（微生物学专业论文）紫外线诱导斜纹夜蛾细胞sl1凋亡的研究.pdf

硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 摘要 由于近年来大气中臭氧层的破坏 辐射到地面的u v 增多 故u v 对人类的健 康威胁越来越大 过量的紫外线照射以成为危害人类健康的重要环境因素之一 研究 发现u v 不仅能引发日光性皮炎 皮肤老化 免疫抑制 白内障和皮肤癌等疾病 还能诱导细胞发生凋亡 从而消除受损的细胞避免癌症的发生 u v 诱导凋亡的机 制具有细胞特异性 对于其诱导细胞凋亡机制的研究成为研究的莺点 但在昆虫细 胞中的研究比较少 本研究以斜纹夜蛾细胞s l 1 细胞为实验材料 对紫外线诱导 s l 1 细胞的凋亡进行了初步的研究 完成的工作包括以下几个方面 1 u v c 诱导斜纹夜蛾s l 1 细胞凋亡 u v c 处理斜纹夜蛾s l 1 细胞后 可诱导s l 1 细胞产生典型细胞凋亡 光镜下 可见细胞膜表面突出或形成小泡 细胞破裂成凋亡小体 u v c 处理2 4 h 后 细胞几 乎全部破裂成凋亡小体 d a p i 荧光染色显示感染细胞核逐渐形变 直至破裂成小 块而被凋亡小体包裹 s l i 细胞处理后d n a 琼脂糖凝胶电泳成典型凋亡细胞d n a 梯形电泳谱带 p i 染色法检测其凋亡率 处理后8h f 的凋亡率为4 7 0 8 2 细胞内线粒体的变化 流式细胞仪对线粒体膜电位进行检测 结果表明 细胞经罗丹明 r h o 1 2 3 染色后在流式细胞仪上检测 处理1 小时后即出现荧光强度下降 说明此时膜电位 开始下降 并且细胞膜电位逐渐下降且呈时间依赖性 w e s t e r n b l o t t i n g 检测调控蛋 白c y t 0c 在细胞质和线粒体中的含量 结果显示s l 1 细胞在处理后4 小时线粒体 中的细胞色素c 被释放到了细胞质中 这与很多在哺乳动物细胞中所做的结果相 同 3 c a s p a s e3 活性的检测 对c a s p a s e 3 的活性检测 首先用c a s p a s e 3 特异性序列人工合成荧光底物 a c d e v d a f c 与所提取的细胞裂解液成份反应 置荧光分光光度计上检测 结果 显示s f a m n p v 感染4 小时后即检测到c a s p a s e 3 的活性 且其活性呈时间依赖性增 强 这提示了c y t c 在u v c 诱导昆虫细胞凋亡中可能起重要作用 通过c y t c 的释放 激活下游的效应酶 关键词 斜纹夜蛾细胞系细胞凋亡梯形带线粒体膜电位细胞色素c 吾仝硅再落娄 流一h h n 铀一h 耋磊妻章 i 三三重雪 毒毫言露碧 三i 至妻善萎萋i i 兰兰曼叁 善 i 霉三 茎 巷量三j 鼍主至l 羹 i i i 萄 墨 圣圣主i 二 霎 耋 萼耋i i i 荤萼萝 i 罩室 主 l 妻喜 雾搴 i 毒i c 至二 i i 蓁 嚣喜i 薹委i 薹量 主 墓二囊墨l i 毒童雾薹 薹蚕j 耋妻暑要是i 雪要耋季 矗轻 譬哮 i 忿蔓l 善国国宝善匹i 曼曩萎垂l 薹未薹雩女圳 羹耋囊 i 穹妻二毒毫 i 某j 善i i 建i 萝善 誊l 雾羹i 爿争i 牙垂 善芋塞 事鸶二萋圭m 雩二 囊 霎喜妻萋i 蓥习一l 匡e 藤霉l 堑霆 囊塞l i 錾 罄誊薹薹享孔墓 萋薹差 至l l l 萋手 i i i 妻建 鐾 蚕li f 矍噩蓦冀誊圣善 罩 亮i 量 萼爹霪鞲己毒毛芎拿 l 翼i i 雾妻奏 孽 尹 i 霉孝舞莩莩主羹 寒 习鲳 f 蠹萋录茎i i 萋i i l 薹譬亳 宅 蚕蚕 l l l 譬i 堕堕誉曼l 孽i 重j j 荦冀j 薹j l 要 萋 畦登妻l 萼二兰 萼l l gi 雾蓁i 妻 蓁蓁拜珥i i 雷季羹2 蠹蚕鞲尹 圣i 冀 i 茎 量事垂i 焉宦 自赛 曩i 4 毒撂莲i e 目巨巨璺骂晶 量鼬 i 豸萋囊爱南i 誉妻冀委冀j 霉 蠹蠹鬟囊 i i 差妻了i 埘孚驴霉 专耋三三i 专 i 薹薹童墓i i il l l 曲 i i 客卜蔓q 童i 錾i 器圭厶i 三蠹i 茂i 矗萼三r 重耋 x 1 前言 1 1 细胞凋亡概述 1 1 1 细胞凋亡 细胞凋亡是指细胞受到内外信号刺激时发生的一种由细胞内部基因控制的 主动性死亡行为 是细胞内在的机制 也是决定生物个体发育和组织平衡的一个重 要机制 对于抵御外界各种因素干扰起着非常关键的作用 它呈现一系列典型的生 化和形态学特征 如染色质凝集 趋边化以及凋亡小体 a p o p t o t i cb o d y 的产生 伴随着形态学上的变化 凋亡细胞的染色质在核小体间被活化的d n a s e 特异水解 形成大约为1 8 0 2 0 0 b p 或其多聚体组成的寡核苷酸片断 被包裹在凋亡小体内 琼脂糖凝胶电泳表现为d n a 梯带 d n al a d d e r 细胞凋亡过程的发生主要可以划分为两个阶段 第一个阶段是凋亡信号的传 递 包括凋亡信号的转导和凋亡基因的激活 第二个阶段是效应发生 包括凋亡的 执行和凋亡细胞的清除 细胞凋亡是当前生命科学研究中最热门的领域之一 根据 美国i s i i n f o r m a t i o ns c i e n c e si n s t i t u t e 对1 9 9 7 年s c i 收录及引用论文关键词检索发 现 全球自然科学研究中论文发表最集中的3 个领域分别是细胞信号转导 细胞凋 亡和基因组研究 截止到1 9 9 8 年的5 年内发表了2 万多篇有关细胞凋亡的文纠2 1 目前 对细胞凋亡的研究主要集中在如下几个方面 细胞接受胞内外信号的刺激启 动凋亡 胞内凋亡特异性蛋白酶c a s p a s e s 的活化 c a s p 删s 对细胞结构的降解 线 粒体及b c l 2 蛋白家族对凋亡的调控等 1 1 2 细胞凋亡的重要性 在正常情况下 凋亡在脊椎动物和无脊椎动物生物器官中均起到重要作用 凋 亡最大的优点之一便是在凋亡发生过程中 细胞膜保持完整 从而避免细胞内容物 向胞间内环境的释放而造成的炎症反应 在发育过程中如组织退化或重塑时 凋亡 现象非常明显 实际上 发育过程中手和足的成形过程就伴随着细胞的凋亡 胚胎 时期 它们呈铲状 以后指或趾之间的细胞凋亡 才逐渐发育为成形的手和足 凋 亡在几乎所有组织的正常细胞中也很重要 特别是具有高代谢率的组织中 例如皮 肤 消化道上皮以及血液和淋巴系统等 一个健康的成人体内 在骨髓和肠中 每 小时约有1 0 个细胞发生凋亡 凋亡对脊椎动物免疫系统功能的维持也很重要 在 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 免疫系统中 细胞毒性t 细胞的杀灭及记忆行b 细胞的筛选均涉及凋亡过程 细胞 凋亡在无脊椎生物许多其它过程中同样具有重要作用 昆虫从卵到成虫 中间要经 过几个蜕变期 每个时期组织结构以及外形都要发生改变 在这些过程中均有赖于 新旧细胞的生死交替 死亡的细胞是在完成了它的使命之后而被淘汰的 天然有序 蝌蚪变成蛙时 尾巴自然消失 这种消失的机制是细胞有序凋亡的过程 还有组织 内环境的稳定 以及防御病原微生物的侵袭等细胞凋亡都起到极其重要的作用 另 一方面 细胞凋亡的失调包括不恰当的激活或抑制会导致疾病 例如a p 功能受抑 可见于肿瘤 自身免疫病 a i d 病毒感染等 a p 功能增强则见于a i d s 骨质疏松 神经退变性疾病等 如下表1 表1 与细胞凋亡相关的疾病 与a p 减少有关的疾病与a p 增多有关的疾病 癌症神经退变性疾病 前列腺癌p a r k i n s o n 病 囊泡淋巴瘤 a l z h e i m e r 病 乳腺癌肌萎缩性侧索硬化症 卵巢癌视网膜色素沉着症 自身免疫病再生障碍性贫血 s l e 缺血性损伤 糖尿病心肌梗塞 银屑病中风 病毒感染再灌注损伤 疱疹病毒急性暴发性肝炎 痘病毒 a i d s 腺病毒 1 2w 诱导的细胞凋亡 1 2 1w 与疾病 由于近年来大气中臭氧层的破坏 辐射到地面的u v 增多 故u 对人类的健康 威胁越来越大 紫外线对人的皮肤和眼睛的影响最为明显 皮肤对紫外线的吸收与 2 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 紫外线照射后 需经过6 至8 小时的潜伏期后才发生细胞的改变并出现症状 包括 皮肤干燥 疼痛 表皮皱缩 甚至起泡脱落 严重的紫外线可引起人体疲乏 低热 嗜睡等全身反应 长期 多次的曝晒 可造成皮肤和黏膜的日光性角化症 光照性 角化症 表现在暴露部位出现束臻锰 洼谗孺 曼崮嗣 湍馏 洚 霸 灌 罕永 一溶解的襄蒂粪 萋雾i 辅基蓟产耙阳誊一劐匠j 蠹雾黝蕊羹i 蓁嬲襄装誉到引剽矗 暨葬器发强 器是蝴鲫 垂巴l 戤垂q 理瞳驵崆 弘 孵鳢嚣藩瀚 瓣弼翮 目f 目疆 犁测鬣赤j 塑囊墓藿鬟藐矍嚣 器鏊妻 i 磊9 器蕊羹霾圆粪黧脞鞠醵配蓓藉固铲朗j 高压嚣琶囊囊巍鞋引矧甜删匿一 醛矫如冀奔塑霭翼雾 8 9 n a c l o 2gk i 1 2 p 0 3 2 8 9 9 n a 2 h p 0 3 1 2 h 2 0 加水定容至1 l 1 大气压高压灭菌2 0 分钟备用 细胞裂解缓冲液 2 0m mh e p e s k o h p h 7 5 1 0m mk c i 1 5m mm g c l 2 1 m me d t a n a 2 1m me g t a n a 2 1m md t t 0 1m mp m s f 2 5 0m m 蔗糖 细胞裂解液 50m m h e p e s k o h p h 7 5 7 5m mn a c i 1m m e d t a n a 2 1m me g t a n a 2 1m md t t 1m mp m s f 0 1 t r i t o n x 一1 0 0 反应缓冲液 50m mh e p e s k o h p h 7 4 7 5m mn a c i 1m me d t a n 赴 2m m i y i t 1 0 蔗糖 o 5 c h a p s d a p i 液 用无菌双蒸水溶解成私g m l 的浓度 分装成小份 4 c 避光保存备 用 罗丹明1 23 r h l 2 3 储存液 线粒体跨膜电位荧光探针 用无菌双蒸水溶解 成1m g m l 的浓度 分装成小份 4 1 2 避光保存备用 p i 液 30 5 0 a g m lp i 3 弘g m le d t 氏0 1 t r i t o n x 1 0 0 1 0 陬g m lr n a a s e 溶于 p b s 苯 x 硕士学伍论文 m a s t e r st h e s i s 1 2 3u v 诱导的细胞凋亡 近年来研究发现u v 不仅能引发日光性皮炎 皮肤老化 免疫抑制 白内障和 皮肤癌等疾病 还能诱导细胞发生凋亡 文献报道紫外线可诱导人表皮的 l a n g e r h a n s 细胞 角质细胞凋亡o 也可诱导人u 1 3 9 h e l a a 4 3 1 细胞系 1 及b t 一2 乳腺癌 h l 一6 0 骨髓淋巴瘤 3 t 3 成纤维细胞0 1 大肠癌l o v 0 和h t 一2 9 凋亡 其诱 导机制上不明确 可能是在基因水平上激发一些与凋亡相关的基因表达发生改变有 关 f r e n c h 等的研究表明紫外线诱导人u 9 3 7 h e l a 细胞发生凋亡时c l u s t e r i n 即 t r p m 2 基因表达下降或消失 而k a n e r v a 等的研究显示 u v 照射后可激发培养细 胞的各种原癌基因 p r o t o o n c o g e n e s 的转录活性 包括f o s j u n 家族 紫外线照 射表皮后可引起c j u n j u n b 和c f o sm r n a 升高 而b c 卜2 的转录下降 s c h r e i b e r 发现缺乏c f o s 的鼠3 t 3 成纤维细胞在受到紫外线的照射时 较野生型的3 t 3 成纤 维细胞 其克隆存活和增殖能力明显下降 细胞凋亡增加 1 在昆虫细胞多以s f 9 s f 2 l 为模型来探索u v 照射后的细胞凋亡的分子机制 s a h d e v 等人在研究p 3 5 抑 制氧化剂诱导昆虫细胞凋亡的过程中 发现紫外线诱导s f 一9 细胞凋亡时 也会出 现c y t c 的释放及c a s p a s e 的激活 实验证明了只有细胞在被u v 诱导凋亡之前有p 3 5 的表达 才会抑制c y t c 的释放及c a s p a s e 3 的激活 即p 3 5 的抑制作用应发生在细 胞凋亡的前期过程 1 果蝇b g 2 细胞的凋亡过程中 没有检测到c y t c 的释放 但是 c a s p a s e 的起始因子d r o n c 与c a s p a s e 的效应因子d r i c e 能在线粒体的附近形成 7 0 0 k d 大小的复合物 这种复合物类似于哺乳动物中的凋亡体 并且在b g 2 细胞的 s 一1 0 0 提取物中加入c y t c 可加快这种复合物的形成 另外 在果蝇的s l 一2 细胞 凋亡过程中可检测到c y t c 的释放 在果蝇卵细胞凋亡过程中可检测到线粒体中c y t c 结构的变化 1 这表明线粒体在昆虫细胞凋亡中也具有重要作用 1 2 4w 诱导的细胞凋亡的可能机制 u v 诱导凋亡的机制具有细胞特异性 科研人员对u v 诱导的凋亡作过大量的 研究提出了如下几种可能的机制 如图1 1 2 4 1d m 损伤介导的细胞凋亡 当u v 照射细胞后 细胞内的生色团将光能转化为生物化学信号 从而行使生物 学功能 d n a 作为u v 的一个主要靶标 u v 可以引起两种类型的d n a 损伤 嘧啶二 聚体的形成和光生产物 通常情况下这些损伤可通过核苷酸切除修复 有一种称为 着色性干皮病的遗传病 这种病患者对日光或紫外线特别敏感 往往易出现皮肤癌 经分析表明 患者皮肤细胞中缺乏紫外线特异性核酸内切酶 因此对紫外线引起的 4 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 到抑制 从而在一定程度上降低了凋亡率 通过光复活作用提高d n a 的修复 细胞 凋亡明显被抑制 因此 只有两条通路同时被阻断 才能抑制凋亡的发生 以上 的研究表明 d n a 损伤和死亡受体两条通路即相互联系又相互独立 然而 即使阻 断死亡受体通路 同时减少d n a 损伤 也不能完全阻止细胞凋亡的发生 由此可见 在紫外线诱导的细胞凋亡中可能还存在第三条途径 1 2 4 3 线粒体损伤介导的细胞凋亡 线粒体是细胞内主要的a t p 生产中心 在细胞凋亡 人的衰老 癌症 信号转 导的发生过程中起着非常重要的作用 近年来 线粒体被视为细胞凋亡的关键元件 越来越多的研究表明 在凋亡信号的刺激下 线粒体的膜电位会丢失 线粒体的通 透性会发生变化 各种凋亡因子会从线粒体释放到细胞质中 它们或激活c a s p a s e 或独立地破坏核染色质 从而表现出细胞凋亡的各种形态特征 即胞质浓缩 d n a 的大规模片段化 最后细胞膜内陷形成凋亡小体 细胞色素c c y tc 自线粒体释放后与a p a f l 及c a s p a s e 9 共同组成了凋亡体 又称为 诱导死亡信号复合体 d i s c 当a p a f l 与c y tc d a t p a t p 结合后便 可经募集区活化c a s p a s e 9 再作用于其下游的靶 c a s p a s e 3 酶原 活化的 c a s p a s e 3 作为效应子作用于不同的靶细胞 经蛋白水解作用导致细胞凋亡跚 b c 卜2 家族与凋亡密切相关 研究表明 在线粒体对细胞凋亡的调控中 b c 卜2 家族 的表达产物对线粒体内一些促凋亡因子的释放具有调控功能 因此在决定细胞生死 中也具有十分重要的作用 b c 卜2 家族的凋亡蛋白由抑制凋亡蛋白和促进凋 亡蛋白2 类蛋白质所组成 包括b c l 一2 b c 卜x l b c 卜x s b a x b a d b 8 9 l b a k b i k 和b i d 等 b c l 一2 和b c 卜x 1 主要分布在线粒体膜与细胞质中 可以阻止孔道的 形成 使c y tc 不能通过外膜 从而抑制凋亡 b c 卜x s b a x b a d b a g x 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 1 3 本研究的背景 由于近年来大气中臭氧层的破坏 辐射到地面的u v 增多 u v 己成为影响人类 健康重要的环境因子 过量接受紫外线可以引起日光性皮炎 皮肤老化 免疫抑制 甚至导致癌症的发生 并且还能诱发细胞发生凋亡 通过凋亡这种方式清除受损的 细胞 从而避免癌症的发生 紫外线可以诱导很多细胞发生凋亡 对其诱发的细胞 凋亡的信号传导通路进行了大量的研究 但是 调控凋亡的具体机理仍然不十分清 楚 目前已知有三个主要的信号通路 1 d n a 损伤介导的细胞凋亡 2 死亡受体 介导的凋亡信号通路 3 线粒体介导的凋亡信号通路 在动物细胞中 线粒体通路是最普遍的凋亡机制 线粒体是细胞生命活动控制 中心 它不仅是细胞呼吸链和氧化磷酸化的中心 而且是细胞凋亡调控中心 对线 粒体与细胞凋亡之间联系的早期认识来自于1 9 9 4 年n e w m e y e r 等对爪蟾卵细胞提取 物的无细胞凋亡体系的研究 发现卵细胞提取物的线粒体组成可以使游离细胞核的 染色体凝集 提示了线粒体在细胞凋亡中的作用 后来 l u 等又分离出可诱导 e a s p a s e 3 活化的三种蛋白 分别为c y t c a p a f 1 c a s p a s e 9 嘲 这样才明确了细胞凋 亡与线粒体在分子水平上的联系 以后 越来越多的线粒体蛋白被证明在凋亡过程 中起了无法代替的作用 至此 确立了线粒体在动物细胞凋亡中的中心作用 细胞色素c 不仅在呼吸链中起着电子传递的作用 而且在细胞凋亡后会转位到 细胞质中 其主要作用是活化下游的c a s p a s e 细胞色素c 是一种水溶性蛋白 依赖 于极性基团定位于线粒体膜间隙 细胞色素c 主要通过与氧化还原复合物 i 和 结 合而在呼吸链中起作用 细胞色素c 在进化上是高度保守的 与线粒体其它蛋白一 样 细胞色素c 是由核基因编码 在细胞质中合成后定位于线粒体膜间隙 许多研 究表明细胞色素c 从线粒体的释放在哺乳动物细胞启始凋亡的过程中具有重要作用 4 9 5 3 5 8 s a h d e v 等人在研究p 3 5 抑制氧化剂诱导昆虫细胞凋亡的过程中 发现紫外 线诱导s f 9 细胞凋亡时 也会出现c y t c 的释放及c a s p a s e 的激活 实验证明了只 有细胞在被u v 诱导凋亡之前有p 3 5 的表达 才会抑制c y t c 的释放及c a s p a s e 3 的 激活 即p 3 5 的抑制作用应发生在细胞凋亡的前期过程 s a h d e v 等人的研究证明了 在紫外线诱导s f 一9 细胞的凋亡中 细胞色素c 从线粒体释放到细胞质中 继而活 化下游的c a s p a s e 一3 引起细胞凋亡的一系列变化时 由此可见 细胞色素c 在紫外线诱导s 卜9 细胞的凋亡中起重要作 在研究果 蝇b g 2 细胞的凋亡过程中 虽没有检测到c y t c 的释放 但是c a s p a s e 的起始因子 d r o n c 与c a s p a s e 的效应因子d r i c e 能在线粒体的附近形成7 0 0 k d 大小的复合物 9 这种复合物类似于哺乳动物中的凋亡体 并且在b g 2 细胞的s 1 0 0 提取物中加入 c y t c 可加快这种复合物的形成 另外 在果蝇的s l 一2 细胞凋亡过程中可检测到c y t c 的释放 在果蝇卵细胞凋亡过程中可检测到线粒体中c y t c 结构的变化 本研究建 立了u v 诱导s l 一1 细胞凋亡的系统 并且进一步研究证明了u v 诱导s l l 细胞凋亡 过程中 线粒体膜电位呈时间依赖性下降 并且发生了c y t c 的释放 随之伴随着 c a s p a s e 一3 的活化 这表明线粒体在昆虫细胞凋亡中也具有重要作用 在u v 诱导 的昆虫细胞凋亡中 细胞色素c 也从线粒体释放到细胞质中 提示了与哺乳动物细 胞的凋亡相同 线粒体也参与了u v 诱导昆虫细胞的凋亡过程 1 0 硕士学住论文 m a s t e r i st h e s i s 其它生化及分子生物学试剂均购自天源生物工程公司 2 1 5 实验所用仪器 流式细胞仪为美国的b e c t o n d i c k i n s o n 公司的f a c s o r t 荧光显微镜c c d 接口为n i k o n 公司 荧光分光光度计为日立f 4 5 0 0 蛋白质含量检测仪为e p p e n d o r f 公司的b i o p h o t o m e t e r 2 2 实验方法 2 2 1 紫外线处理细胞 将处于对数生长期的细胞接种到6 0 m m 培养皿上生长 待培养皿内细胞铺满 8 0 以上时 移去培养基将细胞置于u v c 灯管下照射 对照培养皿内的细胞不照射 处理5 0 s 后 加入新鲜的培养基继续培养 u v c 波长2 5 3 n m 功率3 0 w 照射距离 6 0 c m 对照组除不受紫外线照射外 其它处理方法同上 2 2 2 细胞固定 取2 0 0 ul 预冷的p b s 重悬的细胞液 慢慢滴入8 0 4 3 m l 的酒精中 注意此步非常关键 必须缓慢加入 一边加入一边晃动直至充分混匀 2 2 3 细胞凋亡的d a p f 检测 1 将处于对数生长期的细胞接种于放有盖玻片的培养皿中 2 接种于培养皿中的细胞 长到对数期后 取培养的细胞 3 将细胞中的培养液去掉 p b s 洗三次 3 7 甲醛固定细胞3 0 m i n 乙醇梯度 脱水 铋g m ld a p i 4 6 一d i a m i d i n o 一2p h e n y l i n d o l e 购自s i g m a 公司 染色 2 8 3 0 r a i n 取出盖玻片 放于载玻片上 荧光显微镜 激发波长 为3 4 0 3 8 0 阻隐波长4 3 5 4 8 5 下观察拍照 2 2 4 细胞d n a 的提取与电泳分析 l 收集u v c 处理后的细胞和对照细胞离心 1 20 0 0 r p m l m i n 弃上清 沉 淀细胞和凋亡小体 p b s 洗两次 2 离心后的细胞沉淀 用t e s 1 0 m m t r i s c 1 1 m m e d t a p h 8 0 i s d s 重悬 加蛋白酶k 至终浓度为5 0 i tg m l 3 7 c 水浴2 2 5 h 直至混合物变清亮 3 依次用酚 酚 氯仿 异戊醇 2 5 2 4 1 抽提 轻轻取水相加2 5 倍 体积4 的无水乙醇 一2 0 2 过夜沉淀d n a 离心 1 20 0 0 r p m1 5 m i n 7 0 硕士学位论文 m a s t e r s t h e s i s 细胞质和线粒体组分 以检测各组分中c y t oc 的量 亚细胞组分的制备方法如下 1 取正常细胞和紫外线处理后不同时间段的细胞 4h 8h 1 2h 收集细 胞 离心 15 0 0r p m 5r a i n 得细胞沉淀 p b s 清洗两次 2 分别在各组细胞沉淀中加入2 0 0 p l 细胞裂解缓冲液 2 0i i l mh e p e s k o h p h 7 5 1 0m mk c l 1 5m mm g c l l 枷e d t a n a z 1m me g t a n a 1 删 d t t 0 1 删删s f 2 5 0m m 蔗糖 重悬细胞沉淀后 用组织匀浆器制备 细胞匀浆 3 4 条件下 离心 7 5 0 g 1 0r a i n 细胞匀浆 取上清 弃沉淀 4 4 4 c 条件下 离心 1 00 0 0 x g 1 5m i n 步骤3 所得上清 再次分别收集上 清和沉淀 上清用于制各细胞质组分 沉淀用于制各线粒体组分 5 步骤4 中所得上清继续在4 条件下离心 1 00 0 0 g 1h 收集离心后 的上清 即为细胞质组分 6 取步骤4 中的沉淀重悬于1 0 0p l 上述细胞裂解缓冲液中 超声波处理 4 处理3t i m e s 每次5s e e 4 0 w a t t s 4 条件下离心 1 20 0 0 g 1 h 收集上清即为线粒体组分 7 分别测定制备的细胞质及线粒体组分的蛋自质浓度 分装成小份 一2 0 保存 备用于w e s t e r nb l o t t i n g 检测 2 2 8w e s t e r nb l o t t i n g 分析 1 分别取各个蛋白质样品以常规方法作s d s p a g e 电泳 对于c y t oe 检测 分别取上述制备的细胞质和线粒体组分作s d s p a g e 电泳 2 电泳完毕后 切取目的胶块以及相同大小的六张滤纸和硝酸纤维素滤膜 n c 膜 制成结合体 注意 n c 膜的操作过程中一定不能用手虫触摸 用镊 子或带手套进行 再转移电泳仪 4 5 v 上进行电转移 转移b u f f e r t r i s 碱1 1 6 2 9 甘氨酸5 8 5 9 s d s0 7 4 9 甲醇4 0 0 m 1 过夜 以下各步均 要缓慢摇动 3 取出n c 膜 置于托盘中 经去离子水洗三次后 加入丽春红染色液 0 2 丽春红s 1 乙酸 染色1 0 分钟 4 用去离子水轻轻飘洗硝酸纤维素滤膜 期间换水数次 至膜上显出清晰的 蛋白带和蛋白质m a r k e r 证明电转移成功 用黑色铅笔将蛋白质m a r k e r 的位置标出 然后用去离子水轻轻漂洗丽春红染料 直到蛋自带看不见为 止 5 用封闭液 5 脱脂奶粉 0 0 2 t w e e n 一2 0 0 0 2 叠氮钠 溶于p b s 中 封 硕士学位论丈 m a s t e r st e s i s 3 实验结果与分析 3 1u v c 诱导s l 1 细胞凋亡 u v c 处理斜纹夜蛾s 工 1 细胞后6 1 2 4 时 光镜观察到细胞表面 出泡 随着 时间的延长 出泡现象加剧 许多细胞破碎成球形亚细胞小体 即凋亡小体 处理 后2 4 h 几乎所有的细胞都破碎成凋亡小体 对照细胞生长正常 图1 图lu v c 处理s l l 细胞光学显微镜观察 a 对照s l l b u v c 处理8 h 后 f i g lt h ep h a s ec o n t r a s tm i c r o s c o p yo fs l 一1a f t e ri n d u c e db yu v d a p i 荧光染色显示u v c 处理后的s l l 细胞核的形态变化 荧光显微镜下首先 观察到核固缩 形成弯月形 染色质凝集 最后核裂解 图2 a 图2 b u v c 处理 后 s l 1 细胞核的这些变化是凋亡细胞核的变化特征 对照s l 1 核呈均 的圆形 硕士学住论文 m a s t e r st h e s t s 图2u v c 处理s l 一1 细胞后的凋亡早期d a p i 染色 a 正常s l l 细胞 b u v c 处理后8 h 的细胞 f i 9 2 d a p is t a i n i n gd e t e c t e dt h ee a r l ya p o p t o s i si n d u c e db yu v i ns l 1c e l l s u v c 处理后的s l 一1 细胞经提取细胞d n a 1 5 琼脂糖凝胶电泳呈梯形谱带 而 对照组d n a 电泳显示单一带型 图3 凋亡细胞由于受内源性核酸酶降解 细胞 d n a 断裂成1 8 0 2 0 0b p 片段或这些寡核苷酸的多聚体 电泳呈梯形分布 这是凋 亡细胞典型生化特性 图3u v c 处理s l 1 细胞d n a 琼脂糖电泳 1 m a r k e r 2 3 6 hp i 3 2 4 hp i 4 1 2 hp i 5 8 hp i 6 c o n t r o l f i g d n al a d d e ra n a l y s i so nt h ea p o p t o s i si n d u c e db yu u c 最早出现且较为常用的流式细胞凋亡定量检测技术是p i 染色法嘲 细胞凋亡时 d n a 断裂成小片段 当细胞用乙醇 t r i t o n x 1 0 0 处理后 这些小片段从细胞内释放 出来 使其d n a 含量低于正常细胞的二倍体 用d n a 结合染料p i 染色后分析 可在 g 1 峰前出现一亚二倍体峰即a p 峰 根据a p 峰的百分率可检测凋亡细胞数 对处 理组和对照组细胞流式细胞仪分析u v 诱导的凋亡发生情况 流式细胞仪检测凋亡 1 8 生 在折线图中可以很清楚地表现这个趋势 图6 由此我们得出 紫外线可诱导 s l 1 细胞线粒体跨膜电位 m 的下降 并且为较早期发生的事件 u v 处理后的1 h j1 0 1 4 33 2 6 19 9 9 8 3 5 2 c o n t r o l 1 1 1 9 7 4 2 7 4 9 9 9 92 9 3 2 h 5 2 7 39 9 9 8 3 1 8 l h 1 0 4 8 25 3 5 8 9 9 9 9 2 4 1 3 h 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 一 图6u v c 诱导的s l 1 细胞凋亡线粒体膜电位变化 f i g6 a n a l y s i sf o rm i t o c h o n d r i a lt r a n s m e m b f a n ep o t e n t i a l m d e c r c a s ei ns i 1c e n s 血d u c c d b y u v c 3 3u v c 诱导s l 一1 细胞凋亡时线粒体中的c y t oc 的变化 研究表明 m m 的开放可导致线粒体内凋亡相关蛋白如c r t oc 灿f 等的释放 而c y t oc 在凋亡发生中具有重要的作用 在其参与下所实现的a p 拉1 与c a s p a s c s 9 的结合是c a s p a s 船酶系级联激活反应启动的必要环节 本研究以u v c 处理s l l 细胞 在处理后不同的时间点 oh 4 h 8h 1 2h 分别制各处理细胞的细胞质组分及线粒体组分 w b s t e m 杂交检测两种亚细胞组分 中c y t oc 的存在及其量的变化 结果显示 未经u v c 处理的细胞所有的c y t oc 均 位于线粒体组分中 在细胞质组分中检测不到 经u v c 处理后的细胞 随着处理 后时间的延长 4h 8h 1 2h c y t oc 在线粒体中的量逐渐减少 而细胞质组分中 的量则逐渐增加 提示c y t oc 从线粒体释放到了细胞质中 圈7 在本研究过程中 我们进行了严格的定量 保证每个样品的上样量是相同的 图7 u v c 诱导s l l 线粒体内细胞色素c 的释放 f i g7 n l em i t o d 吣n d r i a lc y t o c l l r o m ect e l e a s et r i 懿眦d b y u v c 3 4 用荧光分光光度计检测c a s p a s e 一3 的活性 c a s p 鹧e s 是细胞凋亡的主要执行者 其中c a s p a s e 一3 又是细胞凋亡发生过程中 一个非常重要的下游效应c a s p a s e 以u v c 处理s l l 细胞 在处理后不同时间 o h r 项士学位论文 m a s t e r l st h e s i s 4 h r 8 h r 1 2 h r 制备细胞裂解液成份 用人工合成c a s p a s e 3 的特异性荧光底物 a c d e v d a f c 进行酶切反应 荧光定量检测显示 图8 在u v c 处理后的s l 1 细胞中 随着处理后时间的持续增加 c a s p a s e 3 的活力也逐渐增强 图8 用c a s p a s e 3 特异性人工合成底物a c d e v d a f c 检测c a s p a s c 一3 活性强度 f i 9 8 f l o u r i m c t r i ca s s a yo fc a s p a s e 3a c t i v i t ya s s a yu s i n g s u b s t r a t ca c d e v d a f c 硕士学位论文 m a s t e r st h e s l s 4 讨论 4 1 紫外线与细胞凋亡 由于近年来大气中臭氧层的破坏 辐射到地面的u v 增多 故u v 对人类的健 康威胁越来越大 过量的紫外线照射以成为危害人类健康的重要环境因素之一 u v 是一种非离子射线 具有多种生物学效应 如致d n a 损伤 杀菌 致炎症等作 用 近年研究发现紫外线可诱导多种肿瘤细胞凋亡 因此越来越多地被用于肿 瘤的辐射治疗研究中 4 2 紫外线诱导s l 一1 细胞凋亡 本实验以斜纹夜蛾细胞s l l 为实验材料 对u v c 诱导的细胞凋亡进行了初步研 究 通过形态学观察 能见到典型的细胞凋亡的形态学变化 细胞核固缩 染色质 凝集成新月状沿核膜分布 核碎裂 凋亡小体形成等 琼脂糖凝胶电泳可见典型的 d n al a d d e r 流式细胞仪检测其凋亡率 出现亚二倍体峰 利用不同的细胞凋亡的 检测方法均证明了s l 1 细胞确实发生了凋亡 这充分说明u v c 确实能诱导s l l 细胞 凋亡 以前有实验组也曾通过实验证实了紫外线照射s f 9 细胞可以诱导其发生凋 亡 出现典型的凋亡形态学特征 细胞核固缩 染色质凝集成新月状沿核膜分布 核碎裂 凋亡小体形成等 琼脂糖凝胶电泳可见典型的d n al a d d e r 因此本实验可 初步得出如下结论 紫外线照射可以诱导昆虫细胞发生凋亡可能具有普遍性 4 3 紫外线诱导s l 一1 细胞凋亡时线粒体的变化 线粒体是细胞内一个重要的细胞器 是细胞生命活动控制中心 它不仅上细胞 呼吸链和氧化磷酸化的中心 而且是细胞凋亡调控中心 修文 线粒体对细胞凋亡 的调控作用主要体现为 在凋亡信号的刺激下 m p t p 开放 膜通透性增加 线粒体 基质内的离子 溶质小分子及其某些p r 释放出来 导致线粒体跨膜电位 v m 下 降甚至崩溃 m p t p 的长时间开放以及 l i m 的崩溃 导致细胞凋亡相关因子如c y t oc 凋亡诱导因子 a i f s i i l a c d c a 以及膜间隙中的其他凋亡因子释放至细胞质中 最终导致凋亡的发生 线粒体膜电位的改变是细胞凋亡时线粒体的早期显著变化之一 大量的实验表 明 许多凋亡诱导剂引起的各种细胞的凋亡过程中 如撤除神经生长因子诱导的交 感神经元细胞凋亡 糖皮质激素刺激诱导的淋巴细胞凋亡 肿瘤坏死因子诱导的单 核细胞凋亡等 均出现 掣m 的下降 并且这种改变发生于凋亡细胞的形态学改变 硕士学住论文 m a s t e r st h e s i s 之前 提示 v m 的下降为凋亡早期事件 与这些凋亡系统相同 u v c 诱导的斜纹夜 蛾细胞s l l 凋亡时也出现了 l m 的下降 在图中可看到r h 1 2 3 的主峰在逐渐向左 移动 膜电位的改变是p t 孔开放的结果 v m 的下降代表细胞凋亡进入不可逆的 凋亡进程 p t 孔开放的另一个结果会掉导致凋亡的起始因子c y t oc 由线粒体释放到细胞质 中 本研究中 w e s t e r n 咄1 0 t t i n g 的结果证实u v c 诱导的s l l 细胞凋亡过程中 线 粒体中的c y t oc 被释放到细胞质中 释放时间是u v c 处理细胞4 小时后 可见c y t oc 的释放是u v c 诱导细胞凋亡发生的信号转导通路中的事件之一 在哺乳动物凋亡系 统中 c y t oc 的促凋亡作用是通过激活p r o c a s p a s e9 实现的 从线粒体释放到细 胞浆中的c y t oc 与凋亡蛋白酶激活因子 a p a f 1 和p r o c a s p a s e9 相互结合组成 凋亡体 a p o p t o s o m e 激活的c a s p a s x 颀士学位论文 m a s t e r st h e s i s 的酶类 从而引发了细胞凋亡 线虫细胞凋亡和哺乳动物细胞凋亡的主要不同在于 线粒体不在线虫中起作用 但在哺乳动物的细胞凋亡中具有重要的作用 这体现了 凋亡系统的多样性 我们建立的凋亡系统既不同于线虫动物 也不同于哺乳动物 但在部分信号传导通路上似乎更相似于哺乳动物 由于u v 诱导细胞凋亡的信号通 路是一个综合的生化反应过程 但是本论文的结果中只从一个方面直接证明这条通 路的存在 结合最新研究进展和我们所进行的工作 本实验还需要进一步深入 希 望能够利用该系统探明昆虫细胞发生凋亡的通路与哺乳动物细胞发生凋亡的信号 通路的异同之处 参考文献 1 j o h n s o nkkv a i l l a n tf l a w e n 八p r o t e i nt y r o s i n ek i n a s ei n h i b i t o r sp r e v e n t d i d e n m i nb i n d u c e da p o p t o s i si nh l 6 0c e l l s j f e b sl e t t 1 9 9 6 3 8 3 1 5 2 1g o l s t e i np c e l ld e a t hi na sa n do t h e r s j s c i e n c e 1 9 9 8 2 8 1 1 2 8 3 3 i h ol l l sd e s c h e i b n e ra ul t r a s t r u c t u r a lc h a n g e s i ne pi d e r m a ll a n g e r h a n sc e l l sa n d m e l a n o e y t e s o f a b or i g i n a l a n d c e l t i c d e s c e n t f j b r j d e r m a t o l 1 9 8 8 1 1 9 2 1 4 1 k a n c r v ale l e c t r o nm i c r os c o pi co b s e r v a t i o no fs y s k e r a t o s i s a p o p t o s i s c o l l o i d b o d i e sa n df i b f i l l a rd e g e n e r a t i o na f t e ri r r i t a t i o nw i t hd i t hr a n ol j 1i jc u t a np a t h ol 1 9 9 0 1 7 3 7 5 i fr e n c hle w o hl w e n da s a p pi n oa p e ta 1 h u m a nc l u s t e r i ng e n ee x p r e s s i o ni s c o n f i n e dt os u r v i v i n gc e l l sd u r i n gi nv i t r op r o g r a m m e dc e l ld e a t h j jc l i ni n v e s t 1 9 9 4 9 3 8 7 7 6 g i l l a r d o nf e s c h e n f e l d e rc uhl m a n ne e ta 1 di f f e r e n t i mr e g u l a t i o no fc l o s f o s b c j u n j u n b b e l 一2a n d b a xe x p r e s s i o ni nr a ts k i nf o l l o w i n gs i n g l ea n dc h r o n i c u l t r a v i o l e ti r r a d i a t i o na n di nv i v om o d u l a t i o nb ya n t i s e n s eo l i g o d e o x y n u c l e o f i d e s u p e r f u s i o n 哪 o n c o g e n e 1 9 9 4 9 3 2 1 9 7 s c h r e i b e r m b a n m a n nb c o t t e tm e ta 1 f o si sa l le s s e n t i a lc o m p o n e n to ft h e m a m m a l i a nu v r e s p o n s e j e m b o j 1 9 9 5 1 4 5 3 3 8 8 s a h d e vs t a n e j atk e ta 1 b a c u l o v i r a lp 3 5i n h i b i t so x i d a n t i n d u c e da c t i v a t i o no f m i t o c h o n d r i a la p o p t o t i c p a t h w a y j l b i o ca n db i o pr e sc o m 2 0 0 3 3 0 7 4 8 3 4 9 0 9 1l o r e t f ad r e e ds d t h er o l eo fc y t o c h m m eci nc a s p a s ea c t i v a t i o ni n d o r o s o p h i am e l a m e g a s t e rc e l l s j c e l lb i o l 2 0 0 2 1 5 6 1 0 8 9 1 0 9 8 1 0 k r a e m e rk h s u n l i g h ta n ds k i nc a n c e r a n o t h e rl i n kr e v e a l e d j p r o cn a t la c a ds c i u s a1 9 9 7 9 4 1 1 4 1 1 y a r o s hd b u c a n ac c o xp a l a sk k i b i t e lj k r i p k em l l o c a l i z a t i o no fl i