微生物检验分支杆菌属及检验.doc

第二十四章分支杆菌属及检验本章考点：1.概述：概念2.结核分枝杆菌生物学性状临床意义微生物学检查及方法学评价3.非典型分支杆菌概念、种类鉴别培养方法检验方法学评价4.麻风分支杆菌：概述分枝杆菌属是一类细长或略带弯曲、为数众多（包括54个种）呈分支状生长的需氧杆菌。因其繁殖时呈分支状生长故称分枝杆菌。本属细菌的主要特点是细胞壁含有大量脂类，可占其干重的60%，这与其染色性、抵抗力、致病性等密切相关。一般不易着色，若经加温或延长染色时间而着色后，能抵抗3%盐酸酒精的脱色作用，故又称抗酸杆菌。需氧生长，无鞭毛，无芽胞和荚膜。引起的疾病均为慢性，有肉芽肿病变的炎症特点。分枝杆菌的种类较多，包括结核分枝杆菌、非典型分枝杆菌和麻风分枝杆菌。一、结核分枝杆菌结核分枝杆菌简称结核杆菌，是引起人和动物结核病的病原菌。目前已知在我国引起人类结核病的主要有人型和牛型结核分枝杆菌。（一）生物学特性1.形态与染色：结核分枝杆菌为细长或略带弯曲的杆菌，其大小约（14）m0.4m。在培养基中可呈球状或丝状，陈旧培养物或干酪化的淋巴结中可见到分枝状。抗酸染色时菌体呈红色。显微镜下常堆积成团、成束，排列无序，也有呈链状、索状者。革兰染色阳性，既往在组织中曾发现革兰阳性的非抗酸颗粒，接种动物可产生典型的结核病变，后被称为Much颗粒。金胺“0”等染色，在荧光显微镜下菌体可发生荧光。2.培养特性：本菌专性需氧，在无氧条件下迅速死亡，在5%10%C02环境中可刺激其生长。烛缸不适合本菌培养，需用二氧化碳培养箱。培养温度适应范围较大，3540均可生长，最适温度为3537。最适pH为6.56.8。兼性胞内寄生菌，在细胞内外均可发育繁殖，强毒株可长期生存于巨噬细胞内。生长时还需适当的湿度。本菌生长缓慢，最快的分裂速度为18h一代。在固体培养基上，一般需26周才能长出菌落。菌落呈干燥颗粒状，不透明，乳白色或米黄色，表面呈皱纹状，形似菜花。在液体培养基中生长较快，多为表面生长，形成菌膜，且干燥易碎而沉于管底。此种特性与菌体的疏水性有关。有毒力菌株在液体培养基中可呈索状生长，无毒株则无此现象。结核分枝杆菌营养要求较高，必须在血清、卵黄、马铃薯、甘油以及某些无机盐类的特殊培养基（罗氏培养基）上才能生长。但经多次传代或长期保存的菌种，也能在营养较简单的培养基中生长。据报道少量铁质可促进结核分枝杆菌生长，铁质可使细菌产生分枝杆菌生长素。选择培养基加有抗微生物药物，以抑制标本中杂菌、真菌等污染菌的生长。常用的选择剂有结晶紫、孔雀绿、青霉素、萘啶酸、林可霉素、多粘菌素B等。3.生化反应：各型结核杆菌均不发酵糖类，能产生过氧化氢酶，耐热触酶试验、聚山梨酯-80水解试验和耐热磷酸酶试验均为阴性，脲酶试验和中性红试验均为阳性。人型结核分枝杆菌烟酸试验、硝酸盐还原和烟酰胺酶试验均为阳性，借此可与牛型结核分枝杆菌鉴别。4.抵抗力：对酒精敏感。5.变异性：形态、菌落、毒力、免疫原性和耐药性等变异。毒力变异：卡介苗（BCG）将有毒的牛型结核分枝杆菌培养于含有甘油、胆汁、马铃薯的培养基中经13年传种230代，获得减毒菌株，再接种动物，不能致病而使其获得免疫力。用于预防结核病。（二）临床意义1.致病性：该菌不产生内毒素和外毒素和侵袭性酶。可在细胞内、外生长与大量繁殖，致病物质主要是荚膜、脂质、蛋白质。结核分枝杆菌主要通过呼吸道、消化道和受损伤的皮肤侵入易感机体，引起多种组织器官的结核病，其中以通过呼吸道引起的肺结核最多见。肺部感染可分为原发性感染和继发性感染。肺外感染可发生在脑、肾、肠、及腹膜等处。机体对菌体成分和其代谢产物引起免疫损伤以及变态反应，从而导致一系列组织学上的病理变化。（机理）2.Koch现象：机体对结核分枝杆菌的特异性免疫和迟发型超敏反应同时存在。结核的特异性免疫是通过结核分枝杆菌感染后所产生，试验证明，将有毒结核分枝杆菌纯培养物初次接种于健康豚鼠，不产生速发型过敏反应，而经1014d，局部逐渐形成肿块，继而坏死，溃疡，直至动物死亡。若在812周之前给动物接种减毒或小量结核分枝杆菌，第二次接种时则局部反应提前，于23d内发生红肿硬结，后有溃疡但很快趋于痊愈。此现象为Koch在1891年观察到的，故称为Koch现象。免疫性和迟发型超敏反应由不同的T细胞亚群介导。3.结核菌素试验：利用型变态反应的原理，检测机体是否感染过结核杆菌。本实验对婴幼儿结核病的诊断有意义。（三）微生物学检验1.标本采集：根据感染部位的不同，可采集不同标本。结核患者各感染部位的标本中大多都混有其他细菌，为此应采取能抑制污染菌的方法。若作分离培养，必须使用灭菌容器，患者应停药12天后再采集标本。可采集痰、尿、粪便、胃液、胸水、腹水、脑脊液、关节液、脓液等。2.检验方法（1）涂片检查直接涂片包括：1）薄涂片：挑取痰或其他处理过的标本约0.01ml，涂沫于载玻片上，用萋-尼（热染法）或Kinyoun（冷染法）抗酸染色，油镜镜检，报告方法：-：全视野（或100个视野）未找到抗酸菌；+：全视野发现39个；+：全视野发现1099个；+：每视野发现19个；+：每视野发现10个以上（全视野发现12个时报告抗酸菌的个数）。2）厚涂片：取标本0.1ml，涂片，抗酸染色、镜检，报告方法同上。3）集菌涂片：主要方法有沉淀集菌法和漂浮集菌法。4）荧光显微镜检查法：制片同前。用金铵“O”染色，在荧光显微镜下分枝杆菌可发出荧光。（2）分离培养1）固体培养法：结核分枝杆菌的分离培养对于结核病的诊断、疗效观察及抗结核药物的研究均具有重要意义。培养前针对标本应做适当的前处理，如痰可做4%H2S04或4%NaOH处理2030min，除去杂菌再接种于罗氏培养基，375%10%C02培养，定时观察，至48周。此方法可准确诊断结核杆菌。2）液体培养法：Bactec-460半自动培养方法，Bact，Vitck-3D，全自动快速培养系统。3）噬菌体法。（3）基因快速诊断：PCR反向膜探针杂交，DNA探针，16s rRNA基因序列测定，高效液相色谱（HPLC）监测分枝菌酸。简便快速、灵敏度高、特异性强。但需注意实验器材的污染问题，以免出现假阳性。（4）耐药性：结核杆菌对多种抗结核药物产生耐药性，对利福平耐药是由rpoB的基因突变，链霉素耐药是和编码核糖体S12蛋白的rpsl基因发生突变以及编码16SrRNA的rrs基因发生突变，异烟肼的耐药与过氧化氢酶和过氧化物酶的失活有关。（四）治疗原则利福平、异烟肼、乙胺丁醇、链霉素为第一线药物。利福平与异烟肼合用可以减少耐药的产生。对于严重感染，可用吡嗪酰胺与利福平及异烟肼联合使用。二、非典型（非结核）分枝杆菌分枝杆菌属中除结核杆菌和麻风杆菌以外，均称为非结核分枝杆菌或非典型分枝杆菌。因其染色性同样具有抗酸性亦称非结核抗酸菌，其中有1417个非典菌种能使人致病，可侵犯全身脏器和组织，以肺最常见，其临床症状、X线所见很难与肺结核病区别，而大多数非典菌对主要抗结核药耐药，故该菌的感染和发病已成为流行病学和临床上的主要课题，与发达国家一样，我国近年来发现率也有增高趋势。以第群鸟-胞内分枝杆菌和第群偶发分枝杆菌及龟分枝杆菌为多。三、麻风分枝杆菌麻风分枝杆菌（M Leprae）简称麻风杆菌，是麻风病的病原菌。首先由Han-senl937年从麻风病人组织中发现。麻风分枝杆菌亦为抗酸杆菌，但较结核杆菌短而粗。抗酸染色着色均匀，呈束状或团状排列。为典型的胞内寄生菌，该菌所在的细胞胞质呈泡沫状称麻风细胞。用药后细菌可断裂为颗粒状，链状等，着色不均匀，叫不完整染色菌。革兰阳性无动力、无荚膜和芽胞。麻风分枝杆菌是麻风的病原菌，麻风是一种慢性传染病，早期主要损害皮肤、黏膜和神经末梢，晚期可侵犯深部组织和器官，此菌尚未人工培养成功，已用犰狳建立良好的动物模型。人类是麻风分枝杆菌的唯一宿主，也是唯一传染源。本病在世界各地均有流行，尤以第三世界较为广泛。麻风病根据机体的免疫、病理变化和临床表现可将多数患者分为瘤型，结核样型和界线类综合征。治疗原则：早发现，早治疗。治疗药物主要有砜类、利福平、氯苯吩嗪及丙硫异烟胺。一般采用二或三种药物联合治疗。麻风病目前尚无特异性预防方法。本章练习题：卡介苗是经反复传代培养而获取的毒力减弱而抗原性保留的变异株，其用于预防A.结核病B.百日咳C.白喉D.破伤风E.哮喘答疑编号500735240101正确答案A痰标本经抗酸染色找到结核分枝杆菌，报告为“+”的细菌数量为A.每100个油镜视野19个B.每10个油镜视野19个C.每个油镜视野19个D.每100个油镜视野10100个E.每5个油镜视野19个答疑编号500735240102正确答案B 与结核分枝杆菌抗酸性有关的成分是A.磷脂B.蜡质DC.分枝菌酸D.索状因子E.硫酸脑苷脂答疑编号500735240103正确答案C 不以内毒素或外毒素为致病物质的细菌是A.铜绿假单胞菌B.炭疽芽孢杆菌C.布鲁菌D.结核分枝杆菌E.白喉棒状杆菌答疑编号500735240104正确答案D 卡介苗是A.经甲醛处理后的人型结核分枝杆菌B.发生了抗原变异的人型结核分枝杆菌C.发生了抗原变异的牛型结核分枝杆菌D.保持了免疫原性的减毒牛型结核分枝杆菌E.保持了免疫原性的减毒人型结核分枝杆菌答疑编号500735240105正确答案D第二十五章非发酵菌及检验本章考点：1.概述：概念2.假单胞菌属概念分类铜绿假单胞菌临床意义和微生物学检查3.不动杆菌属、产碱杆菌属、莫拉菌属、黄杆菌属一、概述非发酵菌主要是指一群不发酵或不分解糖类的革兰阴性无芽胞需氧杆菌。目前，非发酵菌包括13个属。主要有假单胞菌属、不动杆菌属、产碱杆菌属、莫拉菌属、黄杆菌属等。这些细菌大多为条件致病菌。对于非发酵菌的鉴定，必须首先进行种属间的鉴别，然后进行种间的鉴定。一般实验室只需用几项试验，如氧化酶、O-F试验、动力及鞭毛、菌落色素、硝酸盐还原试验以及在麦康凯琼脂上的生长情况等即可对90%95%分离的菌株作出初步鉴定。1.培养温度：多数非发酵菌适宜生存于自然界，培养温度以30为宜。有的更适宜生长于室温（1822）。故常规标本应先培养于3537，再培养于30或室温。2.动力与鞭毛：在非发酵菌的鉴定中，细菌是否具有鞭毛及鞭毛的特点有重要的诊断意义。由于非发酵菌大部分为专性需氧菌，在半固体培养基上观察动力不明显，因细菌在琼脂表面生长，底层穿刺生长不良或不生长，故观察非发酵菌的动力以30或室温1224h培养物悬滴法为准。有时需借助鞭毛染色予以鉴定。3.氧化酶试验：该试验是鉴定非发酵菌的重要试验，非发酵菌中除不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌及个别假单胞菌外，氧化酶试验均为阳性。4.氧化-发酵（O-F）试验：本试验是确定非发酵菌与发酵菌以及测定非发酵菌是否利用糖的基本试验。非发酵菌对葡萄糖的代谢特点是氧化型产生微量酸。在氧化-发酵（O-F）试验中，应为开管产酸，闭管不变。5.在麦康凯琼脂上生长情况：如假单胞菌属、不动杆菌属、产碱杆菌属等生长，而莫拉菌属和艾肯菌属等不生长。非发酵菌几种主要菌属的基本特征见表5-25-1。表5-25-1非发醇菌主要菌属的基本特征菌属葡萄糖OF氧化酶悬滴动力鞭毛触酶硝酸盐还原麦康凯培养基生长假单胞菌属O/端鞭毛/不动杆菌属O/无产碱杆菌属周毛/莫拉菌属无/黄杆菌属O/F无/端鞭毛/无色杆菌属O周毛土壤杆菌属O周毛金氏杆菌属无/艾肯菌属无二、假单胞菌属假单胞菌属为一大组革兰阴性杆菌，大量存在于水、土壤和空气中。在人类感染的非发酵菌中，假单胞菌属约占70%80%，主要为铜绿假单胞菌（约55%65%）。其次为嗜麦芽窄食单胞菌、荧光假单胞菌、恶臭假单胞菌、产碱假单胞菌等。这些菌株也是医院感染的主要病原菌。本属菌为无芽胞、无荚膜的革兰阴性杆菌。大小（1.53.0）m（0.51.0）m，多有极端鞭毛，为专性需氧菌。最适温度为3037，营养要求不高，能在普通琼脂上生长。许多菌株能产生水溶性色素和多种胞外酶。（一）铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌是假单胞菌属的代表菌种，俗称绿脓杆菌。是医院感染的主要病原体之一。1.生物学特性（1）形态与染色：本菌为细长革兰阴性杆菌，大小为（1.55.0）m（0.51.0）m，无芽胞，无荚膜。有13根鞭毛，运动活泼。（2）培养特性：为专性需氧菌，生长温度为2542，最适温度为35，但在4不生长，此点可与荧光假单胞菌区别。在普通琼脂平板培养基上，经1824h培养，可形成圆形大小不一，边缘不整齐、扁平、隆起、光滑、湿润的菌落。在血液琼脂平板和麦康凯琼脂培养基上，可形成5种不同形态的菌落：典型型；大肠菌样型；粘液型；侏儒型；粗糙型。在肉汤中经351824h培养，液面可形成菌膜，细菌在深层发育不良，呈微混浊或透明状，菌液上层为蓝绿色。铜绿假单胞菌产生的主要色素包括：绿脓素（水溶性色素），为蓝绿色，可溶于水和氯仿，无荧光性；荧光素为绿色荧光素，溶于水而不溶于氯仿。本菌产生绿脓素的菌株约75.5%，产生荧光素的菌株约89.9%。（3）生化反应：氧化酶阳性，能氧化分解葡萄糖、木糖，产酸不产气。本菌能利用枸橼酸盐，不产生吲哚，不产生H2S，能液化明胶，分解尿素，还原硝酸盐并产生N2。2.致病性：铜绿假单胞菌有多种毒力因子，如粘附素、多糖荚膜、外毒素、绿脓素、弹性蛋白酶、磷脂酶C。铜绿假单胞菌引起的局部感染常见于烧伤或创伤后，亦可引起中耳炎、角膜炎、尿道炎和下呼吸道感染，甚至引起心内膜炎、肺炎，严重者可引起败血症，死亡率甚高。耐药性：该菌具有多重耐药，主要是微孔蛋白的突变，可阻止抗生素由外膜进入胞质。初代敏感菌株在治疗34天后可能发生耐药。菌株对亚胺培南耐药主要原因之一是产生金属酶。3.微生物学检验（1）标本采集：根据病情可采集相应的临床标本，如血液、脑脊液、胸水、腹水、尿液、脓液以及分泌物等。（2）检验方法及鉴定1）直接涂片镜检：绿色脓汁，分泌物可直接涂片，脑脊液、胸、腹水可直接或离心后取其沉淀物涂片，染色并镜检。2）分离培养：血液及体液标本可先增菌后再转种血琼脂和麦康凯琼脂，脓液、分泌物、中段尿等可直接接种上述培养基分离培养。3）初步鉴定：可依据菌落特征、色素（约10%菌株不产生色素）、气味等以及涂片染色结果，氧化酶试验。最后鉴定：铜绿假单胞菌的最后鉴定仍主要依据生化反应特征，借此与其他假单胞菌相鉴别。对于不产生色素的铜绿假单胞菌若硝酸盐还原试验、明胶液化、精氨酸双水解酶以及0.2%硫酸铜营养琼脂生长试验均为阳性时仍提示本菌的可能。4.治疗：最大剂量应用青霉素，头孢他啶和氨基糖苷类抗生素联合治疗。（二）嗜麦芽窄食单胞菌端鞭毛18根，有动力、无芽胞、无荚膜，菌落不溶血，有黄色素。氧化酶阴性，葡萄糖缓慢氧化，可水解七叶苷，液化明胶，DNA酶阳性并可使赖氨酸脱羧，氧化分解麦芽糖。本菌为条件致病菌，引起呼吸道、泌尿道、伤口感染，严重致菌血症、心内膜炎。该菌在非发酵菌引起的感染中分离率仅次于铜绿假单胞菌和不动杆菌。治疗：首选磺胺类：TMPSMZ；喹诺酮类：环丙沙星或替卡西林克拉维酸。对亚胺培南天然耐药不应选用。三、不动杆菌属菌体为球杆状，并成对排列，可单个存在，无芽胞、无鞭毛、专性需氧菌。其生物学特征为“三阴”，即氧化酶阴性，硝酸盐还原试验阴性和动力阴性。临床