PCR技术的原理与应用(二).ppt

PCR技术的原理与应用 二 PCR中常见的问题解决办法 PCR产物的电泳检测时间 一般为48h以内 有些最好于当日电泳检测 大于48h后带型不规则甚致消失 PCR反应有哪些关键环节 模板核酸的制备 引物的质量与特异性 酶的质量 PCR循环条件 寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究 模板最容易出现的问题 模板中含有杂蛋白质 模板中含有Taq酶抑制剂 模板中蛋白质没有消化除净 特别是染色体中的组蛋白 在提取制备模板时丢失过多 或吸入酚 模板核酸变性不彻底 在酶和引物质量好时 不出现扩增带 极有可能是标本的消化处理 模板核酸提取过程出了毛病 因而要配制有效而稳定的消化处理液 其程序亦应固定不宜随意更改 PCR引物常见的问题 引物 引物质量 引物的浓度 两条引物的浓度是否对称 是PCR失败或扩增条带不理想 容易弥散的常见原因 有些批号的引物合成质量有问题 两条引物一条浓度高 一条浓度低 造成低效率的不对称扩增 对策为 选定一个好的引物合成单位 引物的浓度不仅要看OD值 更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳 一定要有引物条带出现 而且两引物带的亮度应大体一致 如一条引物有条带 一条引物无条带 此时做PCR有可能失败 应和引物合成单位协商解决 如一条引物亮度高 一条亮度低 在稀释引物时要平衡其浓度 引物应高浓度小量分装保存 防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分 导致引物变质降解失效 引物设计不合理 如引物长度不够 引物之间形成二聚体等 酶的问题 酶失活 需更换新酶 或新旧两种酶同时使用 以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性 需注意的是有时PCR失败是由于忘加了Taq酶 Mg2 浓度 Mg2 离子浓度对PCR扩增效率影响很大 浓度过高可降低PCR扩增的特异性 浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带 PCR反应体积 通常进行PCR扩增采用的体积为20ul 30ul 50ul 或100ul 应用多大体积进行PCR扩增 是根据科研和临床检测不同目的而设定 在做小体积如20ul后 再做大体积时 一定要模索条件 否则容易失败 变性温度对PCR的影响 变性对PCR扩增来说相当重要 如变性温度低 变性时间短 极有可能出现假阴性 退火温度过低 可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率 退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率 有时还有必要用标准的温度计 检测一下扩增仪或水溶锅内的变性 退火和延伸温度 这也是PCR失败的原因之一 靶序列变异 如靶序列发生突变或缺失 影响引物与模板特异性结合 或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列 其PCR扩增是不会成功的 PCR出现假阳性的原因 假阳性 出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致 有时其条带更整齐 亮度更高 引物设计不合适 选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性 因而在进行PCR扩增时 扩增出的PCR产物为非目的性的序列 靶序列太短或引物太短 容易出现假阳性 需重新设计引物 靶序列或扩增产物的交叉污染 这种污染有两种原因 一是整个基因组或大片段的交叉污染 导致假阳性 这种假阳性可用以下方法解决 操作时应小心轻柔 防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外 除酶及不能耐高温的物质外 所有试剂或器材均应高压消毒 所用离心管及样进枪头等均应一次性使用 必要时 在加标本前 反应管和试剂用紫外线照射 以破坏存在的核酸 二是空气中的小片段核酸污染 这些小片段比靶序列短 但有一定的同源性 可互相拼接 与引物互补后 可扩增出PCR产物 而导致假阳性的产生 可用巢式PCR方法来减轻或消除 非特异性扩增带出现的原因 PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致 或大或小 或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带 非特异性条带的出现 其原因 一是引物与靶序列不完全互补 或引物聚合形成二聚体 二是Mg2 离子浓度过高 退火温度过低 及PCR循环次数过多有关 其次是酶的质和量 往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现 酶量过多有时也会出现非特异性扩增 非特异性扩增带出现的对策 一 其对策有 必要时重新设计引物 减低酶量或调换另一来源的酶 降低引物量 适当增加模板量 减少循环次数 适当提高退火温度或采用二温度点法 93 变性 65 左右退火与延伸 非特异性扩增带出现的对策 二 采用热启动PCR 把PCR混合物在显著低于Tm值的温度下作哪怕短暂的保温 也可能产生引物二聚体和非特异性配对 热启动PCR则可以大大减少这些麻烦 其目标是在第一个循环中等温度升到超过反应物的Tm值后才允许反应中的一两种关键成分进入反应 例如在复盖有矿物油的小试验中 所有反应管的一种公共成分 如Taq酶 可以先不加 而到第一个循环的变性阶段温度超过80 以后再加 最近有一种热启动的方法是在加入TaqDNA聚合酶前先在管中加入其单克隆抗体 Clonetech公司的TaqStartAntibody 或者ToYoBo公司的KodPlusDNA聚合酶 在温度升高到将中和抗体变性失活之前 抗体阻遏聚合酶的活性 防止反应开始 非特异性扩增带出现的对策 三 嵌套式和半嵌套式PCR对于减少或消除不需要的产物同时提高灵敏度经常是很成功的 首先在常规调价下用第一套跨越目的DNA片段的引物扩增 假象产物经常会与引物中的一条或两条配对 但其内部却是无关序列 接着对一部分反应物 产物混合物进行新一轮扩增 采用的引物与第一对引物内侧的序列配对 在这一轮扩增中只有真正的产物被扩增 这种办法即使在目的产物开始用EB染色检测不到而且有假象带时也常常获得成功 半嵌套式PCR 只第二条引物在目的片段一端的内侧 也同样有效 在基因步行或企图进行5 或3 端RACE时 由于只有一条引物内部的序列是已知的 经常需要作这种变动 采用嵌套式PCR方法 第一 二轮扩增在第20个循环左右终止而不是象通常的在第30 35个循环终止会获得更好的结果 这样做减少了产生不需要的高分子量带和成片产物的机会 嵌套式PCR极端敏感 在106基因组DNA背景中一个拷贝的病毒基因也能检测到 第二种形式的假象 即所谓的跳跃PCR 可能不能用嵌套式PCR消除 一些延伸不完全的产物可能偶尔与相邻的DNA片段 也许是相似的基因成分重新配对 这样会产生不需要的产物 在这种情况下 一条或两条引物内侧的序列仍旧存在 但扩增产物的大小不同 出现片状拖带或涂抹带 PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带 其原因往往由于酶量过多或酶的质量差 dNTP浓度过高 Mg2 浓度过高 退火温度过低 循环次数过多引起 其对策有 减少酶量 或调换另一来源的酶 减少dNTP的浓度 适当降低Mg2 浓度 增加模板量 减少循环次数 克隆PCR产物的最优条件是什么 最佳插入片段 载体比需实验确定 1 1 插入片段 载体 常为最佳比 摩尔数比1 8或8 1也行 应测定比值范围 连接用5ul2X连接液buffer 50ng质粒DNA 1Weiss单位的T4连接酶 插入片段共10ul 室温保温1小时 或4 过夜 在这2种温度下 缺T 凸出端的载体会自连 产生蓝斑 室温保温1小时能满足大多数克隆要求 为提高连接效率 需4 过夜 使用TA克隆方法或平端连接方法 利用pUC19载体上的SmaI位点 PCR产物是否需要用凝胶纯化 如凝胶分析扩增产物只有一条带 不需要用凝胶纯化 如可见其他杂带 可能是积累了大量引物的二聚体 少量的引物二聚体的摩尔数也很高 这会产生高比例的带有引物二聚体的克隆 而非目的插入片段 为此需在克隆前做凝胶纯化 标准的PCR反应体系 10 扩增缓冲液10ul4种dNTP混合物各200umol L引物各10 100pmol模板DNA0 1 2ugTaqDNA聚合酶2 5uMg2 1 5mmol L加双或三蒸水至100ul PCR出现smear可能的原因 1 都是由于产生非特异性扩增所致 逐个验证 1 酶 引物 模板浓度太大 可以减少这几个组分的用量 2 温度太低 升高退火温度 可以先做一个不同温度的预实验或者选用降落PCR 3 引物特异性不好 引物特异性的好坏可以在ncbi比对得知 关于引物是否合成的好 可以在DHPLC上看一下 80度全变性的情况下一条带就可以了 如果合成的不好 产物自然不特异了 Taq酶只要有引物结合模板的情况下 就会迅速扩增DNA 所以如果没有特异性引物下 很容易产生smear 4 Mg2 浓度的问题 这个成分对产物的特异性是非常重要的 可以做一梯度优化一下 PCR出现Smear的可能原因 2 假定使用了比较好的Taq酶 且引物没有出现问题 考虑如下几点 1 模板是否过量 2 退火温度是否可降高1 2度 3 Mg2 的浓度控制在1 5mM 4 循环数是否过多 PCR出现Smear的可能原因 3 由于酶量过多或酶的质量差 dNTP浓度过高 Mg2 浓度过高 退火温度过低 循环次数过多引起 其对策有 减少酶量 或调换另一来源的酶 减少dNTP的浓度 适当降低Mg2 浓度 增加模板量 减少循环次数 PCR高保真酶推荐 PE公司 ABI Parken ElmerDNA聚合酶TakaRa公司的PrimeStarToYoBo公司的Kod Plus PCR产物成片的原因 增加循环数可以增强反应物不足时的反应 但这样会导致产生假阳性带以及富含单链DNA的高分子量成片产物 如果起始模板的量太大 就象企图再扩增第一次PCR产物时经常遇到的那样 同样的产物成片现象也可能在正常条件下出现 总的规则是如果在凝胶上见得到条带 只能用1 l第一次PCR产物的1 104到1 105稀释物作为模板进行第二轮PCR 很少或没有检测到产物的原因 如果已经调整了Mg2 浓度 缓冲液的pH值和循环产物 而且也增加了循环数 尝试过了较低的退化温度和TDPCR 但在EB染色的凝胶上还是看不到产物 聚丙烯酰胺凝胶比琼脂糖凝胶要敏感一些 而阳性对照表明试剂没有问题 下一步该怎么办 延长起始的变性时间和 或 提高温度能增加模板DNA完全变性的可能 以提供最大数量的引物配对位点 这一可选步骤的标准条件是95 C变性5分钟 有可能扩增发生了 只是效率不高 如果这样 可通过对干凝胶或印迹的杂交来检测产物 用同一套引物或者最好用嵌套式引物进行第二次扩增 有可能得到特异产物 这时必须