规模制氢 蓝细菌放氢存在的问题为 氧对氢酶活性的抑制 吸氢酶对氢的消耗 较低的放氢速度和较低氢 产量 b e n e m a n n 1 9 9 8 p i n t oe t a l 2 0 0 2 7 中国农业大学博士学位论文 第一章生物放氢研究进腱 固氮酶 双向氢酶和吸氢酶是监细菌中参与氢代谢的主要酶类 蓝细菌中可以同时存在一种 双向氢酶和几种固氮酶 但是还没有发现同一个菌株中拥有几种吸氢酶或几种烈向氢酶 在蓝细 菌中 存在三种圊氮酶 分别为m o 固氮酶 f e 固氯酶和v 固氮酶 t h i e l 1 9 9 3 t h i e le t a l 1 9 9 5 t h i e lp t 口 1 9 9 7 t h i e la n dp r a t t e 2 0 0 0 f e 同氮酶和v 围氮酶与m o 固氮酶在生理生化 催化活 性上存在较大的差异 具体内容将在后面章节讲到 l i n d b l a d 研究t a n a b a e n ap c c7 1 2 0 野生型及其吸氢酶缺失突变株的放氢 两个菌株的乙炔还 原活性相似 放氢速度随着光照强度的增加而增加 吸氢酶缺失突变株在户外实验中的最高放氢 活性1 4 9m lh 1 n 光能转化率为o 0 4 2 k u m a z a w a 研究了在氮气雨j 1 c o 9 9 n 2 气分下 a n a b a e n as p t u 3 7 1 的放氢速度 发现1 c o 气分可以增加氢气的产量 可能是由于c o 的加入 抑制了氢气的氧化从而增加了氢产量 k u m a z a w a 2 0 0 3 a c y l i n d r i c a 在6 0 wr l l 2 的光照条件f 放氢可以持续3 0 天 丽将光照强度提高到3 2 w m 放氢可缩短到1 8 天 光照强度的增加能使放氢速度提高2 倍 h a l l e n b e c ke t a l 1 9 7 8 p r e c t o n e m a b o r y a n u m 在加入还原剂连二亚硫酸钠后 固氮酶活性增加 放氢速度明显加快 k a s h y a pe ta l 1 9 9 6 s e r g e i 建立了蓝细菌两阶段发酵产氢 第一阶段进行c 0 2 的l 刮定 第二阶段为h 2 的产生 产氢 速度可以达至t j 2 0 m l g h 此循环能够持续一年 m a r k o ve a l 9 9 5 周氮蓝细菌的放氢效率为 0 1 7 4 2n m o lh 1 n 百1e h m a s u k a w ae th f 2 0 0 1 有趣的黝 v a r i a b i l i ss p u0 0 3 在黑暗条件f 也能 够放氢 s h a h e ta 1 2 0 0 1 1 4 非光合细菌放氢 由丁梭菌放氢速度较快 而且能够利用污水中的有机物发酵放氢 因此 梭菌 c l o s t r i d i a 是非光合细菌中研究生物放氢最具有吸引力的微生物 梭菌缺乏细胞色素系统和氧化磷酸化机 制 n a d h 的形成过程快下其氧化过程 所以细胞通过氢酶释放氢气而解除细胞中过剩的还原力 在梭菌中 放氨的主要酶是f e 氢酶 由h y a a 编码 分子量为6 4 5 6 0d a 梭菌中f e 氢酶的结构与 绿藻的两种f e 氢酶结构非常相似 c p a s t e u r i a n u m c p e r f r i n g e n s 和c a c e t o b u t y l i c u m 的氢酶基 因都己被克隆 c p a s t e u r i a n u m 铁氢酶晶体结构已经解析 m e y e ra n d g a g n o n 1 9 9 1 s a n t a n g e l op t a 1 1 9 9 5 p e t e r se t a l 1 9 9 8 k a j ie t a l 1 9 9 9 梭菌是一类严格厌氧的微生物 梭菌缺少细胞氧化磷酸化所需要的色素系统 细胞的能最来 臼丁底物水平磷酸化 葡萄糖氧化成丙酮酸的过程中产生a r p 和n a d p 1 h 丙酮酸继续氧化成乙 酰c o a c 0 2 和h k a r u b e 等人将丙酮丁醇梭菌制成i 捌定化细胞 以葡萄糖为底物 2 4 小时能产 生0 6 3m o lm o l 1 氢气 但是由于有机酸的大量积累 在碳水化合物完全利用完之前发酵放氢终止 1 3 r o s s e a u z a j i c 批式发酵cp a s t e u r i a n u m 对数生k 期过程中能够产生氢气1 5m