大鼠弥漫性脑损伤后早期c-fos基因表达的法医学研究

大鼠弥漫性脑损伤后早期 c-fos 基因表达的法医学研究 大鼠弥漫性脑损伤后早期 c-fos 基因表达的法医学研究 【摘 要】 目的 观察大鼠弥漫性脑损伤后 c f0s 基因表达的规律。方法采用 marmarou 的弥漫性脑损伤模型，分别于伤后 15 min， 30min，lh， 3h， 6h， 12h， 24h 取脑组织，运用免疫组化 sabc 法观察 c fos基因的表达。结果 打击后 15 min 时，即可观察到 c fos 基因的表达， 1 h 后表达明显增加， 3 h 达到高峰，随着损伤时间的延长，阳性反应细胞逐渐减少， 24 h 可见少量表达。表达呈 弥漫性，以皮层、脑干最为明显，不同部位的变化趋势一致。对照组未见阳性反应细胞 结论 c fos 基因的表达规律可用于弥漫性脑损伤的早期鉴定及损伤经过时间的推断【关键词】弥漫性脑损伤； c fos 基因；免疫组织化学；嗜银染色；损伤经过时间【中图分类号】 r36【文献标识码】 a【文章编号】 1007 9297(2005)01 0042 03study on the expression of c-fos gene in the early stage of difuse brain injury in rats and its forensic implication chen ren hui，l1 yo ong ， cheng li bao department offorensic pathology，wannan medical college， u 241001【 abstract】 0bjective to investigate the expression of c fos gene in diffuse brain injury(dbi) methods based onmarmarou s model of dbi and took the samples at 15min， 30min， lh， 3h， 6h， 12h， 24h after brain injury the expression of c f0sgene was observed by immunohistochemical sabc results rhe expression of c-fos gene could be detected at 15min afterinjury， increased at lh and peaked at 3h positive cells decreased with the prolongation of injury time little expression wasf0und at 24h ihe expression of c fos gene was f0und in wide range but significant in cortex and brain stem ihe chan gingtendency of diferent areas was same rhe control group showed negative staining conclusion rhe c-fos gene can diagn oseand date early dbi【 key words】 difuse brain injury； c fos gene；immunohistochemistry； silver staining； injury time 脑损伤是法医学鉴定中最常见的损伤，弥漫性脑损伤 (diffuse brain injury dbi)作为闭合性脑损伤的一种，多见于交通事故。 c fos基因属 于即刻早基因家族 (immediate early gene， iegs)，在正常情况下参与神经细胞的生长、发育、分化、记忆和信息传递过程，生理情况下不易被检测到。当神经组织受到病理性刺激如脑缺血、外伤等作用后， c fos 基因快速表达， 02 因此被称为快速反应原癌基因。c fos 基因表达是神经组织受伤害的早期指标。目前有关 dbi 后c fos 基因表达的文献很少，作者拟采用 marmarou 的弥漫性脑损伤模型 31 初步探讨大鼠 dbi 后 c fos 基因表达的规律。材料与方法一、试验动物健康雄性 sd 大鼠 48 只 f 南京青龙 山实验动物中心提供 )，体重 300 320 g，随机分成 dbi 15min、 30min， 1 h， 3 h， 6h，12h， 24h 组及及对照组，共 8 组。每组 6 只大鼠二、模型制作采用marmarou 脑损伤模型，用 1戊巴比妥 钠腹腔注射 (30 mg kg)，麻醉成功后，大鼠头部做中线切口，暴露颅骨将直径 10 mm、厚 3 mm 的打击垫片用高分子聚脂固定于颅顶的冠状缝与人字缝之间的中央部然后将大鼠俯卧固定已知厚度及弹性系数的海绵床上，待动物开始苏醒、有肢体活动时，移至一有机塑料管下端垫片正对管中央。 450g 铁棒从 2m 高度自管内自由坠落至打击垫片上立即移开海绵床以免二次损伤。三、组织处理及切片在设定的时间内处死动物：将动物过量麻醉后，断头取脑打开颅骨后迅速用 4多聚甲醛液预固定：【作者简介】陈仁辉 (1979 一 )，男，安徽宁国人，硕士，主要从事闭合性颅脑损伤的研究。联系方式：+86 1 3855347401： e mail： wnmccrhhotmail corn 法律与医学杂志 2005 年第 12 卷 (第 1 期 )取 大鼠全脑于 4多聚甲醛液后固定 12h沿大脑正中裂矢状切开大脑、小脑、脑干，于正中切面左有外侧 3 mm 处切取左有大脑皮质、 脑以及脑干组织各 l 块，分别做常规石蜡包埋，切片厚 5 m。分别作 he 染色、嗜银染色及 c fos 免疫组织化学染色四、试剂及方法 rabbit anti c fos： dab 显色试剂盒及 sabc 试剂盒 (武汉博士德公司 )，按说明书进行操作。 f】 pbs取代一抗、二抗作阴性对照，以细胞核 fi{；现黄色产物为阳性结果。硝酸银、氯化金、硫代硫酸钠、饱和氨水，按 glees marslands染色法进行五、图像分析及统计学处理高倍视野 fx400)下分别对大脑皮质、丘脑以及脑干随机选取 5 个视野依次 计数每个视野内阳性细胞数，以其平均值作为该切片层面的阳性细胞数，以同一动物 6 个切片层面的平均阳性细胞数作为该动物的阳性细胞数 各组动物再分别计算其组内阳性细胞数。实验数据采用 spss 10 0 统计软件进行方差分析、检验。结 果一、大体及镜下观察实验组可见蛛网膜下腔出血，脑表面基本正常，无大面积挫伤或局灶性挫裂伤灶。少数动物可见脑干有灶性出血、侧脑室出血。未见脑组织局灶性病灶。镜下可见神经元胞体明显肿胀，结构不清核固缩，胞浆红染加深神经元损害主要分布于两侧大脑皮质。胶质细胞肿胀明显。细胞周围间质水肿。嗜银 染色示轴索变粗、肿胀，呈串珠状、波浪状或螺旋状改变 (图1)可见轴索断端膨大呈球形改变。二、免疫组织化学染色 dbi 后15min即可观察到阳性反应细胞呈散存少量分布 f 图 2)。阳性产物呈棕黄色，主要位于胞核内，胞浆内以及大的突起根部也有表达。1 h 后表达明显增加 (图 3)，并于 3 h 达到高峰 (图 4)。随着损伤时间延长，阳性反应细胞逐渐减少 24h 后可见少量表达。表达呈弥漫性以皮层、脑干最为明显，不同部位的变化趋势一致 阳性反应细胞包括神经元及各类胶质细胞 c los 基因表达的阳性细胞数，见表l 正常对照组大脑皮质、丘脑以及脑干未见阳性反应细胞。讨论弥漫性脑损伤 (diffuse brain injury dbi)是一类常见的、后果严重的原发性脑损伤，具有较高的致残率 43 和病死率，在法医学中较常见。一般认为 dbi 主要包括弥漫性轴索损伤、弥漫性脑肿胀、缺氧性脑损害、弥漫性血管损伤等 4 种基本类型。 51 4 种病理变化常可同时存在。本实验采用 marmarou 的模型制作方法在镜下可以观察到神经元肿胀，结构不清，核固缩改变。细胞间质水肿明显。轴索增粗、肿胀，断端可见轴索球形成等。符合 dbi 的病理学改变 ，并且随着损伤时间的延长，上述病理学改变逐渐加重原癌基因 c los 是 fbj 和fbr 小鼠特发性骨肉瘤 (msv)中病毒癌基因 v los 的细胞同源物。c los 原癌基 大 j 高度保守，小鼠、大鼠与人的 los 同源性分别为97和 94。人类的 c los 基因定位于第 14 号染色体 (14q) 61由 3 5kb 的 dna 片段组成，当 c los 基因被激活后迅速转录 mrna，然后进入胞质在胞质中合成 c fos 蛋白之后较快地进入胞核，称为核磷酸蛋白，它由 380 个氨基酸组成其分子量为 55kb，是 dna结合蛋白 c fos 基因为神 经系统最常见的即刻早基因在外界刺激下数十分钟内 c fos 基因即开始表达，其表达产物 c fos 蛋白与c iun 基因的表达产物 c iun 蛋白通过 “ 亮氨酸拉链 ” 形成f0s-jun 异源二聚体构成 ap 一 1 转录因子，进一步激活目的基因的表达。 7】 c fos 基因的表达在创伤的初始应答与继发性病理生理改变之间可能成为重要的中介 f8 如参与了细胞内外信号传导、细胞凋亡及继发性颅脑损伤等。本文应用 marmarou 的弥漫性脑损伤模型研究了 c los 基因的表达情况。实验显示，打击后 15 min，脑皮层、脑干等部位中即出现 c los 基因的表达， 1 h 后表达明显增加， 3 h 达到高峰，整个鼠脑组织中，包括脑皮层、皮层下、丘脑、脑干等区域均呈弥漫性表达，不同部位的变化趋势一致，而后逐渐下降， 24h 后仍可见少量表达。关于脑创伤后 c los 基因的表达机制据认为是通过谷氨酸 n 一甲基一 d 一天门冬氨酸受体 (nmdar)介导的并随着谷氨酸释放增多而上升。 i 9i 谷氨酸的释放激活神经细胞膜nmda 受体，使受体活化而介导 c los 基因的表达 另一种观点认为神经元中 c los 基因的表达是由 leao 播散性抑制 (spreading depressionsd)所致。机械性损伤可以诱发 sd， sd可将细胞外 ca 转移至细胞内，造成细胞外 caz 浓度下降，引起皮层神经元去极化。ca 内流及神经元去极化均可引起 c los 基因的表达。本实验通过成功复制 dbi 动物模型运用 he、神经纤维特殊染色以及免疫组化技术，不仅说明 dbi 存在复杂的病理学改变同时 c los 固表选的即时性 1 技 f j 问上的相对规律性也为我们早期鉴定 dbi 手 u 推断其掘协彝过时间提供了参考，、 }；女 i1】 morgan s gr 目 #mg the regulation i ful： li-in ui d thor【 e(： s in i ⋯； ⋯； vmmui neon 1990 4( ， 7 s7l l lj i l p1 m ， ilox,cla da el g pmb r 1iiilly ind eedby dedolerkzati0n ⋯； ⋯； ⋯； lw j⋯； c b jj 皿 1 ⋯；⋯； f j 2002 11k287 395 n_b m m⋯； a 肚 w model ii dilttt brain1 ⋯； lp 蛆 morl,oloweal ch⋯； ⋯； n【 j n ，l994 f,： b： 80(21： 30i 一 313i4】 “ 译 + imj ： mi 2 4}；j1 衄 di m l tk ⋯； jl1i f{；⋯； ji il in rp 法律 医学杂 2005年第 l2卷 f第 1期 )aum4jl j n⋯； ld exp neuml 2 mj 641 651 嘲 ba rke r pe rohi m w n m， t h umpld ⋯；h j1 r⋯； 1|l1 【 ⋯； 14q2l 一 i j】pr nad us4i98,t 81 ： 5826-58307 k mu 璐 x⋯； jj m incmcd ⋯；of brn 凸】 1d ap l ⋯； c pllnn l0r after caiealimi,tinjury mm }；brun r i994 664fi 一 21 14l一 147kaminska b l k lru1)ui i zlductlotof ap 一 1⋯； npn0nkiu|dna hlnding aliil⋯；f n h pp j 雌 rsu ⋯；neuro i