（特种经济动物饲养专业论文）PCR引发的mtDNAD环重复区假异质性及其机制的研究.pdf

摘要 摘要 哺乳动物m t d n ad 环区的异质性表现为不同线粒体拷贝中碱基的点突变和重复区 序列氏度的变化 近年来有的报道显示 一些物种d 环重复区长度异质性非常高 似乎 线粒体中对d n a 复制错误的修复能力很低 这与以往的认识相矛盾 为了确认上述报 道中的 高度异质性 是否真实存在 我们采用了报道中所常用的p c r 方法 研究了蓝 狐 爿f 叩蹦f 口即p h j 黑熊 f 册o m 协加f d e 船n s 棕熊 昕s 5n c 姗 狗 o 月括 廊删i 厅口r 括 狼 o n 括f p 5 虎 砌砌e r 妇r 括 的相应区域 结果显示 在蓝狐 黑熊 棕熊 狗和狼 无论以总d n a 为模板 还是以p a g e 电泳纯化的扩增产物或克 隆质粒为模板 扩增产物在8 p a g e 胶上都表现为梯状谱带 相邻条带之间相差1 个 重复单位 说明这种梯状谱带是一种p c r 引发的假异质性 进一步研究显示 这种假 异质性与引物无关 在一定程度上受d n a 聚合酶种类的影响 但不能被消除 虎在上 述实验中均不出现梯状谱带 通过r n a s t r u c t u r ev 3 7 软件对上述物种重复区序列的结构 进行分析发现 不同的重复序列可以产生不同的周期性二级结构 当新链延伸到达这样 的结构时 d n a 聚合酶就有可能与该高级结构的双链位置结合 而新生链起到引物作 用 使聚合酶有机会将链的延伸越过一个或几个重复单位 或者转移到与原模板链相同 或同源的链上 我们据此提出了p c r 过程中产生假异质性的可能机制 并认为用p c r 方法来研究d 环重复序列的异质性具有极大的风险性 关键词 d 环 重复序列 异质性 p c r 滑动 东北林业人学坝 j 学位论文 a b s t r a c t h e t e r o p l a s m yo fd l o o pr e g i o no fm a m m a l j a nm t d n a r e v e a i e ds i i em u t a t i o na n dr e p e a i n u m b e rv a r i a t i o n c o m p e l l i n gs t u d i e sr e p o r c e d t h a ts o m es p e c i e se x h i b i t e dv e r yh i 曲 h e t e i o p l a s my i n d i c a t i n gl o wa b i l i t yo fe r r o rc o r r e c t j o ni nt h ep r o c e s so fd n ar e p l i c a t j o ni n m j t o c h o n d r i a w h i c hc o n n i c c s w j t he x j s t m gk n o w l e d g e i no r d e rt o c o n f i r mt h et r u t ho f h e t e r o p l a s m y a sr e p o r t e d w es l u d i e dr e p e a t i n gs e q u e n c e so fd l o o pr e 百o no fs e v e r a l c a r n i v o r es p e c i e sn a m e l yb l u ef o x 口f d p 麟缸9 9 p h s b l a c kb e a r e f e n d m f 珊咖i 凸e m m 岱 b r o w b e a r u 坩 sn r c 幻s d o g c 口n 时如 f f 如r i 5 w o l f c k h 括啦p 船 a n dt 噜e r 托咒 已r 以f i 矿曲 b yu s i n gp c rs t r a t e g yt h a ti sc o m m o n l yu s e di n t h o s er e p o r t s r e s u l t si n d i c a t e dt h a tp c r p r o d u c t sa l w a y s 印p e a r e d a sl a d d e 卜l i k e dp a t t e mo n8 p j a g eg e l d e s p i t et e m p l a t e db yw h o l e d n a p u r i f i e do rd o n e dp c rp m d u c t t h el e n g t hd i f f e r e n c eb e t w e e na d j a c e n tb a n d sw a so n e r e p e a tm o t i f i ts u g g e s t e dt h a tt h eh i g hh e t e r o p l a s m ym i g h tb eaf a c kr e s u l ti n d u c e db yp c r f u r t h e re x p e r j m e n t sc o n f i h n e ds u c hp s e u d o h e t e r o p l a s m yw a sn o tr e l a t e dt op i m e r b u tm a yb e a s s o c i a t e dw i t ht h et y p eo fd n ap o l y m e r a s et oac e i t a i ne x t e n t b u tn o tt o t a l l ye l i m i n a t e d 1 1 9 e rd i dn o tp r o d u c el a d d e r l i k e dp a t t e mi na l le x p e r i m e n t s t h ea n a l y s i so fr e p e a tm o t i f 夸o f t h e s es p e d e su s i n gs o f t w a r er n a s t r u c t u i ev 3 7r c v e a l e dd i f f e r e n tm o t i fm i g h tg e n e r a t e d i 丘色r e n t p e r i o d i cs e c o n d a r ys t r u c t u r ew h e r ed o u b l es t r a n d e ds t r u c t u t e s w e r ea v a i l a b l ef o r b i n d i n gd n ap o l y m e r a s e b a s e do n a b o v er e s u l t sa n da n a l y s i s w ep r o p o s e dap o s s i b l e m e c h a n i s mi n d u c i n gt h ep s e u d o h e t e m p l a s m yd u r i n gp c rp m c e s s t h en a s c e n ts t r a n da st h e p r i m e r d n ap o l y m e r a s e1 0 s to n e o rs e v e r a lo fr e p e a t j n gm o t i f s o rt r a n s f e r r e dt h eo t h e rs a m e o rh o m o l o g o u ss t r a n d f i n a uy o u rr e s u l t ss u g g e s t e dt h a tt h e r eb eat i s kt os t u d yh e t e r o p l a s m y o fr e p e a t i n gr e g i o no fm t d n a d 1 0 0 pr e g i o nu s i n gp c rs t r a t e g m k e y w o r d sd 1 0 0 p r e p e a ts e q u e n c e h e t 盯o p l a s m 弘p c r s h p p a g e 1 绪论 1 1 线粒体的一般性结构与特点 线粒体 m i t o c h o n a 1 是细胞巾进行呼吸作用 能量代谢的重要细胞器 是高等 动物唯一的核外遗传物质i ij 线粒体存在于除成熟的红细胞以外的所有哺乳动物细胞 中 其数目与细胞种类有关 不同种类的细胞中差异很大 例如 在肝细胞 肾脏细 胞 胃壁细胞中的线粒体较多 而淋巴细胞 表皮细胞和未分化细胞中线粒体较少 一 般一个正常肝细胞含有1 0 0 0 2 0 0 0 个线粒体 每个线粒体中通常含有几个或几十个相同 的d n a 分子 由于线粒体d n a 的遗传特质和便于操作的特点 其作为遗传标记广泛地应用于物 种起源进化及群体遗传分化的研究 1 1 1 线粒体d n a m t d n a 基本结构 自从1 9 8 1 年a n d e r s o n 等测定了人线粒体基因组的全序列以来 目前已测定了几十 个物种的线粒体基因组全序列 如 人 普通牛 黄牛 马 大鼠 小鼠 鸡 海 豹 鲤鱼 虹鳍 果蝇等 哺乳动物m t d n a 大小较为恒定 不同物种间差异较 乜一般为1 6 o 1 6 5 k b h a t p a 0b t p a s e 日 削l 一 线粒体基吲组结构示意h 线粒体d n a 是共价闭合的环j 扶双链d n a 分子 依据两条链所含碱基的成分 分 为轻 l 链和重 h 链 均具有编码功能 除蛋白质基蚓n d 6 和其中的8 个t r n a 基阋由l 链编码外 其余的基闻均 h 链编码 5 m t d n a 分为编码区和非编码区 义 称控制区或d 界区 编码区内有3 7 个糖因 2 个r r n a 綦因 1 6 s r r n a 和 东北林业人学硕 卜学位论文 1 2 s r r n a 2 2 个t r n a 基因 t a t r t n t c t q t d t f t g t h t i t l l t l 2 t k t m t f t p t s l t s 2 t r t w t y t v 1 3 个蛋白质基因 c v t c 氧化酶亚基c o i c o i i c o i i i c v t b a t p a s e 6 a t p a s 8 n a d h 的6 个亚基 n d l n d 3 n d 4 n d 5 n d 6 n d 4 l 6 7 1 1 1 2 线粒体d n a 遗传特质 1 1 2 1m t d n a 分子排列紧凑 无内含子 m t d n a 基因排列十分紧凑 2 个r r n a 基因紧紧相邻 2 2 个t r n a 基因位于r r n a 和1 3 个蛋白质基因之间 除与m t d n a 复制和转录有关的一段区域外 其它序列无内含 子和转座子 也没有基因间隔序列 即使有也仅为一或数个核苷酸 存在基因重叠现 象 在脊椎动物中 t p a s e 8 和a r p a s e 6 基因间有2 4 6 个碱基重叠 n d 4 l 和n d 4 基因 间有7 个碱基重叠 脊椎动物 除有袋类和鸟类中有微小变化外 m t d n a 基因数量 功能及排列方式却非常相似 1 1 2 2m t d n a 的核苷酸组成不均一 m t d n a 分子中a t g c4 种碱基偏离了随机平均组成 g c 的摩尔分数为 3 7 5 0 1 1 2 3m t d n a 的进化特征 在m t d n a 复制过程中 y 一多聚酶不具有3 一5 的外切酶功能 使得碱基错配率较 高 约每1 0 0 0 个核苷酸中就掺入1 2 个错配核苷酸 线粒体是进行氧化磷酸化等多种 代谢反应的场所 缺乏组蛋白的保护 直接暴露在氧化代谢反应的中间产物和自由基 中 易被诱导 产生突变 而且每个细胞中含有大量拷贝的线粒体 少量线粒体d n a 的突变不会影响细胞的正常活动 其选择压力较小 进化速率远高于核d n a u p h o l l 和d a w i d 对绵羊 山羊m t d n a 的研究 估计m t d n a 核苷酸的替代率每代约为1 0 8 是核d n a 变异速度的5 1 0 倍 8 9 其中 线粒体调控区进化速率最快 编码基因和 t r n a 基因居中 r r n a 基因最慢 动物m t d n a 的进化是以碱基替换 转换和颠换 为 主 碱基插入和缺失较少 替换主要发生在非编码区 以转换为主 1 0 1 1 2 4m t d n a 的密码特性 m t d n a 的遗传密码 反密码子及密码识别机制与核基因编码规律有所不同 对人 线粒体密码子的分析发现 u g a 编码色氨酸 而不是通常的终止密码 a g a a g g 不 是精氨酸的密码子 而是终止密码子 再加上通用密码子中u a a 和 u a g 线粒体基因 组共有4 个终止密码子 在密码识别上 编码同种氨基酸的密码组出同一t r n a 识别 线粒体自身的2 2 个t r n a 就足以识别m t d n a 的所有氨基酸的编码基因 j 1 1 2 5m t d n a 的母性遗传 哺乳动物受精卵的细胞质几乎全部来自雌性配子 而m t d n a 通过细胞质传到下一 代 通过m l d n a 可以鉴别不同母系集团的个体 b o r s i 1 9 7 2 在受精过程中 大多 数精了的m t d n a 不进入卯细胞 卵母细胞或早期胍胎中可能存在抑制精子m t d n a 复 l 绪论 制的特殊机制 1 3 l 有报道表明 在一些物种中存在概率极低的父系渗入 p a t e m a i l e a k a g e 现象 但 卵母细胞含有1 0 5 1 0 8 个线粒体 而精子中仅有5 0 1 0 0 个线粒体 受精卵中母系m t d n a 在数量上占绝对优势m l h u t c h i s o n 等 1 9 8 0 用d n a 内剀酶分析证实马 雌 与驴 雄 杂交后代的m i d n a 与马的完全一致 而驴 雌 与马 雄 杂交后代的m t d n a 与驴的一致 表明m t d n a 遵从母系遗传方式 也有报道表明线粒体存在重组现象 1 6 一l 8 1 根据线粒体d n a 的遗传特点和p c r d n a 序列分析等分子生物学技术的迅速发展 和广泛应用 线粒体d n a 广泛的应用在动物进化遗传学 分子生态学 遗传多样性及 物种保护等研究领域 成为当前分子生物学的研究热点之一 1 2 线粒体控制区 1 2 1 线粒体控制区的结构 线粒体控制区 c o n t r o lr e g i o n c r 又称为d 环区 d i s p l a c e m e n t1 0 0 p d l o o p 非编码区 n o n c o d i n gs e c t i o n 是线粒体d n a 的调控区和唯一的非编码区 也 是线粒体中序列和长度变异最大的区域 哺乳动物的线粒体d 环区结构较为相似 位于t r n a p h 和t r n a p m 基因之间 b a k e r 1 9 9 7 根据碱基 a 的比率 把控制区分为三个部分 左功能域 1 e f td o m a i n 中问保守域 c e n t r a lc o n s e e dd o m a i n c d 右功能域 i i 曲td o m a i n 左功能域又称 为终止序列区 e x t e n d e dt e r m i n a t i o na s s o c i a t e ds e q u e n c e s e t a s 位于d 1 0 0 p 的5 端 右功能域又称为保守序列区 c o n s e r v e ds e q u e n c eb l o c k s c s b s 位于d l o o p 的3 端 左 右功能域为碱基a 富集区 具有较高的突变率 又称为高变区 其中左功能域 含有终止相关序列 t a s 和高变区i h v i 右功能域含几段保守区 c s bi i i i i i 和高变区i i h v 重复序列通常发生在h v i 和h v l l 中间保守域序列变异相对 较小 通常分为f e d c b 区 在鸟类中d 一1 0 0 p 中央保守区被命名为d o m a i n 两边相接的h v s i 和h v s i i 区域分 别称为d o m a i ni 和d o m a i ni d o m a i ni i 含有3 个保守区 f d c 而c s bi l 与 c s b i i i 合并 在爬行类中 线粒体的控制区结构与其它脊椎动物的相似 一些研究者认为可将鳄 类m t d n a 控制区其分为3 个区段 区段1 为e t a s 结构域 比哺乳动物的略短一些 变异性较高 具有茎环结构和t a s 区段2 为中心保守结构域一般变异较少并含有若干 功能尚不清楚的高度保守序列 区段3 类似于哺乳动物的右功能域 通常含有重链和 d 1 0 0 p 链的转录启动子 c s b 重复序列和p o l y a 结构 具有较高的变异性 关于无脊椎动物的m t d n a 控制区的研究较少 在甲壳类 4 r f 酣h 肠舳n c 括c 口h n 研 究中 发现其d 环区含有一个主要和几个次要的复制起点例 在果蝇 d m 5 d 口 池 巾 控制区富含a 仃 为t 隹向复制起点的调控区 g o d d a r d l 1 9 8 0 认为是新生链的合 东北林 世人学顾i 学位论文 成起点 能形成类似于哺乳动物的茎环结构 果蝇 d 阳s 叩 妇 的控制区分为三部 分 左边区域紧靠t r n a 无1 1 a s 结构 中央为高保守区 右边区域是高变区 位于 1 2 s r r n a 基因的5 端 c s b 位于d 环区3 端 被认为是h 链复制起始时r n a 引物的加工信号 其中 c s bi 是最保守的成分 除肺鱼外 几乎所有的脊椎动物中都有c s bi 鳕鱼只有c s b 鸡无c s b i i 在牛 海豚 羊 鲸中c s b i i i 缺失 3 j d 环区包含重链复制起点 o h l 链启动子 l s t r a n dd r o m o t e r l s p h 链启动 子 h s t r a n dp m m o t e r h s p 保守序列区段 c s b 和终止结合序列 t a s 其变异 可能会影响m t d n a 的复制和转录 改变代谢速率 i h z p c n t r t 工t p 日 厂 若互 卡 一 型司固掣哗 鬯零幂啉 图1 2 线粒体d 环区结构示意图 1 2 2 线粒体控制区的遗传特点 线粒体编码区的突变往往导致细胞部分功能的缺陷 所以在进化中具有较高的保守 性 而线粒体非编码区由于选择压力小能在进化过程中产生更多的突变 并将这些突变 保存下来 有研究表明 d 环碱基替代率是线粒体其他部分的2 8 5 倍 h o r a i 1 9 9 6 对线粒体d 环区的研究 可获得较高的核酸变异信息 对种内群体或个体间的遗传分化 及遗传结构进行研究 3 4 枷 对探讨一些快速形成的物种 d 环区提供的信息可能更有价 值 1 3 线粒体d 环异质性 线粒体d 环区具有高突变率 进化速度快的遗传特性 作为遗传标记之一 常用于 对近缘种 亚种 群体和个体间的遗传多样性 母系来源 物种鉴定等方面的研究 依 据线粒体母性遗传 缺乏重组的遗传特点 在一个个体或一种细胞里通常只应有一种类 型的m t d n a 分子 但随着对线粒体的深入研究 发现在同一个体中存在m t d n a 异质 性的现象 m t d n a 异质性 h e t e r o p l a s m y 是指在一个个体内存在不同类型的m t d n a 分子 线粒体异质性可分为两类 由碱基的差异形成的点突变和山重复单位重复次数的 不同导致的长度差异 1 3 1 点突变 点突变 s i m p l em u t a t i o n 指存个个体 p 线粒体存存个或多个位点的碱基差 异 由于j 托突变是一个个体中线粒体d n a 碱墓的差异 征长度上变化不大 比较难以 发现 使得有关的报道较少 在人的某些疾病研究中 发现存在m t d n a 点突变的现象 w a l l a c e 1 9 9 9 认为一 些疾病能导致线粒体产生点突变 使同一个体中存在不同类型的线粒体分子 4 j a z i n 1 9 9 6 和p a r s o n 1 9 9 7 认为在对人体的研究中 点突变只是偶尔被发现m 4 但近 来一些学者认为人体中线粒体的点突变比以前认为的更普遍h 4 一些研究者认为人体 中线粒体的点突变与年龄有关 随着年龄的增长 点突变在人体中积累 但m a r i a h g e r s t r o 2 0 0 1 对1 0 一2 0 年前发现的在线粒体n t 3 0 9 和n t l 6 1 8 9 8 存在异质性的四名妇 女的宫颈细胞的研究 发现在这些位点的点突变的比率很稳定m 4 引 1 3 2 重复次数可变的重复序列 在哺乳动物 鸟 爬行 两栖 鱼和无脊椎动物的一些物种中 均发现线粒体d 一 1 0 0 p 区存在着重复序列重复次数的差异 4 9 5 0 j 线粒体d 环区重复序列的碱基排列方式 在物种水平甚至更高阶元的水平上具有相对稳定性1 5 l 5 2 j 在同一物种中 重复序列重复 次数的差异是导致线粒体长度变化的主要原因 h o e l z e l 1 9 9 3 1 认为在m t d n a d 环存在五个重复序列区 并命名为r s l 5 在不同分 类阶元中重复序列的数量和位置有所差别1 5 c o n r 州m g i o n t r m p t r n p h e 图1 3 线粒体d 环重复区r 1 5 结构示意图 1 3 2 1 线粒体d 环重复序列差异的研究概况 果蝇 d 印 i 肠 p f 口厅d 删s 鲫 线粒体d n a 重复区富含a t 由两种重复序列组 成 第一种重复单位长3 3 8 3 7 3 b p 第二种重复序列长4 6 4 b p 在d 卅e f n d g 口j 陀 中有 三个序列具有高保守性 位于d n a 复制起始的3 0 0 b p 不同种果蝇中a t 区长度为1 5 k b 不等 在一些种的不同群体和个体中存在长度变化 5 4 1 在鸭嘴兽 研n i 腩d 而y 如 s h 口f 胁 s 的线粒体控制区发现有两种重复序列 位于线粒体控制区的3 端 为 5 1 1 t g a a a a a 3 和 5 一c t a t t i t g a g g a a t y a a a a a 3 在中华鲟 爿c 咖已甩j 已 s i n s 如 白鲟 a a e 肌 r sg f 咖s 高首鲟 ar d n s m o 月f m s r 本牙鲆 p 甜盯比矗f 1 vs o 咖 c p s 条纹鲈 m o 曰n 已跚瑚棚s 弓鳍鱼 爿 7 j 肠c 口加口 等多种鱼 中发现存在线粒体的长度异质性1 5 6 张四明等 1 9 9 9 对中田鲥线粒体d 月 区的p c r 扩增测序 发现个体问和个体内 存在m t d n a 长度变异 其重复序列长约8 2 b p 靠近i r n a 9 个体内m t d n ak 度异质 东北林业大学顾lj 学位论义 性为5 7 4 在异质性个体中 2 种分子的异质体最普通 为7 7 7 8 3 种类型的分子 组合为1 8 5 2 4 种组合的为3 7 0 没有发现5 种不同重复类型的异质体 对4 7 尾 中华鲟个体内和个体间的遗传多样性的分析 发现有6 5 3 遗传变异表现在群体内的个 体中 有3 4 7 的遗传变异表现在个体内 并认为可通过m t d n a 长度异质性研究中华 鲟群体的遗传多样性hj c a m i l l a 1 9 9 8 利用p c r 扩增 克隆菌株测序的方法 对河鲈 n m n 砌v 缸 胁 梅花鲈 卅c p 砌口c p m 口 和暗斑梭鲈 鼢陀讲伽觑c 尬妒 线粒体控制 区重复序列进行的研究 发现三种鱼的重复区位于1 a s l 和t m p 之间 重复单位相似 梅花鲈和暗斑梭鲈具有相同的重复单位 对河鲈1 4 个克隆菌株的分析 发现其重复单 位为1 0 b p 含有完整的回文结构5 t t g c a a 一3 和不完整的回文结构5 一a a g 呼 兀 3 在1 0 个菌株中为3 次重复 3 个为4 5 次重复 只有1 个菌株的重复次数小于三 对两个暗斑梭鲈个体的克隆 其克隆菌株重复次数分别为6 7 1 0 1 6 1 7 1 8 2 2 2 3 在河鲈中重复次数大多数小于5 其中主要为3 次 用重复序列对三个物种进行的 系统分化研究 发现与用整个线粒体序列的分析一致 从而认为重复序列可用于物种系 统进化的研究1 6 h o e l z e l 1 9 9 5 对食肉目动物的研究 发现其重复区位于r s 2 r s 3 存在长为2 1 0 b p 的重复单位 重复次数为1 4 1 0 3 不等1 6 j o s evl o p e z 1 9 9 6 对部分猫科动物 线粒体控制区的研究 发现猫科动物线粒体控制区具有较高的保守性 其r s 3 富含e a 序列 一般古有6 8 b p 的核心序列 r s 2 可能具有t a s 的功能 2 2 1 6 7 在绵羊线粒体d n a 控制区中 发现存在长为7 5 b p 的重复单位 其重复次数的差异 导致了m t d n a 长度变异 陈玉林 7 3 j 对8 个中国绵羊品种7 9 个无关个体d 1 0 0 p 区的 p c r 扩增 测序 发现因长度差异而存在1 2 种不同的分子类型 变异范围为5 2 b d 一 6 8 3 b d 在同一个体的不同克隆菌株中发现存在重复序列重复次数的异质性 7 4 b i o e m 1 9 9 8 和l i n 1 9 9 9 分别测定猪 鼬55 c r 0 向 线粒体d n a 的全序列长度 为1 6 6 7 9 b p 和1 6 6 1 3 b p 两者的长度差异是由于d 1 0 0 p 区中重复序列5 一 g 1 1 a c a c g t g c 3 串联次数不同而造成 l i n 的研究显示 重复序列串联次数在1 3 2 l 之间 起始位置为d 1 0 0 p 区的第7 1 1 8 4 0 n t 之间 而b j o e m 认为起始位点在5 3 4 n t 处 串联重复数为1 4 2 9 吲 线粒体控制区重复单位的长度在不同物种有很大差异 从几个碱基到几千个碱基不 等 大多数为几个碱基到几十个碱基之f 刨 对线粒体控制区重复序列长度异质性产生机 制提出了多种解释模型 分子问和分子内重组与突变 滑动错配 s 1 j p p e dm i s p a m n g 非正常延长 i l l e g i t i m a l ee l o g a t i o n 转座 t r a n s p o s i t i o n 在线粒体复制中 h 链复制 米端与d 1 0 0 p 链的相互竞争作用 造成链的涓 动 重复序列含有t a s 结构 导致复制 停止位点的不同 重复序列形成回文结构或特殊1 内空刚结 勾 导致新 i i 链滑动等假 3 但以上各种模型对线粒体d 刖曩重复序列异质性的解释郁集中 i 种擗的遗传变异或遗1 9 多样一降的评价等方而 而对于重复序列氏度异质性产生机制并未解释清楚 缺乏实验讲 l 绪论 据 7 8 1 4 同一个体内重复序列高度异质性的现象及存在的疑问 p e t e rs a v o l a i n e n 加0 0 列狗和狼的线粒体d 环区长为l o b p 重复序列研究中发现 存在很高的异质性 在同一个体中发现存在8 5 种不同的重复序列排列方式 进而估计 在1 4 只狗和5 只狼中存在3 8 4 种不同的重复序列排列方式 他们为了证实这种高异质 性是由突变产生的 进行了大量实验 首先 选取来自不同进化分枝的四个群体的1 4 只狗和5 只狼的不同个体的血 肌肉 肝脏 毛中提取的d n a 为模板进行实验 排除 因单一母系集团或某一组织的线粒体特异性 而导致d 环区重复序列的异质性 然后用 两对不同引物进行p c r 巢式扩增 排除因p c r 引物与模板链不匹配而产生的非特异性 扩增 导致假异质的可能 从同一个体采集多份血样 分别进行d n a 提取和p c r 扩 增 排除因实验中操作失误造成污染而产生的假异质性 又将d n a 模板稀释后 进行 p c r 扩增 排除了因模板原因而导致p c r 产物出现大量的异质性 再将p c r 产物进行 克隆 对克隆产物用4 变性聚丙烯酰胺检测 检测结果呈现单一峰 从而认为线粒体 d 环区重复序列高度异质性 不是因p c r 扩增过程中碱基错配产生的 经过对两组同 一家族的三代个体进行p c r 扩增和测序 比较母子两代之问和同代不同个体间线粒体 控制区重复序列的排列方式 认为线粒体d 环区的高度异质性是由于重复区突变产生 的 其突变率两代之间为2 0 而2 0 的突变率远远高于已知的d 环区的突变率 m t d n a 核苷酸韵替代率每代约为1 0 一 d 环碱基替代率是线粒体其他部分的2 8 5 倍 与线粒体的遗传特性不符 似乎线粒体d n a 复制中存在极低修复能力 致使我们 对p e t e rs a v o l a i n e n 2 0 0 0 关于狗和狼的线粒体d 环重复序列的异质性产生的原因产生 怀疑 8 3 另外 我们对蓝狐线粒体控制区全长进行p c r 扩增 克隆测序 发现线粒体d 环 区的重复序列长度存在高度的异质性 而其他位点具有较高的保守性 对蓝狐线粒体控 制区重复序列进一步的研究中 以p a g e 纯化的扩增产物或克隆菌株为模板 扩增产物 在8 p a g e 胶上都出现大量的梯状谱带 致使我们对这种线粒体异质性更加怀疑 为 了研究这种异质性产生的原因而进行了一系列的实验 1 5 本文研究的内容 目的 在对蓝狐线粒体d 环重复序列的研究中 发现同一个体存在重复次数的差异 查阅 国内外相关资料 发现在许多物种中 都存在线粒体d 环重复区序列长度的异质性 甚 至在同一个体内表现出很高的长度异质性 这种现象与现有的线粒体的遗传特性和线粒 体的复制修复理论相矛盾 研究者们剥这种高异质性产生的原因主要有两类观点 一类 观点认为 这种异质性是对线粒体基因多态性的反应 相关理论有基因问的4 j 等交换 重组 突变 基冈移步和体内复制的滑动 卜 类观 i 认为 是由于体外凼索引起的 由引物设计不当 p c r 反应条件欠佳 致使引物与模板产生 配而得到非特异扩增带 东 l e 林业人学硕l 学位论文 或是模板链形成特殊的空间结构 致使d n a 聚合酶滑动 形成假异质性 我们为了探讨线粒体d 环重复序列长度异质性产生的原因 是对线粒体基因多态性 的反应 还是由于体外因素造成的假异质性 本研究采用报道中常用的p c r 方法 研 究了蓝狐 爿z d p 蹦肠g o p 5 黑熊 k n 辟 c f o s 咖i 自e 把门甜s 棕熊 叻百 5 口 c 幻s 狗 h 括向优f 如r 括 狼 n 括m p h s 和虎 n n p r 口妇r 括 的相应区域 欲通过一系 列实验阐明线粒体d 环重复序列长度高度异质性产生的可能原因和机制 为线粒体d 环重复序列长度异质性的进一步研究提供借鉴作用 2 材料与方法 2 材料与方法 2 1 样品的采集 本实验使用蓝狐 爿f 叩蹦k 占d p h 5 狗 c n 括 向 7 1 盯曲 家猫 f e 胁c 础 东 北虎 尸口n e r 口嗽出口 i c 口 孟加拉虎 plf f p r 括 狼 c 锄括m p h s 黑熊 尼n n c f o s 加f 6 e m n s 棕熊 l h sn c 幻5 猞猁 己y 胱f y 煅 的肌肉 皮肤 心 脏 肝脏 脾脏 肾脏 肺脏 血液等样品 均出国家林业局野生动物检测中心提供 详细信息如表2 1 肌肉等组织样品在 2 0 冰冻保存 血纱为静脉血直接涂布于无菌纱 布上 阴凉处晾干后在 2 0 冰冻保存 静脉血用o 5 m me d l a 抗凝 4 暂时保存 送 到实验室提取总d n a 表2 1 实验样品基本信息 样品编号种类样品类型采集地 监狐 蓝狐 蓝狐 蓝狐 蓝狐 蓝狐 蓝狐 蓝狐 蓝狐 蓝狐 监狐 监狐 蓝狐 监狐 蓝狐 蓝狐 监狐 监狐 监狐 蓝狐 蓝孤 监狐 监狐 狗 黑熊 黑熊 黑熊 黑熊 黑熊 岜能 练熊 黑龙江茂兴湖 黑龙江茂兴湖 黑龙江茂兴湖 黑龙江红旗农场 黑龙江红旗农场 黑龙江红旗农场 黑龙江红旗农场 黑龙江红旗农场 黑龙江红旗农场 黑龙江红旗农场 黑龙江红旗农场 黑龙江红旗农场 黑龙江红旗农场 黑龙江红旗农场 黑龙江红旃农场 山东潍坊 山东潍坊 山东潍坊 山东潍坊 山东潍坊 黑龙江兰饵 黑龙江兰曲 黑龙江兰曲 黑龙江哈尔滨 检测中心 检测中一0 检测中心 检测中一l 检洲中心 检测r 心 愉测中心 肭肭肭伽肺肝脾肾肭桃帆肝脾肾肭肭肭肭肭肭m粼 肭肭肭帅蚋肭 艄 麟 m叭肌肼州叭m一 一一一一耋 硼蚴懈眦 眦吣州吣一硎 东北林业人学坝i 学位论文 2 2d n a 的提取与定量 采用酚 氯仿提取法提取样品的总d n a 具体操作如下 血纱提取总d n a 前的预处理 1 剪取血纱约1 c m 2 剪碎后置于1 5 m l 的e p p e n d o r f 管中 加入5 0 毗lt n e p h 8 0 震荡混匀 1 2 0 0 0 r p m 离心2 m i n 弃去血色上清 重复步骤2 数 次 直到血色变浅至无色 组织样品取约5 0 m g 剪碎后移入1 5 m l 的 e p p e n d o r f 管中 2 在e p p e n d o r f 管中加入4 5 叫t n e p h 8 0 4 5 脚1 0 s d s p h 8 0 1 毗1 1 m d t t 1 0 2 叽l2 0 m m l 的蛋白酶k 5 6 下保温过夜 3 向消化液中加入5 0 叽l 饱和酚 颠倒混合1 0 m i n 5 5 0 0 r p m 离心1 0 m i n 将上 层水相移至一新e p p e n d o r f 管中 弃去有机相 4 蘑复步骤2 一次 5 在e p p e n d o r f 管中加入等体积氯仿 5 0 0 肛1 缓慢颉倒混合1 0 m i n 离心 5 5 0 0 r p m1 0 m i n 将上层水秆i 移至一新e p p e n d o r f 管中 弃去有机相 6 重复步骤4 一次 7 1 灶取水相4 0 毗l 置于新的e p p n d o r f 舒巾 8 加入1 o m l 的冷无水乙醇 缓慢颠倒混匀 可见n 色絮 陕沉淀 若未见沉 1 0 e 一 丝墼皇壅兰 淀 可于一7 0 条件下放置1 2 小时 9 1 3 0 0 0 r p m 离心1 5 m i n 弃一b 青 加入7 0 乙醇漂洗后1 3 0 0 0 r p m 离心1 5 m i n 弃液体 将e p p e n d o r f 管盖打丌 令沉淀自然干燥 1 0 视沉淀量的多少酌情加入3 0 5 呼 lt e 溶解 4 保存备用或于 2 0 储存 提取后的d n a 用1 的琼脂糖凝胶电泳检测 根据d n a 样品与跏ld l 2 0 0 0m a r k e r 电泳图谱亮度比较 估算d n a 浓度 然后将所有样品稀释到大致相同的浓度 4 保 存备用或于 2 0 氏期保存 2 3 实验流程与步骤 2 3 1p c r 引物 扩增片段及条件 本论文实验涉及的各物种m i d n a d 环区全长或重复区的p c r 引物及序列见表2 2 表2 2 各个物种m t d n a 重复区或全民的p c r 引物及序列 丐两孺r 可丽两广 b fl o w 5 g t g c g a c t c 御r c t l g g c a l t 兀1 c 3 2 b fu pr 5 g g t g c m 钮t r c a g t c a a t g g t n c a g 一3 1 b fl o wr 5 g g l i t g 丑 t g a g c i a g t t c a a l 钢 t c g 3 2 b f 1 5 一c a a g g t g c r 兀 a g t c a 加b g 3 1 b f o 2 5 t 加r a g c g a g t a g c a t g a g 兀t g t g 3 2 b f i 1 5 一g c t m c a g t c a 椰g t i t a g 3 b f i 2 5 一g g t 几1 g 曰u g a g c l a g l t i aa n r c 3 2 l i g e r2 p5 一a a i r c c 丑蛆t g t t c c a c a g 3 订 1 1 9 e r2 i o w5 1 t i b g t r a a g c r a a l 飞叮兀1 a c 3 2 j g e r f5 棚c c i a 1 t g r i c a c a g g a c 3 1 r i g e r r s 3 r5 一a a t c a 64 a g t n l g c a r g t g 3 2 b k b e a rf 5 c t a 耵c a g t c a a t g g 几1 a c a g g 3 1 b k b e a rr 5 一g g t 兀1 g 1 几脯a g c i a a g r r a 戌i a i 3 2 b n b e a rf 5 a g l a c l r r a a a c g c c a c t a a a l 3 b n b e a rr 5 g c l 从g 1 1 a a l 肖r c i a a a a a c g l 0 3 2 王 o gw 65 搬1 1 a a t a g 蛆1 g a c c a 丫r g a g t 兀 a c g 一3 d o gw 5 5 1 t i a g g a c a 彤 a g r 几叮a g g g 3 d o gw 4 5 一g g t i t g g l 钔1 a a g t i a a c r r a p b t c 3 r s 捌 5 a g 订1 g c 丑蛔 r c a g t c a a t g g t c a c 一3 j 塑曼生 三t 二 基 堡垒鱼 王曼鱼 里垒垒鱼垦坠鱼 王 卫蔓1 1 代表上游引物 2 代表r 游引物 p c r 引物扩增片段 大小及来源 反应的退火温度见表2 3 引物由上海生物工程技 术服务有限公司合成 用无菌去离子水稀释成2 啡 m 2 0 保存 表2 3p c r 引物扩增片段 扩增长度及米源 反应的退火温度 引物名称扩增片段及大小退火温度 引物米源 b f u d b f l o w b f u p r b f l o wr b f o 1 b f o 2 b f l 1 b f i 2 t i g e r2u p t i g e r 2 1 0 w t i g c s 3 f t i g e rr s 3 r b k b e a r f b k b e a rr b n b e a f f b n b e a rr d o g w 3 d o g w 6 d o g w 4 蓝狐d 环全k 约1 3 0 0 b 口 监狐d 环全k 约1 3 0 0 b d 蓝孤d 环重复区 约3 0 0 b d 监狐d 环重复区 约3 0 0 b d 蓝狐d 环重复区 约3 0 0 b d 监狐d 环重复区 约3 0 0 b d 蓝狐d 环重复区 约3 0 0 b p 监狐d 环重复区 约3 0 0 b d 虎d 环重复区 约4 0 0 b 口 虎d 环重复区 约4 0 0 b p 猞猁d 环重复区 约4 0 0 b p 猞猁d 环重复区 约4 0 0 b p 黑熊d 环重复区 约4 0 0 b p 黑熊d 环重复区 约4 0 0 b 口 棕熊d 环重复区 约4 0 0 b p 棕熊d 环重复区 约4 0 0 b p 狼d 环重复区 约4 0 0 b p 狼d 环重复区 约4 0 0 b p 狗d 环重复区 约3 6 0 b p 6 9 a y 7 2 9 8 8 0 6 8 a y 7 2 9 8 8 0 8 6 8 蓝狐d 环全序列6 6 8 监狐d 环全序列6 6 8 s a v o l a i n e n 2 0 0 0 引物w d 3 6 8 篮狐d 环全序列 6 8 蓝狐d 环全序列 6 8 监狐d 环全序列6 5 5 a f 0 5 3 0 5 5 4 5 5 a f 0 5 3 0 5 5 8 5 5 尉mj a e h e u p 2 0 0 1 引物r s 3 f 5 5 i i mj a e h e u p 2 0 0 1 引物r s 3 r 5 9 n 0 0 0 3 4 2 6 a 5 9 n 0 0 0 3 4 2 6 a 5 9 n 伽0 3 4 2 7 8 5 9 n c 0 0 3 4 2 7 8 5 5 a y 7 2 9 8 8 0 a 5 5 s a v o l a i n e n f 2 0 0 0 碍1 物w d 6 5 5 s a v o l a i l l e n 2 0 0 0 引物w d 4 并参考 a y 7 2 9 8 8 0 设计 d o gw 5 狗d 环重复区 约3 6 0 b p 5 5 s a v o l a i n e 2 0 0 0 引物w d 5 r s 3 f 家猫d 环重复区 约4 0 0 b p 5 7 国家林业局野生动植物检测中心提供 墨 窒笪里堑重星匡 丝 塑业 兰 鬯塞整些墅生塾堕塑坌型主 坠堡垡 a 根据n c b l 相关序列自行设计 b 蓝狐d 环全序列本实验测序获得 未公布 未标注的序列均来自n c b i 数据库 h t c p n c b i n l m j h g o v 2 3 2 蓝狐线粒体d 环区全序列的扩增与产物克隆 2 3 2 1p c r 扩增 用引物b f u d b f