（微生物学专业论文）产菊粉酶酵母菌的筛选、产酶条件及酶学性质研究.pdf

附件一 原创性声明 本人郑重声明 所呈交的学位论文 是本人在导师的指导下 独立进 行研究所取得的成果 除文中已经注明引用的内容外 本论文不包含任何 其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果 对本文的研究作出重要贡 献的个人和集体 均已在文中以明确方式标明 本声明的法律责任由本人 承担 论文作者签名 王趣适 日 期 塑塑 堕 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留 使用学位论文的规定 同意学校保 留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版 允许论文被查阅 和借阅 本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关 数据库进行检索 可以采用影印 缩印或其他复制手段保存论文和汇编本 学位论文 保密论文在解密后应遵守此规定 论文储虢皿翩躲避日 期 塑 二 山东大学硕士学位论文 摘要 以菊粉作为唯一碳源 从确芋产地土壤和水果表皮上筛选到产菊粉酶的酵母 菌2 9 株 经摇瓶发酵法进行复筛 测定其发酵液酶活和上清液酶活 表明筛选得 到的酵母菌的菊粉酶主要分布在细胞壁和 或细胞内 很少分泌到胞外 在所得 2 9 株酵母菌中 酵母菌y 9 的发酵液酶活最高 通过对酵母菌y 9 形态学和生 理学以及b i o l o g 自动微生物鉴定系统进行鉴定 确定其为浅白隐球酵母 c y p t o c o c c u sa l b i d u s 以c y p t o c o c c u sa l b i d u s 为出发菌株 通过中因素分析测定和优化了该菌 株的产酶条件 研究了发酵液不同碳源 不同氮源 不同初始p i i 添加不同的 金属化合物 添加不同的表面活性剂以及不同通气量等因素对酵母y9 菌株产酶 的影响 并且对产酶的进程进行了初步研究 研究结果表明 酵母菌y 9 菌株菊 粉酶产生的优化发酵培养基为 菊粉2 牛肉浸膏0 5 n h 4 h p o 0 5 m g s o 7 h 2 05 r e t o o l l p h5 6 研究表明酵母菌y 9 产生的菊粉酶主要分布在细 胞壁和 或细胞内 只有约2 0 的菊粉酶分泌到细胞外 菊粉酶的合成进程试验 表明 再 j j 述优化条件下 发酵2 4 小时后 发酵液总酶活和胞外酶活就可以达到 最高 而菌体酶活则在2 4 小时后确m 犟的趋势 刺 a l b i d u s 菊粉酶粗酶液的基本性质进行了研究 结果表明 该酶的反 应最适温度为5 5 最适p h 为5 0 温度稳定性不高 在p h4 o 一5 0 环境中 菊粉酶活和蔗糖酶活都较高 p h 稳定性较好 分别以2 的菊粉和蔗糖为底物测 定酶活 结果表明 酶液i s 的比值为0 9 6 这说明酶液作用以外叨酶为主 同时研究了酶液对不同菊粉的降解率 结果表明 酶液对不同来源的菊粉的降解 率不同 从2 5 到6 5 不等 对酶解产 物进行了薄层层析 结果表明 酶解产 物以果糖为主 同时有少量的低聚寡糖产生 关键词 菌种筛选菊粉酶浅白隐球酵母发酵条件优化酶学性质 山东大学硕士学位论文 a b s t r a c t 2 9y e a s ts t r a i n s p r o d u c i n gi n u l i n a s e sw e r es c r e e n e da n di s o l a t e d o nt h em e d i a t h a ti n u l i nw a st h e o n l yc a r b o ns o u r c e s t h ei n u l i n a s e sa c t i v i t i e si nt h ef e r m e n t a l l i q u i d so f t h es t r a i n sw e r em e a s u r e dt h er e s u l t ss h o w nt h a t1 1 1 0 8 1 i n u l i n a s ea c t i v i t i e s f r o mt h e s es t r a i n sw e r eb e i n gd i s t r i b u t e dw i t h i nc e l lw a l l a n dal i t t l ew e r es e c r e t e d o u t s i d et h ec e l lt h es t r a i ny 9h a dt h eh i g h e s te n z y m ea c t i v i t ya m o n g2 9s t r a i n s a n d w h i c h w a si d e n t i f i e da s c y p t o c o c c u s a l b i d u s b yt a x o n o m y 0 1 2 m o r p h o l o g y p h y s i o l o g ya n dt h ei d e n t i f i e ds y s t e mo f a u t o m a t i cm i c r o o r g a n i s mo f b i o l o g t h ei n f l u e n c e so np r o d u c i n gi n u l i n a s e sw i t hd i f f e r e n tc a r b o ns o u r c e s n i t r o g e n s o u r c e s i n i t i a lp h m e t a lc h e m i c a lc o m p o u n da n ds u r f a c t a n tr e a g e n tw e r es t u d i e d t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h e o p t i m u mf e r m e n t i o n c o n d i t i o n sf o rt h es t r a i ny 9 i n c l u d e di n u l i n2 b e e fe x t r a c to5 0 z 4 4 2 p 0 4o5 m g s 0 4 7 h 2 05 m m o l l p h5 6 m o s ti n u l i n a s ea c t i v i t i e s m o r et h a n8 0 o fs t r a i ny 9w e r ed i s t r i b u t e d w i t h i nc e l l w a l l l e s st h a n 2 0 w e r es e c r e t e do u t s i d et h ec e l l t h e p r o c e s s o f i n u l i n a s e sp r o d u c e db yt h es t r a i ny 9s h o w e dt h a tt h ee n z y m ea c t i v i t i e si nf e r m e n t i o n l i q u i da n ds u p e r n a t a n tc a n r e a c ht om a x i m u ma f t e r2 4h o u r s t h ee n z y m a t i cc h a r a c t e r so ft h ec r u di n u l i n a s e sf r o my 9w e r es t u d i e dt h e r e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h eo p t i m a lt e m p e r a t u r ea n dp hw a s5 5 a n d5 0 r e s p e c t i v e l y t h e e n z y m ew a su n s t a b i l i t y a tm o r et h a n5 0 c a m o n gp h4 0 50 t h e e n z y m e a c t i v i t i e sf o ri n u l i na n ds a c c h a r o s ew e r eh i g h e s ta n ds t a b l et h eh y d r o l y s i sr a t e s r a n g e d f r o m2 5 t o6 5 f o ri n u l i n s a m p l e s f r o md i f f e r e n ta r e a st h er a t i oo f e n z y m e s i s i s09 6 w h i c hi n d i c a t st h a t t h ei n u l i n a s e sf r o mca l b i d u sw e r ea n e x o i n u l i n a s e a n dt h ep r o d u c t sw e r em a i n l yf r u c t o s ea n dal i t t l e o fo l i g o s a c c h a r i d e s h o w e da f t e rc h r o m a t o g r a p h yo nt h es i l i cg e lp l a t e s k e y w o r d s s c r e e n i n g a n d i s o l a t i n g i n u l i n a s e c y p t o c o c c u s a l b i d u s c o n d i t i o no p t i m i z a t i o n e n z y m a t i cc h a r a c t e r s 2 山东大学硕士学位论文 剐看 箱粉又称菊粉 土木香粉 凶其最早从菊科植物中分离出而得名 广泛存 在于菊芋 菊苣等多种植物体内 是一种水溶性的功能性多糖 目前在美国 英 国等国家被认为是一种安全的食品配料 菊粉是由具有呋哺构型的d 一果糖通过 p 一2 l 糖苷键连接而成的寡糖或多糖 末端带有一葡萄糖残基 每条链含2 5 3 0 个果糖单位 分子量大约为3 0 0 0 5 0 0 0 链长因植物种类 生长期 气候及土壤 条件的不同而不同 陈晓明 2 0 0 0 菊粉通过酸解或酶解可制备高果糖浆 h ig h f r u c t o s es y r u p 简称h f s 或低聚果糖 f r u c t o o l i g o s a c c h a r i d e 简称f o s h f s 及f o s 用途广泛 市场潜力巨大 水解菊粉的酶称为菊粉酶 i n u l i n a s e 菊粉酶的主要来源是酵母和丝状 真菌 目前已有数十种不同来源的菊粉酶得到了纯化 陈冠军 1 9 9 7 菊粉酶是 菊粉深加工过程中广泛应用的酶制剂 菊粉的酶解产物果糖和低聚果糖是重要的 工业原料 且利用菊粉酶法从菊粉生产果糖比酸解法具有优越性 因此 开展高 产菊粉酶微生物筛选及微生物菊粉酶酶学性质研究具有重要意义 1 菊粉的理化性质及其加工应用 1 1 菊粉及其生理功能 菊粉作为一种天然功能性食品配料 其所发挥的巨大保健作用及食品品质 改良作用l e 逐渐得到体现 候东军 2 0 0 3 生产 并在国外得到广泛的推广应用 我国菊芋资源t 分丰富 菊芋干物质中菊粉含量在7 0 以l 从菊芋中提取分 离菊粉是开发天然菊粉资源的重要途径 预处理过的菊芋经热水抽提 活性炭脱 色 s e v a g 法去除蛋白 乙醇沉淀 真空干燥可得菊粉 进 步经离子交换层析 和凝胶过滤层析可得到高纯度的菊粉 目前 对菊粉的最成功的利用 就是以此 为原料 通过酸解或酶解制备h f s 其中果糖含量可达7 5 以上 而利用内切 菊粉酶法可生产低聚果糖 饶志娟 2 0 0 2 山东大学硕士学位论文 8 0 年代初 国外对菊粉研究多以生产h f s 为主 其中以欧d i l l u 日本的研究 最为深入 近几年国内外对菊粉的研究主要集中在菊粉水解产物f o s 的生产工艺 及生理功能上 利用内切菊粉酶法生产f o s 若以纯菊粉为原料并对其酶解粗产 物进行分离处理 则所得产物中f o 含量可达9 3 以上 张苓花 2 0 0 1 综合国内外已有的研究发现 菊粉及f o s 具有以下几方面的生理功能 孙纪 录 2 0 0 3 k e l l y q u a g l i a na 2 0 0 3 m o r t e n s e n 2 0 0 2 m e n d o z a 2 0 0 2 g o e c k n c r 2 0 0 1 l 促进人体消化道内的双歧杆菌的增殖 抑制沙门氏菌及其它有害细菌的 繁殖 增加维生素的合成量 提高人体的抗病能力和免疫力 对老年人有较好的 抗衰老作用 2 菊粉 低聚果糖由于具有水溶性膳食纤维的功能 食物中的菊粉及其产 物具有促进肠胃蠕动 预防便秘的作用 与其它膳食纤维一样 低聚果糖也能降 低血脂 改善脂质代谢 降低血液中的胆固醇和h 油三脂的浓度 使体内低密度 脂蛋白降低 却不影响高密度脂蛋白的浓度 可预防心血管疾病和肥胖病的发生 3 菊粉摄入人体后大部分不会在消化系统中分解 摄入后不会造成血糖 浓度增加 非常适合于糖尿病患者食用 只在结肠中部分发酵 产生较低的热 量 也很少转化为脂肪 适宜用作健康减肥食品 4 菊粉及其降解产物在口腔内不被微生物利用发酵 故对牙齿没有损害 5 作为化妆品添加剂 菊粉及其水解产物可抑制皮肤表面有害细菌的繁 殖 6 作为饲料添加剂 低聚果糖对家禽 家畜有对人同样的生理功能 是 功能性饲料添加剂 被称为原生素 p r e b i o t i c se l e i n e n t 可以显著提高饲料 转化率和动物机体的健康水平 使动物的生长速度明显提高 7 菊粉能促进人或动物大肠和骨组织列c a 2 m g 的吸收 提高骨密度 此外 菊粉在食品的品质改良 提高食品稳定性 防冻 抗老化等方而也 具有显著的作用 菊粉生理功能的多样性暗示其具有良好的开发应f l j 前景 山东大学硕士学位论文 1 2 菊粉及其水解产物的理化性质 1 2 1 菊粉的性质 孙纪录 2 0 0 3 严慧如 2 0 0 1 1 水溶性 菊粉微溶于冷水 在热水中易溶 菊粉溶解度随温度的升高而 增加 t 0 c 刚溶解度为6 9 0 时约为3 5 2 溶液粘度 菊粉溶液的粘度与其在溶液中的含量密切相关 当浓度为l 一l o 时 其粘度随浓度的增加而增加 当溶解在热水中的菊粉浓度达到l l 一3 0 时 冷却3 0 6 0 m i n 司形成凝胶 随菊粉浓度增大 凝胶形成速度加快 当菊粉浓度达4 0 一5 0 时遇水立即形成凝胶 所形成的凝胶十分坚实 菊粉粘 度随温度的升高而降低 这使得它在替代食品中的糖类或脂肪时可提供理想的口 感与质地 且可籍由其粘度特性控制蛋糕和甜点之粘稠度 菊粉另一重要特性是对溶液水分活度的影响 由 j 二菊粉具有结合自由水的 能力 故可降低食品的水分活度值 从而延长食品 i 勺保质期 3 保湿性 菊粉吸湿性强 可作为食品的保湿剂控制食品湿度的变化 以 焙烤食品为例 菊粉可延缓其水分蒸发 从而阳止产品走昧 保持或延长产品的 货架寿命 4 稳定性 菊粉具有较好的热稳定性 在1 0 0 条件加热电不易降解 菊 粉溶液在高温 低p h 3 0 以下 的情况下保持一定h q 问 可能发生水解 但须 有可供利用的 自由水 因此 凝胶 沃态的菊粉即使在酸性环境或高温下 如果 没有可供利用的水仍然是稳定的 5 风味 纯的菊粉是无味的 一般商品菊粉因含有少量果糖或双糖而略带 甜味 味道中和而不具刺激性 菊粉可与高甜度 低热量甜昧剂共 j 制作低热量 甜食 l 2 2 低聚果糖的性质 张连富 2 0 0 0 l 低聚果糖的许多理化性质与蔗糖相似 如溶解度 冰点 热稳定性等 部分或全部取代蔗糖不改变蔗糖提供的优良性能 2 固体低聚果糖为无色粉末 水中溶解性好 溶液呈无色透明 在中性条 件 卜 1 2 0 c 非常稳定 在酸性 p h 3 条件下 温度达到7 0 以上 稳定性彳显 著降低 3 低聚果糖是新型的甜味剂 甜度低 纯度为5 5 6 0 的低聚果糖甜度 山东大学硕士学位论文 约为蔗糖的6 0 纯度为9 6 的低聚果糖甜度约为蔗糖的3 0 但较蔗糖甜味 清爽 4 在0 7 0 c 范围内 低聚果糖水溶液的粘度随温度的升高而下降 1 2 3 果糖的性质 张连富 2 0 0 0 屠用利 1 9 9 7 果糖无色无嗅 吸水性好 防腐效果佳 低热量 不致龋齿 具有比葡萄 糖 蔗糖明显优越的保健与营养功效 且由于其良好的食品加工性能 越来越广 泛地应用于饮料 糖果 烘焙制品等食品加工中 1 果糖作为甜昧剂 其甜度为蔗糖的1 7 3 倍 可用来部分代替蔗糖 改 变食品甜度及其风味 粘度与相同浓度的蔗糖溶液接近 易与食品混合 且增加食品味感 3 果糖溶解度高 果葡糖浆溶解度随温度上升的速度比蔗糖快 高浓度的 糖溶液具有高渗透压 高渗透压可以抑制微生物生长 从而具有防腐保鲜的作用 糖浓度在7 0 以上时才能抑制酵母和霉菌生长 果酱 蜜饯类食品加工正是利 用了糖的这种保存性质 利用糖作为食品保藏剂需要糖具有高的溶解度 单独使 用蔗糖达不到这种要求 而果葡糖浆则能达到这种溶解度要求 果糖含量4 2 的果葡糖浆浓度可达7 7 4 果葡糖浆渗透压大 果葡糖浆的主要成分是单糖 分予量小 渗透压高 应用 二蜜饯 果脯生产时可以缩短糖渍时间 比蔗糖效果好 5 果糖高温容易发生褐变 易褐变有时虽是食品加工过程需要克服的缺点 但在食品需要一定烧烤色时 完全可以利用果糖的这一特性 1 3 菊粉的深加工利用 菊粉的深加工主要是利用菊粉作为原料生产超高果糖 低聚果糖及功能性饲 料添j j i j 齐j 超高果糖 果葡糖浆按固形物中果糖的含量可分为4 2 5 5 9 0 三种 4 2 的 一般称果葡糖浆 5 5 的称高果糖浆 9 0 以上的称纯果糖浆 我图目前主要生 产含量4 2 的果葡糖浆 有部分企业生产5 5 的高果糖浆 由于技术的原因含 山东大学硕士学位论文 最超过5 5 以上的高果糖浆还没有企业能生产 国内企业多以淀粉为原制生产 果糖浆 以菊芋为原料生产该产品的还未见报道 2 菊粉低聚果糖 功能性低聚果糖包括低聚甘露醇 低聚异麦芽糖醇 低聚葡萄糖 低聚术 糖 壳聚糖 海藻糖 低聚果糖等 由于是双岐杆菌增殖因子 近年来发展速度 很快 我国主要是以蔗糖为原料生产低聚蔗果糖 产品巾除低聚果糖外 其余为 葡萄糖 若以菊芋为原料生产低聚果糖 含量在5 0 左右 其余大部分为果糖 3 功能性饲料添加剂 采用生物工程技术利用酶部分水解菊粉生成低聚糖后 不需经过后处理 直接喷雾干燥制成粉剂 作为功能性饲料添加剂 具有相同的增殖双岐杆菌 增 加家禽 抗病能力功效 被称为原生素 国内曾有在产蛋鸡饲料中添加低聚果糖 生产无沙门氏杆菌鸡蛋的报道 2 菊粉酶的性质及其应用 2 1 菊粉酶的来源 生产及其催化活性 菊粉酶来源广泛 自然界中的许多植物 动物消化道都可合成分泌菊粉酶 但工业用菊粉酶大都米源于微生物 微生物来源的菊粉酶酶种类多 热稳定性好 适于发酵生产 据不完全统计 目前己知产菊粉酶的丝状真菌有1 7 属5 0 余种 酵母菌有l o 属2 0 余种 细菌有l o 属2 0 余种 林晨 2 0 0 0 目前国内外学者 正致力于新的产酶菌种筛选以及对现有产酶菌种的突变研究 新的产酶菌种 株 将会不断被发现 多数微生物来源的菊粉酶为外切菊粉酶 且常常具有转化酶活 力 菊粉酶是一类能够水解菊粉的酶的总称 根据其在生物体内存在的部位是 细胞内还是细胞外 可将该酶分为胞内酶和胞外酶 它们的比例主要受菌种 碳 源 温度 p h 的影响 根据菊粉酶作用底物方式的不同又呵将其分为内切菊粉 酶 e n d o jn u li n a s e e c 3 2 1 7 即b 一2 卜d 果聚糖水解酶 和外切菊粉酶 e x o jn u l if i a s e f c 3 2 1 3 6 即口一i 呋喃糖1 1 水解酶 通常用i s 的大小 l i j 东大学硕士学位论文 来区分这两种酶 其中i 是以菊粉作为底物时的酶活 s 是以蔗糖作为底物时的 酶活 一般认为 外切菊粉酶的i s 值低于内切菊粉酶的1 s 值 从酵母和丝状 真菌中分离的菊粉酶往往同时具有菊粉酶和转化酶的活性 由于菊粉酶的存在部位及牛物来源不同 不同实验室采用的纯化方法电不相 同 对于胞外酶 发酵液中的菊粉酶通常采用的纯化方法包括硫酸铵分级沉淀 离子交换层析和凝胶过滤层析 离子交换层析可选择性地分离外切菊粉酶和内切 菊粉酶 在n a c i 线 肚梯度洗脱过程中 一般内切菊粉酶先被洗出 而外切菊粉 酶后被洗出 a s h a r i 1 9 8 9 对于胞内酶 在进行分离纯化之前 要先进行细胞 破碎 通常采用的是超声波细胞破碎法 细胞裂解液高速离心后 上清液的菊粉 酶再通过 二述方法纯化 由于越来越多的编码菊粉酶的基因被克隆 为利用转化 大肠杆菌生产菊粉酶提供了可能 k w o n 等 2 0 0 3 将编码b a c i s 肿 肺y m m g i 2 1 外切菊粉酶基因导入大肠杆菌后实现了高效表达 利用n i 2 敖合树脂亲合 层析比较容易地纯化了带有h is t a g 的重f i b r i l 切菊粉酶 2 2 生产菊粉酶的微生物及其菊粉酶的发酵条件 能产生菊粉酶微生物种类繁多 目前研究较多的有酵母 黑曲霉 青霉 链孢霉 放线菌 枯草芽孢杆菌等 多数微生物既可合成胞内酶 又可合成胞外 酶 且多数菊粉酶同 寸具有外切菊粉酶和内切菊粉酶活性 g e r n 等 2 0 0 1 系 统研究了1 6 种真菌和3 种细菌培养条件对内切菊粉酶产量影响 该研究发现3 种从d a h l i ar h i z o s p h e r e 巾分离的细菌 p a e n i b a c i l l u s 印c b d 0 0 3 p a e n i b a c i l l u s 妒c b d 0 0 4 p a e n i b a c i t l u ss pc b d 0 0 5 只产内切菊粉酶 而真菌 a s p e r g i l h t fr a g e d s m 2 4 6 6 分泌的菊粉酶表现出外训和内切两种酶活 微生物产菊粉酶的类型和产量与微生物种类及培养条件有密切地关系 v is w a n a t h a n 等 t 9 9 5 利用紫外线诱导突变从a 7 萨 巾筛选到了一个突变 株 该突变株发酵液中的最高酶活可达3 7 7 u m s k o w r o n e k 等 2 0 0 3 利用紫 外线辐照和化学诱变剂 n t g 同时处理月 n i g e 2 最后9 市选到了个突变株 该突变株能抗化学诱变剂且能在低温 1 5 0 下良好生长 产酶量在榴同培养条 件下提高了2 0 5 0 魏文玲 t 9 9 1 利用甲基磺酸乙酯 e m s 筛选到了菊 山东大学硕士学位论文 粉酶酵母去阻遏突变体 该突变体产菊粉酶时不受葡萄糖等单糖的抑制 从而提 高了菊粉酶的产量 w a n g 等 2 0 0 0 筛选到了一株克鲁维酵母菌 该菌发酵液 中的酶浓度可达2 8 8 7 8 u m l 同样是克鲁维酵母菌株 魏文玲等 1 9 9 8 x 1 5 5 一菌株 y 一8 5 进行发酵研究时发现 发酵液菊粉酶活力只有6 8 9 u m l 而 s t r e p o f f g c e ss p g n d u 的发酵液中胞外菊粉酶的含量更仪有0 5 5 2 u m 由此 可见不同菌种或同一菌种不同菌株的产酶量相差很大 即使采用同一菌株 发酵条件对微生物的产酶量电有重大影响 林影等 2 0 0 0 研究了脉冲电磁场对k l u y v e r o m y c e sn l a g i i i s 细胞生长和菊粉酶生物 合成的影响 结果发现 9 4 h z 1 4 m t 脉宽为1 3 0 0 s 问歇时间为8 7 0 0us 上升和下降时间为2 0 0us 的矩形脉冲磁场的作用使菊粉酶活力提高了2 3 这 种脉冲电磁场对酶的诱导合成作用使菊粉酶的合成总量是对照样的1 3 6 杨革等 2 0 0 0 从4 7 种真菌中筛选出2 个能分解菊芋菊粉并产生低聚果糖 的菌株 摇瓶发酵的适当条件为 基质含菊粉提取物4 蛋白胨0 3 尿素 0 2 温度3 l 摇床转速2 0 0 r m i n 培养时间4 2 h 最高产菊粉酶达2 4 0 3 u m l k a lii 等 2 0 01 采用正交实验系统研究了 培养基组成对克鲁维酵母菊粉酶 产量的影响 研究者改变培养基中的五个参数 即培养基中的蔗糖浓度 蛋白胨 浓度 酵母提取物浓度 p h k 2 h p o 来研究发酵液中的菊粉酶含量 结果表明 这五种组分对克鲁维酵母的产酶量都有显著的影响 其中蔗糖 p 对菊粉酶生 产有负作用 而蛋白胨 酵母提取物 盹i t p o 对产酶有正作用 发酵过程中p h 变化很大 其保持产酶的最适p h 维持在p 1 1 3 5 其它四种参数最佳值分别是 蔗糖 1 4 9 l 酵母提取物 1 0 9 蛋白胨 2 0 9 l k z h p o t l g l 在最适产酶 条件下 发酵液中的酶活可达1 2 7 u m 产酶量比条件优化前提高了约6 倍 w a n g 等 2 0 0 0 采用克鲁维酵高密度培养 培养液中菊粉酶的酶活比以往 报道高6 8 倍 并首次在培养綦巾添加镁离子 结果表明镁离子可使克鲁维酵母 的产酶量提高l l 在各种各样的碳源巾 含有菊粉的植物材料最适合促进微 生物菊粉酶的分泌 g 等 2 0 0 3 在研究s t r o p t o m y c e ss p g n b u l 菊粉酶生产条件时发现 陔菌在培养基中禽1 菊粉 以酵母提取物作为作为唯一氮源 0 1 1 7 5 培养温 度为4 6 c 刚 该菌胞外酶的产量最高 培养基中的n 虬则抑制酶的分泌 山东大学硕士学位论文 f e r r e i r a 等 1 9 9 1 利用6 l a d o s p o r i u mc m d o s p o r i o d e s 生产热稳定转化 酶和外切菊粉酶时 在培养基中同时添加了蔗糖 菊粉及山药提取物作为碳源 陈钟辉等 2 0 0 1 研究了培养基中的碳源对马克斯克鲁维酵母菊粉酶合成 的影响 结果表明 马克斯克鲁维酵母可利用木糖 菊粉等多种碳源 利用木糖 为碳源刚菊粉酶产量最高 酶活力可达3 0 4 u m g 菌体 干重 菊粉次之 利用 葡萄糖 乳糖时的酶活力均很低 林影等 1 9 9 7 利用脆壁克鲁维氏酵母生产菊粉酶的发酵条件时发现 发 酵初始p l 为6 0 6 5 菊粉浓度为2 接种量4 控制前期发酵温度为2 8 3 0 h 后发酵温度为3 2 3 4 c 发酵周期为7 0 h 左右 最高产酶达2 4 0 u m l 在5 i 自控发酵罐中 产酶达到同样水平 发酵周期缩短约l o h 目前应用微生物生产菊粉酶最常用的方法是液体发酵 但国外许多实验室 电正在尝试吲体发酵 s e l v a k u m a r 1 9 9 9 2 3 菊粉酶的理化性质 鉴于菊粉酶在t 业一h 的重要应用前景 国内外许多实验室正开展菊粉酶的酶 学性质研究 以期为实际应用提供理论支持 许多不同生物来源的菊粉酶的编码 基因也已经被克隆 陈冠军等 1 9 9 7 从a h i k e r3 1 9 发酵液中纯化了菊粉酶 该酶是一个 相对分了 量为2 8 k d 的单体糖蛋白 p l 为5 4 最适p h 和最适温度分别为p t 5 0 和6 0 c 该酶可被h g p b c u 等重金属离了 强烈抑制 最适底物是菊粉 i s 值为03 8 4 k m 和v m 分别为6 2 5 m m o t l 和6 7 1 1 n m o t m g 一 m i n w a n g 等 2 0 0 0 从克鲁维酵母培养液中纯化的菊粉酶 其i s 值为1 2 4 7 2 该酶的最适p h 为p h 4 4 最适温度为5 5 c 划 两种底物菊粉和蔗糖的k m 值分 别为1 3 3 m l n 0 1 l 和6 2 6 n m 0 1 门 5 56 c 时的半衰期为1 6 小叫 该酶在p 1 3 8 5 6 5 0 一5 7 56 c 范围内相对稳定 l j z u n o v a 等 2 0 0 1 研究了n j 降解菊粉的嗜热芽孢杆菌b a c i l j u s 妒 l l 的酶 学特性 结果表明 该酶为外切菊粉酶 在6 5 p l 5 5 7 5 条件下具有最高 的催化活性 山东大学硕士学位论文 j i 等 1 9 9 8 从a n i g e r 中纯化了四种外切菊粉酶 其分子量分别为1 0 2 6 9 7 9 6 2 5 和3 6 5 k b 等电点分别是4 1 5 4 2 4 4 4 8 4 15 该酶在5 5 6 0 p h 4 o p 1 1 5 0 的范围内表现出最高催化活性 且分子量越小 其热稳定也越 好 g i l l 等 2 0 0 3 实验征明了s t r o p t o m y c e s 印 g n d u l 菊粉酶的最适温度 是6 0 最适p h 为p l j 5 m o r i y a m a 等 2 0 0 2 从青霉菌p c n i c i l l i u m 印 t n 一8 8 中纯化r 种胞外 外切菊粉酶 其相对分子量为8 i k d 最适温度为5 5 最适p h 为p i l 5 0 u h m 等 1 9 9 9 从a f t c c u m 中纯化出r 分子量分别为6 4 k d 6 6 k d 的两种 内切菊粉酶 没有转化酶活性 它们源自同一蛋白 但糖基化程度不同 该酶为 单体酶 以菊粉为底物 其k m v m 分别为8 m m o l l 和7 7 3 u m g 该酶的一级 结构与p e n i c i l i u mp u f p u r o y p n u f l 的内切菊粉酶有较高的同源性 f e r r e i r a 等 1 1 分析了6 a d o s p o r i u mc j a d o s p o z i o d e s 分泌的转化酶 和外切菊粉酶酶学性质 结果表明 这两种酶的 s 值分别是0 3 l 和0 3 6 最 适温度都是6 0 h a m d y 等 2 0 0 2 从a 1 t e r n a r i aa 7 t e r n a t a f r k e i s s e f 中纯化了胞外 菊粉酶并研究了其性质 该酶最适温度为5 5 c 最适p i l 为p h 4 5 b a c a 是 陔酶的激活剂 而c u f e h 9 2 则是该酶的抑制剂 该酶的分子量约为1 1 5 k 9 k m 值为0 0 6 6 m m o l l i s 为o 5 总结前人的工作微生物菊粉酶的基本性质如 下表 微生物分予量等电点最适温 最适p h i s k d 度 c k l u y v e r o m y c e ss p 5 45 544 酵k h t y v e r o m y c e s m k o x i a g h a s6 4 母 c b s6 5 5 6 苗 k l u y v e r o m y c e su v g 4 0 3 5 0450 1 1 9 k l u y v e r o m y c e x y 8 54 25 246o0 8 6 6 55 24500 7 8 5 75 54600 7 2 b a c i f f i 盯5 口l l6 555 75 山东大学硕士学位论文 b a c i l l u sp o l y m y x am g l 2 5 553 570 2 细g e o b a c i l l u s5 46 0 s t e a r o t h e r m o p h i l u sk p l 2 8 9 荫 s t r e p t o m y c e ss pg n d u 16 055 a s p e r g i l l u sm 暮e r3 192 85 46 0 5 03 8 4 a s p e r g i l l u sl e r r e u nv a r a t l y e l i s6 65 5 58l5 8 5 65 7 60l5 4 a s p e r g i l l u sn i 铲rm 8 9 1 0 26 41 5 5 5 6 0 40 50 9 79 42 4 5 5 6 0 40 50 6 2544 85 5 6 040 50 霉3 6541 55 5 6 040 5 a s p e r g i l l u s i c u u m 6 4 菌 6 6 c l a d o s p o r i u m 6 003 1 03 6 c l a d o s p o r i o i d e s p e n i c i l l i u m j a n c z e w s k i i 4 85 055 6 6 p e n i c i l l i u ms pt n 8 88 i55509 a l t e r n a r i aa l t e r n a t a f r 1 55 545 05 k e i s s l e r 此外 菊粉酶其有较好的热稳定性 底物专一性不强 绝大多数菊粉酶除 水解菊粉外 还水解蔗糖和棉予糖 迄今为止 许多编码菊粉酶的基因己被克隆 f s uj i m o t o 等 2 0 0 3 最近从 g e o b a c i l l u ss t o o t o t h e r m o p h i l u sk p l 2 8 9 中克隆了编码其外切菊粉酶的基冈 i n u a i n u a 全长1 4 8 2 b p 编码4 9 3 个氨基酸残基 由该綦囚推测编码蛋n 矗勺分 子量为5 6 7 k d 一级结构与 s e u d o m o n g i sm u c i d a l g t n s 外切菊粉酶有微离的同源 性 重组蛋白的最适温度为6 0 重组酶的活性形式为单体酶 k w o n 等 2 0 0 3 从b a c i l l u sp o l y m y x a 中克隆的基因 i n u 共1 4 5 5 b p 编码4 8 5 个氨基酸残基 分子量5 5 s k i z h a n g 等利用p c r 技术克隆了编码an i g e ra l 1 0 内切菊粉的基 因i n u a l 该基因内部无内含予 伞长1 5 5 l b p 编f 马5 7 k d 的蛋白 n 术端具有 保守序列w d n e p n 可能存存网个糖基化位点 m r y a m a 等 2 0 0 2 分别克隆了 l l j 东大学硕士学位论文 编码一株青霉菌外切菊粉酶的基因 i n u d 比较其c d n a 序列与基因组序列发现 该基因内部含有长度为5 6 b p 单拷贝的内含子 编码蛋白含有2 5 个氨基酸残基组 成的信号肽 成熟蛋白含有6 7 7 个氨基酸残基 存在八个可能的糖基化位点 i a 1 0 u x 等 1 9 9 1 克隆的克鲁维酵母胞外菊粉酶的c d n a i n u l 编码5 5 5 个 氨基酸残基 n 一末端具有典型的信号肽序列 该蛋白的一级结构与sc e f e v i 副a e 转化酶有6 7 的同源性 2 4 菊粉酶的应用 基于菊粉酶对菊粉的水觯活性 菊粉酶的大规模应用主要集中在以下几个 方面 1 利用菊粉酶生产高果糖浆 w e iw e n i n g 1 9 9 9 以菊粉为原料 利用酸法和酶法皆可制备高果糖浆 酸法虽然产量高 成 本低 但副产物多 色素重 分离精制困难 若有利用菊粉酶制备果糖 其 r 艺 简单 转化率高 产物纯 果糖含量可达9 0 以i 二 2 利用菊粉酶生产低聚果糖 h e i l s c h e r 1 9 9 6 c h o 2 0 0 1 如前所述 低聚果糖具有诸多生理功能 应用范围广 促使人们研究其最 佳的生产工艺 以酸法水解菊粉 虽然可以制得部分低聚果糖 但效率低 果糖 长度难以控制 目前工业上生产低聚果糖的最佳选择是采用菊粉酶法 该法生产 的低聚果糖纯度高 生产过程易于控制 3 利用菊粉酶生产酒精 n a k a m u r a 1 9 9 6 b o u r g i 1 9 8 6 由于许多酿酒酵母不能直接利用菊粉 因此利用分泌菊粉酶微生物或直接 利用菊粉酶将菊粉分解为单糖 再通过酿酒酵母发酵生产酒精 从而为酒精生产 提供新的原料 4 菊粉酶在其它方面的应用 b a u m g a r t n e r 1 9 9 5 利用菊粉酶可以定量分析尿液中存在的微量菊粉 为肾脏疾病的诊断提供 了一种新的方法 山东大学硕二e 学位论文 3 本论文选题的目的与意义 自上世纪八十年代初期 国外兴起了菊粉酶研究热潮 近几年来我阁科技工 作者开始了菊粉酶研究 但至今尚未选育出能满足工业酶制剂生产的高产酶活力 菌株 我国在菊粉酶的研究与开发过程中遇到的主要团难是 产酶成本高 导致 厂应用成本高 主要表现在产酶菌株的菊粉酶产量低 菊粉酶价格高 制约了低 聚果糖在食品工业和饲料工业中的应用 本课题的目的在于从菊芋生长地的土样中分离纯化可高效分泌菊粉酶的酵 母菌株 系统研究培养基组成及培养条件对已筛选菌株产酶量的影响 确定通过 发酵生产菊粉酶的最佳d f 艺参数 研究温度 p h 化学物质等理化因素对所得菊 粉酶活性的影响 确定该酶的最适作用温度 最适p t i 激活剂 抑制剂 从而 为菊粉酶的工j k 化生产提供高产菌株及最佳发酵工艺 通过对菊粉酶的酶学性质 研究 为菊粉酶实际应用提供理论指导 参考文献 1 陈晓明 朱太海 菊糖的功能及在食品工业中的应用 食品科技 2 0 0 0 5 3 4 3 5 2 陈冠军 s e n g u p t as 微生物菊糖酶及其在菊糖转化成果糖中的应用潜力 生 物工程进展 1 9 9 2 l 2 5 0 5 6 3 孙纪录 贾英民 桑亚新等 菊芋资源的开发利用 食品科技 2 0 0 3 l 2 7 2 9 4 严慧如 黄绍华等 菊糖的提取j 性质和应用西部粮油科 技 2 0 0 l 2 6 5 3 卜3 3 5 张连富李红 天然多功能食品配料一菊糖和低聚果糖 粮食弓食品工 业 2 0 0 0 2 2 4 2 7 6 屠用利 菊糖的功能与应 月 食品工业 上海 1 9 9 7 4 4 54 6 7 林晨 郭勇菊糖酶发酵生产条件的研究 微生物学通报 1 9 9 7 2 4 l 旷2 8 魏文玲 菊糖酶酵母去隅遏突变体韵选育 厦门火学学报 自然科学 版 9 9 3 0 9 4 9 8 9 魏文玲 万武光 固定化菊糖酶连续降解菊芋果聚糖的研究 厦门大学学报 山东大学硕士学位论文 自然科学版 1 9 9 8 3 7 4 3 6 4 4 2 j0 林影 郭勇 脉冲磁场对k u y v e z o l y c e se r a g i i s 生长及菊糖酶合成的影响 华南理 大学学报 自然科学版 2 0 0 0 2 8 9 3 9 8 il 杨苹 刘艳 真菌转化菊糖生产低聚果糖的研究 曲阜师范大学学报 自然科 学版 2 0 0 0 2 6 8 3 8 5 1 2 陈冠军 孙忠东 黑曲霉菊糖酶的纯化及性质 微生物学报 1 9 9 7 3 7 3 6 2 3 6 7 1 3 陈钟辉 陈晋安 木糖对马克斯酵母菊糖酶合成的诱导作用 厦门大学学报 自然科学版 2 0 0 1 4 0 儿5 卜1 1 5 5 1 4 林影 卢荣德 洋姜水解生产果糖的研究 食品工业 上海 1 9 9 7 5 3 8 1 5 b a u m g a r t n e rs p r a z n i kw p u r i f i c a t io no fe x o a n de n d o i n u li n a s e f r o mc r u d ei n u l i n a s ee x t r a c tf o rt h ea n a l y s i so ff r u c t a n s i n tjb j0 1 m a c r o m o l 1 9 9 5 1 7 2 4 7 2 5 0 1 6 b o e c k n e rl s m a r l l y n n i s t u n g l a n d c i n u i n ar e v i e wo f n u t r i t i o n a la n dh e a l t hi m p l j c a t i o n s a d vf o o dn u t rr e s 2 0 0 1 4 3 1 6 3 1 7 g o u r g ij j p g u j r a u d g a l z yp i s o l a r o no fak u y v e f o m y c e s 如i f j 7 i sd e r e p r e s s e dm ur a n th y p e r p r d u c e ro fin u l i n a s ef o re t h a n o l p r o d u c t i o nf r o mj e r u s a l e m a r t i c h o k e f e r m e n tt e c h n o l 1 9 8 6 6 4 2 3 9 2 4 3 1 8 f e r r e i r a m s d e a n d r a d e a v k e n n e d yt f p r o p e r t i e s o fa t h e r m o s t a b l en o n s p e e i f i f r u o t o f u r a n o s i d a s ep r o d u c e db yc i a d s p o v i u m c l a d o s p o r i o i d e sc 0 1 l sf o rh y d r o y s i so fj e r u s a c i ia r t i c h o k ee x t f a c t a p p l b i o c h e nb i o t e c h n o l 1 9 9 l 3 l 卜9 1 9 g e r nr m f u r a ns a nj 1 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