基因工程 期末复习题及答案.pdf

名词解释 基因工程 是以分子遗传学理论为基础 以分子生物学和微生物 学的现代方法为手段 将不同来源的基因 即DNA 分子 按照人们预先设 计的蓝图 在体外构建重组DNA 分子 然后导入活细胞 有目的改造生物原 有的遗传特性 获得新品种 生产新产品 或是研究基因的结构和功能 同裂 酶 isoschizomers 同切点酶 有一些来源不同的限制酶识别的是同样的 核苷酸靶序列 这类酶特称为同裂酶 同尾酶 isocaudamer 与同裂酶对应 的一类限制性内切酶 它们虽然来源不同 识别的靶序列也各不相同 但都 能产生相同的粘性末端 特称为同尾酶 星号活性 star activity 在 非最适 的 反应条件下 包括高浓度的核酸内切限制酶 高浓度的甘油 低离子 强度 用Mn2 取代Mg2 以及高pH值等等 有些限制性核酸内切酶识别 序列的特异性便会发生 松动 从其 正确 识别序列以外的其它位点切割 DNA分子 这种特殊的识别能力 通常叫做星号活性 以EcoRI 表示 测序 酶是经修饰过的T7噬菌体DNA聚合酶 是采用缺失的方法 从外切核酸酶 结构域中除去28个氨基酸 这样使得T7DNA聚合酶完全失去了3 5 外切 酶活性 只有5 3 聚合酶活性 而且聚合能力提高了3 9倍 测序时常用此酶 限制性内切酶也是一种水解酶 主要从细菌中分离得到 在细菌体内的作 用是水解 入侵 的外源DNA 序列而保护自身DNA 水解后产生的DNA 产物是带有5 P 和3 OH的 限制性核酸内切酶 是一类能识别和切割双链DNA 分子中特 定碱基顺序的核酸水解酶 限制 修饰系统 指一定类型的细菌可以通过限 制性酶的作用 破坏入侵的外源DNA 如噬菌体DNA等 使得外源DNA对 生物细胞的入侵受到限制 而生物细胞 如宿主 自身的DNA分子合成后 通过修饰酶的作用 在碱基中特定的位置上发生了甲基化而得到了修饰 可免遭自身限制性酶的破坏 这样形成的就是限制 修饰系统 限制性片段 长度多态性 RFLP 当DNA序列的差异发生在限制性内切酶的识别位点 时 或当DNA片段的插入 缺失或重复导致基因组DNA经限制性内切酶 酶解后 其片段长度的改变可以经过凝胶电泳区分 出现的这种DNA多态 性称RFLP 载体 vector 在基因操作中携带外源基因进入受体细胞的工 具 克隆载体 主要用于扩增或保存DNA片段 是最简单的载体 穿梭载体 能在两类不同宿主中复制 增值和选择的载体 表达载体是可携带外源 基因进入宿主细胞进行复制并进行转录 翻译的载体 YAC 人工染色体 载体是利用酿酒酵母的染色体的复制元件构建的载体 其工作环境也是 在酿酒酵母中 YAC基本特点 YAC 载体为能够满足自主复制 染色体在 子代细胞间的分离及保持染色体稳定的需要 必须含有以下元件 端粒重 复序列 telomeric repeat TEL 定位于染色体末端一段序列 用于保护线状 的DNA不被胞内的核酸酶降解 以形成稳定的结构 着丝粒 centromere CEN 有丝分裂过程中纺锤丝的结合位点 使染色体在分裂过程中能正确 分配到子细胞中 在YAC中起到保证一个细胞内只有一个人工染色体的 作用 自主复制序列 autonomously replication sequences ARS 一段特殊的 序列 含有酵母菌中DNA进行双向复制所必须的信号 细菌人工染色体载 体 Bacterial artificial chromosom es BACs 是基于大肠杆菌的F质粒构建的 高通量底拷贝的质粒载体 卸 甲载体 将Ti质粒上的T DNA的致瘤基因全部去掉 仅保留其两边界即与 T DNA转移所必需的25bp序列而构建成的载体 一元载体 含目的DNA的 中间表达载体与改造后的受体 Ti质粒 通过同源重组所产生的一种复合 型载体 双元载体 是指由两个分别含有T DNA和vir区的相容性突变Ti质 粒构成的系统 Ti质粒 tumor inducing plasmid 是根癌农杆菌中发现的可 引起植物产生冠瘿瘤的质粒 T DNA区 即转移DNA 能转移并整合在植 物细胞核基因组上的 决定植物形成冠瘿瘤的一段DNA LTS和RTS对于 T DNA的转移和整合是不可缺少的 互补 指 lacZ 基因上缺失近操纵基 因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的 半乳糖苷酶 galactosidase 由 1024个氨基酸组成 阴性的突变体之间实现互补 探针 probe 指用于检测特定基因或转录产物存在或表达的DNA RNA或瓜 核酸序列 这些序列在使用之前需标记 基因探针 指用于检测特定基因或 转录产物存在或表达的DNA RNA或寡核苷酸序列 这写序列在使用之 前 需要进行标记 COS位点 当 DNA进入细菌细胞后 便迅速粘性末端配 对形成双链环状DNA分子 这种粘性末端结合形成的双链区域叫做COS 位点 凝胶阻滞试验 gel retardation assay 又叫DNA迁移率变动试验 EMSA 是用于体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳 技术 盒式诱变 cassette mutagenesis 就是用一段人工合成具有突变序列 的DNA片段 取代野生型基因中的相应序列 这就好象用各种不同的盒式 磁带插入收录机中一样 故而称合成的片段为 盒 这种诱变方式为盒式 诱变 酵母双杂交体系 Yeast two hybrid system 也叫相互作用陷阱 interaction trap 是20世纪90年代初发展起来的分离新基因的新方法 可 用于分离能与靶蛋白相互作用的基因 也是直接在细胞内检测蛋白 蛋 白交互作用的灵敏度很高的遗传学新工具 酵母单杂交体系 yeast one hybrid system 常用于研究DNA 蛋白质间的相互作用 酵母单杂交体系可 识别稳定结合于DNA上的蛋白质 可在酵母细胞内研究真核DNA 蛋白质 间的相互作用 并通过筛选DNA文库直接获得靶序列相互作用蛋白的编 码基因 也可用于分析鉴定细胞中转录调控因子与顺式作用元件相互作 用 cDNA末端的快速扩增 RACE rapid amplification of cDNA ends 是用 于从已知cDNA片段扩增全长基因的方法 它根据已知序列设计基因片段 内部特异引物 由该片段向外侧进行PCR扩增得到目的序列 用于扩增 5 端的方法称为5 RACE 用于扩增3 端的称为3 RACE 基因文库 是指利 用重组DNA技术将生物细胞的染色体DNA所有片段随机地连接在基因 载体上 然后转移到适当的寄主中 通过细胞增殖而构成各种片段的无性 繁殖系 这种包含某种生物全部基因的一系列无性繁殖系称为该种生物 的基因文库 分为 基因组文库和cDNA文库 cDNA文库 将一种生物 mRNA 经反转录产生cDNA 以cDNA构建的克隆群体叫做该种生物的 cDNA文库 cDNA差示分析法 representational difference analysis RDA 是 利用PCR能以指数形式扩增双链DNA模板 而仅以线性形式扩增单链模 板的特性 通过降低cDNA群体复杂性和更换cDNA两端接头等方法 特异 性的扩增目的基因片断 融合基因 是指应用DNA 体外重组技术构建的一 类具有来自两个或两个以上的不同基因核苷酸序列的新型基因 抑制性消减杂交 Suppression Subtractive hybddization SSH 是一种比较和 分离不同细胞或同一细胞在不同状态下差异表达基因的方法 转化 transformation 把重组质粒DNA导入受体细胞 大肠杆菌 酵母 动植 物细胞等 使其遗传性状改变的过程 感受态 competence 作为受体细胞 的细菌经一定处理 如冰冷的CaCl2溶液 后处于易于接受外源DNA的状 态 衔接物是指人工合成的由10 12nt组成的 具有一个或数个在其要连 接到的DNA上并不存在的限制性内切酶识别位点的平末端的双链寡核苷 酸短片段 DNA接头 人工接头 是指人工合成的含有限制酶识别顺序的 核苷酸片段 转化子 transformant 经转化获得外源遗传物质 DNA的细胞 是向有功能缺陷的细胞补充相应功转染 transfection 把重组的噬菌体或 病毒导入受体细胞的过程 选择 selection 是指通过某种外来附加压力 或 因素 的辨别作用 呈现具有重组DNA分子的特定克隆类型的一种方法 筛 选 screening 是指通过某种特定的方法 从被分析的细胞群体或基因文库 中 鉴定出真正具有所需要重组DNA分子的特定克隆的过程 沉默子 silencer 是参与基因表达负调控的一种元件 降低转录效率的一段DNA 绝缘子 insulator 既是基因表达的调控元件也是一种边界元件 绝缘子本 身对基因的表达既没有正效应 也没有负效应 其作用只是不让其他调控 元件对基因的活化效应或失活效应发生作用 衰减子 attenuator 衰减发生 处的一种内部终止子序列 衰减子结构本身不能实现衰减作用 必须借助 核糖体与前导序列的结合来发挥其作用 终止子 terminator 为转录提供 终止信号的一段DNA序列 是基因表达的顺式负调控元件 电转化法 electroporation 也叫电穿孔法或电击法 是一种将极性分子穿过细胞膜导 入细胞的一种物理方法 在这个过程中一个较大的电脉冲短暂破坏细胞 膜的脂质双分子层 从而允许DNA等分子进入细胞 菌落原位杂交 将菌落 或噬菌斑转到固相膜上 原位裂解细胞后使核酸固定在膜上 然后与探针 杂交 目的基因 指那些已被或者准备要被分离 改造 扩增或表达的特 定基因或DNA 片段 报告基因 是指编码产物能够被快速测定 常用于判 断外源基因是否成功地导入受体细胞 器官或组织 是否表达的一类特殊 用途的基因 报告基因与选择基因的区别 选择基因往往要与外界存在的筛选压力如 抗生素等相互作用 以筛选出被转化的细胞 而报告基因是提供一种快速 测定外源基因是否成功导入的检测手段 它的应用不依赖于外界选择压 力的存在 原位PCR 是指对组织 细胞中特异DNA或RNA进行扩增 然后 再用原位杂交对扩增产物进行定量分析的一种方法 转基因动物 指用人 工的方法将外源基因导入动物受精卵或早期胚胎细胞 使外源基因与动 物本身的基因组整合 并随细胞的分裂而增殖 从而将外源基因稳定地遗 传给下一代的工程化动物 基因工程疫苗 疫苗一般是由灭活或减毒的病 原体做成的可预防相应病原物引起疾病的药物 通过接种人或动物在其 体内建立抗感染免疫反应而产生保护作用 将基因工程技术应用于疫苗 生产所得的疫苗即为基因工程疫苗 亚克隆 对已经获得的目的DNA片段 进行重新克隆 即将已克隆的DNA片段从一载体向另一载体的转移的过 程 目的在于对目的DNA进行进一步分析 或者进行重组改照等 核酸疫苗 核酸疫苗又称基因疫苗或DNA疫苗 是利用基因重组技术将编码抗原的 基因装入载体 然后直接导入动物体内 通过机体细胞的转录系统合成蛋 白 产生的蛋白作为抗原诱导免疫系统产生免疫应答 即通过细胞和体液 免疫反应产生抗体 从而达到预防和治疗疾病的目的 动物生物反应器 从 转基因动物体液或血液中收获基因产物即是所谓的动物生物反应器质粒 的不相容性 两个质粒在同一宿主中不能共存的现象 他们常常共用同一 个复制系统 转化 指将质粒DNA或以它为载体构建的重组质粒导入受体 细胞中的过程 转染把重组的噬菌体或病毒导入受体细胞的过程 基因治 疗能基因 以纠正或补偿其基因缺陷 达到治疗目的的方法 转座子标签技 术 T DNA标签技术 当转座子或T DNA转入生物基因组 整合到染色体上 的时候 有可能是插入到染色体上的某个基因中 这时会破坏该基因的结 构 从而引起表型变异 把变异个体的DNA提取出来 构建成基因组文库 再 用转座子或T DNA为模板制备探针 克隆出该突 第一章1 基因克隆 基因操作 基因重组 基因工程的概念及其相互关系 基 因克隆 在一定程度上等同于基因分离 基因工程 通过基因操作来定向改 变或修饰生物体或人类自身 并具有明确应用目的活动称为基因工程 基 因操作 对基因进行分离 分析 改造 检测 表达 重组和转移等操作的总称 基因重组 不同来源DNA分子通过共价连接 磷酸二酯键 而组合成新的 DNA分子的过程 关系 基因工程是通过基因重组实现的 但基因重组并不 都是严格意义上的基因工程 基因重组是基因操作范畴的概念 包括实验 研究和生物技术的基因重组事件 而基因工程则专指为实践应用而进行 的重组事件 2 试述基因工程技术的发展给人类带来的影响 在工业领 域的应用 第四次工业大革命 在农业领域的应用 在医药领域的应用 第二次医学大革命 3 试述基因工程技术的发展方向 生物的遗传改良 生 物反应器 基因治疗和基因疫苗等 4 简述基因工程的基本过程 提取目 的基因 目的基因与运载体结合 将目的基因导入受体细胞 目的基 因的检测和表达 第二章1 切口平移标记DNA前 用DNaseI处理DNA时应注意什么 应注意 Mg2 离子浓度和处理时间及温度 2 DNA聚合酶有哪些类型 各有什么活 性 E coliDNApolI 5 3 DNA聚合酶活性 5 3 DNA外切酶活 性 3 5 DNA外切酶活性 E coliDNApolI大片段 Klenow酶 5 3 DNA 聚合酶活性 3 5 外切酶活性 T4噬菌体DNApol5 3 DNA聚合酶活性 与 lenow酶相似 3 5 外切酶活性 lenow酶 200 在无dNTP时只有 该活性 常用于填平dsDNA的3 缩进末端及水解dsDNA的3 突出末端 T7 噬菌DNApol及测序酶5 3 DNA聚合酶活性 3 5 外切酶活性 lenow酶 1000 耐热DNA聚合酶在高温下仍具活 性的DNA聚合酶 反转录酶 依赖于RNA的DNApol 5 3 DNA聚合酶 活性 需Mg2 RNaseH活性 5 3 及3 5 RNA外切核酸酶活性 末端 转移酶 terminaltransferase 不依赖于模板的DNA聚合酶 在二价阳离子存 在下 催化dNTP加在DNA分子的3 OH端 3 生产限制性内切酶的细菌如何保护自己的DNA不被降解 通过限制与 修饰系统保护自己的DNA不被降解 不同种的细菌或不同的细菌菌株具 有的限制酶和修饰酶组成的限制与修饰系统 修饰的本质是通过甲基化 酶将DNA中某些碱基进行甲基化修饰 由于宿主自身DNA上的这些位点 进行了修饰 限制酶就不能进行切割 由于外来的DNA在相应的碱基上没 有被甲基化 宿主的限制酶通过对该位点的识别来分辨敌我 并将入侵的 外来DNA分子降解掉 所以DNA限制作用和修饰作用为细胞提供了保 护 4 按适当的顺序 列出将一种mRNA的cDNA克隆到表达载体所用到的 酶有哪些 反转录酶以mRNA为模板复制出单链cDNA DNA聚合酶 以单链cDNA为模板合成双链DNA S1核酸酶切割双链DNA形成平末 端 用限制性内切酶切割载体 用DNA连接酶将cDNA插入载体 5 某 学生在用EcoRI切割外源DNA片段时出现了星号活性 分析可能的原因 1 高甘油含量 5 v v 2 限制性内切核酸酶用量过高 100U ugDNA 3 低离子强度 3kb的DNA片段3 在做Southern印迹分析时 有同学为了节省时间 做完凝胶电泳这一步 没有根据方案用NaOH溶液浸泡凝胶使DNA变性为 单链 而是略过了这一步直接将DNA从凝胶转移至NC膜上 然后用标记探 针杂交 最后发现放射自显影胶片是空白的 试分析该同学错在哪里 杂交 探针是双链的 可能因为在加人杂交混合物之前忘记将探针变性而得到 空白的放射自显影结果 4 建立了一个文库后 如何鉴定一个携带目的基 因的克隆 带有某一细菌基因的克隆通常可以直接看出来 因为基因表达 引起了宿主细胞表型的可见变化 然而 真核生物的基因不都表达 则需用 相应的方法来找出带有所需基因特定克隆 一个常用方法是杂交 1 从不 同的克隆提取DNA 固定于硝酸纤维素滤膜上 然后用NaOH使之变性 2 探针必须能与所需的基因互补且被32p标记 探针可以是来自另一不同生 物体的相关的基因 或是依据与基因特异相关蛋白质的氨基酸序列设计 并经化学合成的一小段DNA分子 3 探针只会与特定基因进行碱基配对 杂交 冲洗滤膜后 未结合上的标记探针会被除去 4 烘干滤膜后进行放 射自显影后 所需的克隆就以一个黑点在胶片上显示出来 这就是菌落或 原位杂交分析 5 单核苷酸置换插入或缺失中 引物设计的要求 5 端完全 配对 使得上游 引物 起始的DNA合成不容易将诱变寡核苷酸取代 约需8 10bp 3 端所形成的杂交体足以引导DNA合成 如果错配核苷酸太靠近 3 端 3 端将不能形成稳定的杂交体 易被外切活性降解 所以3 端需有9bp 完全配对 为便于筛选 应选用可形成稳定杂交体而长度最短的诱变寡核 苷酸 一般17 19bp 错配在中央 使得完全配对的杂交体与错配杂交体之间 的热稳定性差异足够大 6 DNA诱变有哪些种类 各有何特点 随机诱变 目的基因的DNA片段中引入了大量的序列多样性 得到的具体突变体可 以是单点突变也可能是多点突变 寡核苷酸介导的定点诱变 寡核苷酸 介导的定点诱变可以在任何感兴趣的位置加上限制性内切酶位点 能够 把一个自然条件下从未被发现的突变精确放置在靶基因的特定位置 7 DNase I足迹试验主要步骤 用32P标记DNA双链末端 并用RE切去一 端 加入细胞特定周期蛋白质提取物 温育 加入适量DNaseI或硫酸二 甲酯 六氢吡啶 使DNA链发生断裂 这一反应中 DNaseI或硫酸二甲酯的 用量非常关键 要保证一条DNA链只发生一次断裂 沉淀DNA 包括与 DNA相结合的蛋白质 进行DNA凝胶分析 第五章1 简述以质粒为载体构建基因文库的基本步骤 总DNA的提 取 载体的制备 纯化 基因组DNA的不完全消化 载体与外源DNA 片断的连接 转化受体菌 然后在有选择压力的平板上培养转化了外源 基因的受体菌 重组子的鉴定 外源DNA进行分析 2 构建了基因文库 后 有哪些方法可以筛选或鉴定出哪一个克隆可能含有目的基因 表型 筛选法 是在宿主菌 大肠杆菌 中表达目的基因 使宿主产生新的表型或使 宿主恢复其突变基因的表型来筛选目的基因 用核酸探针筛选目的cDNA 基因 对欲克隆的基因序列了解时 以目的 基因的部分序列 DNA片段 制备探针 对文库进行筛选 免疫筛选 抗体 筛选 目的基因 如果能够得到目的基因产物的抗体 就可以通过免疫学的 方法来筛选目的基因 其使用的探针不是核酸 而是特异性抗体 利用数 据库鉴定基因 将DNA序列输入GenBank与已知的基因序列进行比较 酵母双杂交系统鉴定基因 是根据真核生物转录调控特点创建的一种体 内鉴定基因的方法 其筛选的基因不是 探针 的直接编码产物 而是能够 与其相互作用的蛋白质的编码基因 即筛选与已知基因产物发生相互作 用的蛋白的编码基因 3 在基因工程中 为了在细菌细胞中表达真核生物 的基因产物 为什么通常要用cDNA而不用基因组DNA 为什么要在cDNA 前加上细菌的启动子 cDNA是mRNA的反转录产物 与基因组DNA相比 没有了启动子和内含子 因为细菌没有内含子剪接系统 并且不能识别真 核生物的启动子 所以要使用cDNA 有因为cDNA上没用启动子 所以要加 上细菌的启动子 保证其能正确转录 5 扣除杂交 其基本原理是 概念 将 含目标基因的组织或器官的 mRNA 群体作为待测样本 Tester 将基因表 达谱相似或相近但不含目标基因的组织或器官的mRNA 群体作为对照样 本 Driver 将Tester 和Driver 的 cDNA 进行多次杂交 去掉在二者之间都 表达的基因 而保留二者之间差异表达的基因 原理 一种细胞的总 mRNA 反转录制备的 cDNA 与另一细胞的总 mRNA 混合形成 cDNA RNA 杂交 分子通过羟基磷灰石柱被扣除 未杂交的单链 cDNA 流出柱子外 其对应 的低丰度 mRNA 得以克隆 11 如何以E coli质粒DNA为载体克隆一个编 码动物激素的基因并使之在E coli中进行表达 简要说明实验中可能遇到 的问题及可能的解决办法 要使动物中编码激素的基因在大肠杆菌中表 达 通常遇到的问题有 1 细菌的RNA聚合酶不能识别真核生物的启动子 2 大多数真核基因有内含子 这些内含子在转录后从前体mRNA中被切 除而形成成熟mRNA 细菌细胞没有这样的机制来去除内含子 3 有些真 核生物的蛋白质是通过前体分于加工而来的 例如胰岛素就是通过加工 去除前体分子内部的33个氨基酸残基而来 剩下的两段肽链分别形成胰 岛素的a b链 4 产生的真核生物的蛋白质产物可以被细菌的蛋白酶所识 别和降解 针对上述可能出现的问题 建议在克隆的过程中采取以下措施 应将激 素的编码序列置于含有核糖体结合位点和起始密码子ATG的细菌强启动 子的附近 可以以激素的mRNA为模板用反转录酶合成激素的基因 这种 DNA不含内含子可插入到载体中进行克隆 此外 如果蛋白质序列短则可 通过化学合成得到该基因 合成的基因应含起始密码ATG 通过该激素蛋 白的氨基酸序列推测而来的编码序列 以及1 2个终止密码 ATG 编 码序列 TGATAG 现在 这个合成基因可被插入载体中 有时加工过 程可以在离体条件下进行 如果加工有困难 可以用合成基因 从而免除加 工过程 选用合适的突变型宿主从而防止蛋白酶水解 如果用酵母作为 宿主上述许多问题都可以较容易地解决 尤其是现在有既能在大肠杆菌 中又能在酵母中复制的穿梭质粒载体 基因组文库 构建文库的要求 1 DNA的纯度要比较高 如果DNA含杂质多 会严重影响后面的内切酶消 化 2 要求制备的DNA片段要达到50 100kb 然后用内切酶切成10 20kb的片段 以保证基因的完整和基因两端有内切酶位点 切割后出现粘 性末端 便于连接 3 要求有较大数量的克隆 才能保证每一个基因都包含 在文库中 25 建立cDNA文库的步骤答 细胞总RNA的制备及mRNA的分 离 cDNA第一条链的合成 双链cDNA的合成 双链cDNA与载体的连 接和噬菌体颗粒的包装及感染宿主细胞 通过一系列酶催化作用 Poly A mRNA转变成双链cDNA群体并插入到适当的载体分子上 转化大肠杆菌 寄主细胞 构成包含所有基因编码序列的cDNA基因文库 第六章1 重组DNA导入真核细胞1 重组DNA导入酵母菌细胞 1 原生质 体转化法 早期酵母菌的转化都采用在等渗缓冲液中稳定的原生质体转 化法 在Ca2 和PEG的存在下 转化细胞可达原生质体总数的1 2 但该程 序操作周期长 而且转化效率受到原生质再生率的严重制约 原生质体转 化法的一个显著特点是 一个受体细胞可同时接纳多个质粒分子 而且这 种共转化的原生质体占转化子总数的25 33 2 碱金属离子介导的酵母 菌完整细胞的转化 酿酒酵母的完整细胞经碱金属离子 如Li 等 PEG 热休克处理后 也可高效吸收质粒DNA 而且具有下面的特性 吸收 线性DNA的能力明显大于环状DNA 两者相差80倍 共转化现象极为罕见 3 酵母菌电击转化法 酵母菌原生质体和完整细胞均可在电击条件下吸 收质粒DNA 但在此过程中应避免使用PEG 它对受电击的细胞具有较很 大的负作用 电击转化的优点是不依赖于受体细胞的遗传特征及培养条 件适用范围广 而且转化率可高达105 mg DNA 2 如何将一平末端的 DNA片段与EcoRI形成的黏性末端连接 答 平末端可调整反应条件用 DNA连接酶实现片段之间的连接 非互补的粘性末端的连接须修饰成平 端 再按平端连接法连接1 同聚物加尾法 利用末端转移酶可催化dNTP加 到ssDNA或dsDNA 3 OH 在外源DNA和载体3 末端加上互补的同聚物 尾巴 2 衔接物连接法 3 接头分子连接法 将具有平末端的外源DNA片段 与人工接头分子在T4 DNA连接酶的作用下连接起来 然后与具有同样粘 性末端的载体DNA分子在T4 DNA连接酶作用下连接成重组体 我以为以 上方法皆可 也可将粘性末端平移成平末端 3 通过插入失活可以初步筛 选重组子 但筛选到的克隆是否插入了正确的片段 还需要进一步的鉴定 鉴定的方法主要有哪几种 答 1 限制性内切酶法 外源片段通过特定的 酶切位点插入到载体上 因此 可以通过这些限制性酶酶切重组质粒 电泳 分析插入片段长度是否正确 2 PCR法 如果已知插入DNA片段的某些序 列 就可以通过PCR的方法进行鉴定 3 菌落原位杂交法 4 基因产物检测 法 如果使用的是表达载体 那么就可以通过鉴定基因产物的方法鉴定正 确的克隆 4 在重组DNA操作中为了提高连接效率常常将非互补的黏性 末端修饰成平末端之后再进行连接 请问将黏性末端变为平端的方法有 哪些 答 1 5 突出粘性末端的补平 一般选择大肠杆菌DNA聚合酶I的 Klenow大片段聚合酶进行填补 2 3 突出粘性末端的切平 一般使用T4噬 菌体DNA聚合酶或单链DNA的S1核酸酶切平 变成平末端之后 同样可用 DNA连接酶进行有效的连接 27 重组DNA导入原核细胞 大肠杆菌 的方 法 CaCl2法制备感受态细胞 电转化法 PEG介导的原生质体转化法 结合转化法28 重组DNA导入真核细胞 酵母菌细胞 的方法与特点 重 组DNA导入酵母菌细胞 特点是 一个受体细胞可同时接纳多个质粒分子 而且这种共转化的原生质体占转化子总数的25 33 碱金属离子介导 的酵母菌完整细胞的转化 特点 吸收线性DNA的能力明显大于环状DNA 两者相差80倍 共转化现象极为罕见 酵母菌电击转化法 优点是不依赖 于受体细胞的遗传特征及培养条件适用范围广 而且转化率可高达105 mg DNA 29 重组DNA导入植物细胞的方法 原生质体转化法 聚乙二醇 PEG 法 宿主细胞为原生质体比较适宜 电击穿孔法 操作简便 导入效 率较高 基因枪法 优点可用于愈伤组织 叶片 茎尖等组织的转化 而 不必是原生质体 缺点是转化率不高 花粉管通道法 可避免植物组织培 养步骤 超声波法 农杆菌介导法 利用农杆菌T DNA可自动转移并整 合到植物细胞基因组中的特性 将外源目的基因导入植物细胞的方法 30 重组DNA导入动物细胞的方法1 显微注射法2 逆转录病毒法3 胚胎干细 胞法 优点是通过同源重组构建的转染能够进行打靶即在体外就能确定 整合的位点 克服了显微注射无法解决的随机整合问题 第七章 一 真核生 物基因表达载体的组成特征 原核DNA序列 包括能在大肠杆菌中复制 的Ori以及便于筛选的细菌抗生素抗性基因和便于目的基因插入的多克 隆位点MCS 启动子与增强子 启动子分为组成型启动子 组织特异性启动子 诱导型启动子 增强子对于异源启动子控制下的 外源基因也具有增强转录的作用 因此 启动子和增强子的联合使用可大 大提高外源基因的转录水平 大多数增强子具有组织特异性 在构建表达 载体时使用宿主细胞相应组织部位的增强子以激活外源基因的表达 提 高表达效率 终止子 不同来源的终止子对外源基因的表达有很大 影响 它不仅决定外源基因转录活性也决定mRNA在细胞中的稳定性 从 而影响mRNA的翻译 内含子剪接信号 虽然许多基因的的cDNA转入哺 乳动物细胞后 其表达不受有无内含子的影响 有些基因的表达需要内含 子的存在 一般来说 在哺乳动物细胞的表达载体中最好有一段内含子序 列包括剪接信号以提供外源基因cDNA表达的需要 polyA加尾信号 polyA可防止核酸酶对mRNA 3 末端的降解 增加mRNA在细胞中的稳定 性 RNA聚合酶II 穿过poly A位点 直到成熟mRNA 3 端的下游才终止转 录 当表达载体缺少poly A位点的序列时 外源基因的表达下降10倍以 上 选择标记基因与报告基因 在选择压力下 选择标记基因可以使少量 的转化细胞从未转化的细胞中分离出来 但选择标记基因的应用也有其 自身无法克服的缺陷 2 启动子和增强子的异同点 启动子 是RNA聚合酶 识别和结合的一段DNA序列 位于基因的上游 是基因表达调控的重要顺 式元件 具有以下特征 序列特异性 方向性 位置特异性 种属特 异性增强子 enhancer 是能够增强启动子转录活性的一段DNA序列 由多 个元件组成 每一个元件可以与一种或多种转录调控因子结合 特点 双向 作用 无位置效应 提高转录效率 远距离起作用 组织特异性 可能特定组 织才有识别并结合的反式作用因子 无基因特异性 同源基因异源基因均 可 3 影响外源基因表达的因素有哪些 它们是如何影响外源基因表达 的 一 阅读框架对转化基因的影响 阅读框架是基因的编码区 包含从 ATG到TAA之间的cDNA序列 外源基因的编码区只有与表达载体DNA的 起始密码子相吻合时才能正确的翻译出蛋白质 二 基因表达的调控元件 包括启动子 增强子 沉默子 终止子和衰减子 三 翻译过程对基因表 达的影响 影响因素包括翻译起始区 密码子 起始和终止 mRNA的二 级结构 四 表达系统对基因表达的影响 外源基因表达系统泛指目的基因 与表达载体重组后 导入合适的受体细胞并能在其中表达 产生目的基因 产物 目的蛋白 因此表达载体和受体细胞共同组成了外源基因的表达系 统 外源基因的表达除受到表达载体的影响外 还受到受体细胞生长特 性 表达水平 翻译后修饰及生物活性物质形成等影响 4 大肠杆菌作为 外源基因表达系统有哪些优缺点 答 优势 遗传背景清楚 全基因组测序 共有4405个开放型阅读框架 繁殖迅速 培养简单 操作方便 遗传稳 定 基因克隆表达系统成熟完善 目标基因表达水平高 代谢途径和基因表 达调控机制比较清楚 缺点 缺乏对真核生物蛋白质的复性功能 缺乏对真 核生物蛋白质的修饰加工系统 内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异 源蛋白 细胞周质内含有种类繁多的内毒素5 真核生物表达载体通常需 要哪些构件 各构件的作用是什么 答 1 原核DNA序列 包括能在大肠 杆菌中复制的Ori以及便于筛选的细菌抗生素抗性基因和便于目的基因 插入的多克隆位点MCS 2 启动子与增强子 增强子对于异源启动子控制 下的外源基因也具有增强转录的作用 因此 启动子和增强子的联合使用 可大大提高外源基因的转录水平 3 终止子 不同来源的终止子对外源基 因的表达有很大影响 它不仅决定外源基因转录活性也决定mRNA在细胞 中的稳定性 从而影响mRNA的翻译 4 内含子剪接信号 虽然许多基因的 的cDNA转入哺乳动物细胞后 其表达不受有无内含子的影响 有些基因的 表达需要内含子的存在 一般来说 在哺乳动物细胞的表达载体中最好有 一段内含子序列包括剪接信号以提供外源基因cDNA表达的需要 5 polyA加尾信号 polyA可防止核酸酶对mRNA 3 末端的降解 增加mRNA 在细胞中的稳定性 6 选择标记基因 只有采取有效的筛选方法 才能高效 准确地将少量的转化子从大量未转化细胞中分离出来 一般情况下 载体 上携带的选择基因可供细胞筛选使用 第九章 1 植物 动物转基因的方法 及其各自的特点 动物转基因有 1 显微注射法2 逆转录病毒法3 胚胎干细 胞法4 体细胞核移植法2 构建了基因文库后 有哪些方法可以筛选或鉴定 出哪一个克隆可能含有目的基因 答 1 表型筛选法 是在宿主菌 大肠杆 菌 中表达目的基因 使宿主产生新的表型或使宿主恢复其突变基因的表 型来筛选目的基因 2 用核酸探针筛选目的cDNA 基因 对欲克隆的基因 序列了解时 以目的基因的部分序列 DNA片段 制备探针 对文库进行筛 选 3 免疫筛选 抗体筛选 目的基因 如果能够得到目的基因产物的抗体 就可以通过免疫学的方法来筛选目的基因 其使用的探针不是核酸 而是 特异性抗体 4 利用数据库鉴定基因 将DNA序列输入GenBank与已知的 基因序列进行比较 5 酵母双杂交系统鉴定基因 是根据真核生物转录调 控特点创建的一种体内鉴定基因的方法 其筛选的基因不是 探针 的直接 编码产物 而是能够与其相互作用的蛋白质的编码基因 即筛选与已知基 因产物发生相互作用的蛋白的编码基因 3 在构建cDNA克隆之前 可以用 差示杂交 来富集一特殊的核苷酸序列等 做法是 用来自能够产生目的蛋 白的细胞mRNA分子同来自于另一类型细胞 不产生这种蛋白质但亲缘 关系密切 的过量mRNA分子杂交 4 在基因工程中 为了在细菌细胞中表 达真核生物的基因产物 为什么通常要用cDNA而不用基因组DNA 为什 么要在cDNA前加上细菌的启动子 答 原核生物一般不含内含子 在原核 细胞中缺乏真核细胞的转录后加工系统 当克隆的含有内含子的真核基 因在原核细胞中转录成mRNA前提后 其中内含子部分不能被切除 所以 在原核细胞中表达真核基因时不能用基因组DNA 而用cDNA 原核生物 只有一种RNA聚合酶 识别原核生物的启动子 催化所有RNA的合成 不能 识别真核生物的启动子 5 外源基因在大肠杆菌 原核细胞 中高效表达的 策略1 有效的转录起始2 mRNA的有效延伸和转录终止3 翻译水平的优化 4 提高表达质粒 或载体 的拷贝数及稳定性5 提高外源蛋白的稳定性6 外 源基因在酵母菌 真核细胞 中的表达优势答 完成全基因组测序 基因表 达调控机理比较清楚 大规模发酵历史悠久 技术成熟 工艺简单 成本低廉 能将外源基因表达产物分泌至培养基中 具有原核细菌无 法比拟的真核蛋白翻译后加工系统 不含有特异性的病毒 不产内毒 素 被认定为是安全的 酵母菌是最简单的真核模式生物7 天然的Ti质粒不 能作为表达载体使用的原因 答a 植物转化细胞产生大量的生长素和分 裂素 阻止了生长在培养基上的细胞再生长为整株植物 因此 必须除去生 长素和分裂素基因 b 有机碱的合成与T DNA的转化无关 而且会影响植 物细胞生长 因为有机碱合成大量消耗精氨酸和谷氨酸 因此必须去除有 机碱合成基因 tmt c Ti质粒过大 重组操作非常困难 也很难找到单一的 酶切位点 d Ti质粒不能在大肠杆菌中复制 8 运用所学知识制备胰岛素 答 选定具有免疫原型的胰岛素基因片段 将其插入表达载体 并引入到与 表达载体相应的宿主细胞 构成重组体 重组体在合适的环境下培养 就可 以表达 加工 生产出胰岛素 大肠杆菌制备胰岛素 胰岛素A B链的 基因序列分开导入大肠杆菌 发酵后收集A B链 通过体外将A B链用 二硫键连接起来成为有活性的胰岛素 酵母制备胰岛素 胰岛素A B链 不用分开 可以一起导入酵母中 酵母可以利用真核蛋白翻译后加工系统 形成有活性的胰岛素 并可以将胰岛素分泌到体外 9 与基因文库相 比 cDNA 克隆的主要优点与缺点有 优点 cDNA 克隆以mRNA 为材料 特别适用于某些RNA 病毒等的基因组结构研究及有关基因的克隆分 离 cDNA 基因文库的筛选比较简单易行 每一个cDNA 克隆都含有 一种mRNA 序列 这样在目的基因的选择中出现假阳性的概率就会比较 低 由此选择出来的阳性克隆将会含有目的基因 cDNA 克隆可用于在 细菌中能进行表达的基因克隆 直接应用于基因工程操作 cDNA 克隆 还可用于真核细胞mRNA 的结构和功能研究 缺点 cDNA 文库所包含 的遗传信息要远远少于基因组DNA 文库 并且受细胞来源或发育时期的 影响 cDNA 基因文库不能直接获得基因的内含子序列和基因编码区外 大量的调控序列的结构与功能方面的信息 在cDNA 基因文库中 对于 低丰度mRNA 的cDNA 克隆所占的比例则比较低 且分离也就比较困难 10 抗除草剂植物作用机制 磷丝菌素食一种除草剂 可抑制植物谷氨酰胺 合成酶的活性 发生致死性累计 bar基因编码磷丝菌素乙酰转移酶 使磷丝 菌素乙酰化而失去毒性 抗除草剂植物可以导入bar基因 可以破坏磷丝菌 素的活性 而达到抗除草剂的作用 另一种方法 可以采用认为措施使植物 谷氨酰胺合成酶基因的活性提高 而大量表达谷氨酰胺合成酶 使磷丝菌 素无法抑制住大量的谷氨酰胺合成酶的活性 而达到抗除草剂的作用 11 碱变性抽提法提取质粒DNA 的基本原理是 碱变性抽提法是基于染 色体DNA 与质粒DNA 的变性与复性的差异而达到分离目的 在pH 高达 12 6 的碱性条件下 染色体DNA 的氢键断裂 双螺旋结构解开而变性 质粒 DNA 的大部分氢键也断裂 但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完 全分离 当以pH4 8 的NaAc 高盐缓冲液调节其pH 至中性时 变性的质粒 DNA 又恢复原来的构型 保存在溶液中 而染色体DNA 不能复性而形成 缠连的网状结构 通过离心 染色体DNA 与不稳定的大分子RNA 蛋白 质 SDS 复合物等一起沉淀下来而被除去 12 PCR 引物设计时需要注意哪 些基本原则 引物长度以20 30bp 为宜 过长过短都会降低特异性 而且 过长会增加成本 引物碱基要随机分布 避免出现嘌呤或嘧啶堆积现 象 G C 含量为45 55 左右 引物内部不应含有回文结构 两个引物之 间尤其是3 端不应有互补链存在 引物的碱基顺序不应与非扩增区有同 源性 引物3 末端碱基原则上要求与模板DNA 配对 引物5 末端允许 有几个碱基不与模板DNA 匹配而呈游离状态 这不影响扩增的特异性 引物的5 端一般加有适当限制性核酸内切酶的识别序列 便于克隆和表 达 但其保护碱基有一定的要求 13 T4 DNA 连接酶作用机制及提高平末端连接效率的方法 T4 DNA 连接 酶的作用机制 ATP DNA ligase E E AMP PPi E AMP 上的AMP 转移到DNA 的5 磷酸根上 使其活化 释放出酶 活化的5 磷酸根与相邻 的3 羟基形成3 5 磷酸二酯键 并释放出AMP 提高平头末端连接效率的 方法包括 加大连接酶用量 10 倍大于粘性末端的连接 加大平头末 端底物的浓度 增加分子间碰撞机会 加入10 PEG8000 促进大分子之 间的有效作用 加入单价阳离子 NaCl 最终浓度150 200 mmol L 14 简述PCR 技术的基本原理 变性 通过加热使DNA 双螺旋的氢键断 裂 双链解离形成单链DNA 退火 当温度突然降低时由于模板分子结构 较引物要复杂得多 而且反应体系中引物DNA 量大大多于模板DNA 使引 物和其互补的模板在局部形成杂交链 而模板DNA 双链之间到互补的机 会少 延伸 在DNA 聚合酶和4 种脱氧核糖核苷酸底物及Mg2 存在条件 下 5 3 的聚 合酶催化以引物为起点的DNA 链延伸反应 以上3 步为一 个循环 每一循环的产物可以作为下一个循环的模板 数小时后 介于两 个引物之间的特异性DNA 片段得到了大量复制 数量可达2 106 7 拷贝 15 简述影响 型限制性核酸内切酶活性的因素有 DNA 样品的纯 度 DNA 样中混有蛋白质 苯酚 氯仿 乙醇 EDTA SDS NaCl等 都有可能抑制酶活性 可采用以下方法 提高酶活性 加大酶的用量 1 g DNA 用10U 酶 加大反应总体积 延长反应时间 DNA 样品的甲基化 程度 采用去甲基化酶的大肠杆菌菌株来制备质粒DNA 可防止DNA的甲 基化 酶切反应的温度 多数标准反应温度是37 如SmaI 为25 或 30 SfiI 为50 反应温度过度或过低都会影响酶活性 甚至导致酶失 活 DNA 分子结构 某些酶切割超螺旋质粒DNA 时 酶量比切割线性 DNA 时高出多位 可高达20 倍 核酸内切酶的缓冲液 高浓度的酶 高 浓度的甘油 低离子强度 极端pH 值等 会使一些核酸内切酶的识别和 切割序列发生低特异性 即所谓的 星活性 现象 16 简述琼脂糖凝胶电泳 的基本原理 DNA 分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效 应 DNA 分子在高于等电点的pH 溶液中带负电荷 在电场中向正极移动 由于糖 磷酸骨架在结构上的重复性质 相同数量的双链DNA 几乎具有 等量的净电荷 因此它们能以同样的速度向正极方向移动 在一定的电场 强度下 DNA 分子的迁移速度取决于分子筛效应 即DNA 分子本身的大 小和构型 在琼脂糖凝胶电泳中 DNA 分子的迁移速度与相对分子质量的 对数值成反比关系 质粒DNA 样品用单一切点的酶切后与已知相对分子 质量大小的标准DNA 片段进行电泳对照 观察其迁移距离 就可获知该样 品的相对分子质量大小 凝胶电泳不仅可以分离不同相对分子质量的 DNA 也可以鉴别相对分子质量相同但构型不同的DNA 分子 另外在制备 琼脂糖凝胶时加入溴化乙锭指示剂 溴化乙锭在紫外光照射下能发射荧 光 当DNA 样品在琼脂糖凝胶中电泳时 琼脂糖凝胶中的EB 就插入DNA 分子中形成荧光络合物 使DNA 发射的荧光增强几十倍 荧光的强度正比 于DNA 的含量 如将已知浓度的标准样品作琼脂糖凝胶电泳对照 就可比 较出待测样品的浓度 若用薄层分析扫描仪检测 只需要5 lOng DNA 就 可以从照片上比较鉴别 如用肉眼观察 可检测到0 01 0 1 g 的DNA 12 什么是限制性内切核酸酶的星号活性 受哪些因素影响 类限制酶 虽然识别和切割的序列都具有特异性 但是这种特异性受特定条件的限 制 即在一定环境条件下表现出来的特异性 条件的改变 限制酶的特异性 就会松动 识别的序列和切割都有一些改变 改变后的活性通常称第二活 性 而将这种因条件的改变会出现第二活性的酶的右上角加一个星号表 示 因此第二活性又称为星活性 概括起来 诱发星活性的因素有如下几种 1 高甘油含量 5 v v 2 限制性内切核酸酶用量过高 100U g DNA 3 低离子强度 25 mmol L 4 高pH 8 0 以上 5 含有有机溶剂 如DMSO 乙醇等 6 有非Mg2 的二价阳离子存在 如 Mn2 Cu2 C02 Zn2 等 17 简述Sanger 双脱氧链终止法的基本原理 在模板指导下 DNA 聚合酶 不断将dNTP 加到引物的3 OH 末端 使引物延长 合成出新的互补的 DNA 链 如果加入双脱氧三磷酸核苷 ddNTP 由于双脱氧核糖的3 位置 上缺少一个羟基 故不能同后续的dNTP 形成磷酸二酯键 即形成一种全部 具有相同5 引物端和以ddNMP 残基为3 端结尾的一系列长短不一片段 的混合物 由于双脱氧核苷酸在每个DNA 分子中掺入的位置不同 采用聚 丙烯酰胺凝胶电泳区分长度差一个核苷酸单链DNA 从而读取DNA 核苷 酸序列 18 什么是细菌的限制 修饰系统 有什么意义 细菌中有作用于 同一DNA 的两种酶 即分解DNA 的限制酶和改变DNA 碱基结构使其免 遭限制酶分解的修饰酶 而且 这两种酶作用于同一DNA 的相同部位 把这 两种酶所组成的系统称为限制与修饰系统 不同种的细菌或不同的细菌 菌株具有不同的限制酶和修饰酶组成的限制与修饰系统 修饰的本质是 通过甲基化酶将DNA 中某些碱基进行甲基化修饰 由于宿主自身DNA 上 的这些位点进行了修饰 限制酶就不能进行切割 由于外来的DNA 在相应 的碱基上没有被甲基化 宿主的限制酶通过对该位点的识别来分辨敌我 并将人侵的外来DNA 分子降解掉 所以DNA 限制作用和修饰作用为细胞 提供了保护 选择或填空6 基因克隆的目的是 获得目的基因片断 常用的方法有 功能 克隆 表型克隆