凝胶电泳注意事项.doc

凝胶电泳的注意事项影响电泳分离的主要因素：1. 待分离生物大分子的性质：待分离生物大分子所带的电荷、分子大小和性质都会对电泳有明显影响。一般来说，子带的电荷量越大、直径越小、形状越接近球形，则其电泳迁移速度越快。2. 缓冲液的性质：缓冲液的pH值会影响待分离生物大分子的解离程度，从而对其带电性质产生影响，溶液pH值距离其等电点愈远，其所带净电荷量就越大，电泳的速度也就越大，尤其对于蛋白质等两性分子，缓冲液pH还会影响到其电泳方向，当缓冲液pH大于蛋白质分子的等电点，蛋白质分子带负电荷，其电泳的方向是指向正极。为了保持电泳过程中待分离生物大分子的电荷以及缓冲液pH值的稳定性，缓冲液通常要保持一定的离子强度，一般在0.020.2，离子强度过低，则缓冲能力差，但如果离子强度过高，会在待分离分子周围形成较强的带相反电荷的离子扩散层（即离子氛），由于离子氛与待分离分子的移动方向相反，它们之间产生了静电引力，因而引起电泳速度降低。另外缓冲液的粘度也会对电泳速度产生影响。3. 电场强度：电场强度（V/cm）是每厘米的电位降，也称电位梯度。电场强度越大，电泳速度越快。但增大电场强度会引起通过介质的电流强度增大，而造成电泳过程产生的热量增大。电流在介质中所做的功（W）为：W=I2.R.t式中：I为电流强度，R为电阻，t为电泳时间。电流所作的功绝大部分都转换为热，因而引起介质温度升高，这会造成很多影响：1、 样品和缓冲离子扩散速度增加，引起样品分离带的加宽；2、 产生对流，引起待分离物的混合；3、 如果样品对热敏感，会引起蛋白变性；4、 引起介质粘度降低、电阻下降等等。电泳中产生的热通常是由中心向外周散发的，所以介质中心温度一般要高于外周，尤其是管状电泳，由此引起中央部分介质相对于外周部分粘度下降，摩擦系数减小，电泳迁移速度增大，由于中央部分的电泳速度比边缘快，所以电泳分离带通常呈弓型。降低电流强度，可以减小生热，但会延长电泳时间，引起待分离生物大分子扩散的增加而影响分离效果。所以电泳实验中要选择适当的电场强度，同时可以适当冷却降低温度以获得较好的分离效果。4. 电渗：液体在电场中，对于固体支持介质的相对移动，称为电渗现象。由于支持介质表面可能会存在一些带电基团，如滤纸表面通常有一些羧基，琼脂可能会含有一些硫酸基，而玻璃表面通常有Si-OH基团等等。这些基团电离后会使支持介质表面带电，吸附一些带相反电荷的离子，在电场的作用下向电极方向移动，形成介质表面溶液的流动，这种现象就是电渗。在pH值高于3时，玻璃表面带负电，吸附溶液中的正电离子，引起玻璃表面附近溶液层带正电，在电场的作用下，向负极迁移，带动电极液产生向负极的电渗流。如果电渗方向与待分离分子电泳方向相同，则加快电泳速度；如果相反，则降低电泳速度。5. 支持介质的筛孔：支持介质的筛孔大小对待分离生物大分子的电泳迁移速度有明显的影响。在筛孔大的介质中泳动速度快，反之，则泳动速度慢。关于胶回收切胶的一点注意事项：1. 电泳的buffer和gel都是新制的，切胶的台子清理干净，刀片最好洗净灭菌，总之一句话就是保证切下的带没有外源dna污染。2. 切胶是要把整个目的片断所在位置的胶全部回收。为了减少胶的体积，可以用相对比较薄的胶来做，只要够点样即可，也可采用薄而宽的梳子来跑胶。3. 关于防护，在一般有机玻璃后就足够了，戴上防护面具以保护眼睛，如果戴树脂眼镜就可以了。要是非常害怕紫外照射，或者对于胶有特殊要求，例如要求不含EB，可以采用点marker和带刻度的尺子一起照相的方法来确定目的条带在胶上的位置进行切胶。4. 按照正常程序点marker跑胶，然后切下有marker的胶，EB染色，紫外灯下与带刻度的尺子一起照相。由于要回收的带与marker间的相对位置已知，根据尺子来衡量未染色胶上目的带的位置即可。如果觉得很难判断，可以直接在marker边点少量的样，这样位置就容易确定了凝胶电泳常见问题分析要跑琼脂糖凝胶电泳， 5ng 就能很清楚的跑出来是这样吗？能够照相的清楚的条带，至少需要多少量呢？参考见解：5ng 已经可以了，但是或许20ng50ng-200ng效果好，在此范围内呈线性。把210bp的pcr产物进行酶切,得到190+20bp的两个片段,请问能用琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果吗?用多大浓度的胶和多大的电压呢?参考见解：可以用琼脂糖凝胶电泳分开,电压不变,可用1.5%到2%的胶,20bp得片断不一定能看得到,所以应用未酶切的PCR片断作对照.琼脂糖浓度（W/V）大小范围（bp）0.6%1000-230000.8%800-100001.0%400-80001.2%300-70001.5%200-40002%100-3000 丙烯酰胺凝胶电泳更适合于分离纯化小分子量核酸（5-500bp）并且分辨率高，可以达到1个bp。所以建议进行丙烯酰胺凝胶电泳试试。Marker做琼脂糖凝胶电泳，发现Marker在加样孔有一个明显的亮带，什么原因？参考见解：marker有时会出现这样的问题,应该是时间久了。新买时跑胶在点样孔没有,过一段时间就会在点样孔出现亮点。也可能是蛋白，有时DNA提的不纯含有蛋白时就会出现上样孔有条带的现象。琼脂糖凝胶电泳检测DNA时,跑出的带后面出现拖尾现象,什么原因造成的?参考见解： DNA带模糊?：1、 DNA降解?避免核酸酶污染。2、 DNA上样量过多?减少凝胶中DNA上样量。3、 所用电泳条件不合适?电泳时电压不应超过20V/cm，温度30,巨大DNA链，温度应15，核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力。4、 DNA样含盐过高?电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐。5、 有蛋白污染?电泳前酚抽提去除蛋白。6、 DNA变性，?电泳前勿加热，用20mM NaCl缓冲液稀释DNA。将从组织提取的DNA进琼行脂糖凝胶电泳，用的1.5%的胶加了EB，80V跑1小时，溴酚蓝已经跑到头了，在紫外灯观察什么带也没有，只见孔里面有橘红色的亮光。好象没跑出来，是怎么回事？参考见解：1、 根据目的条带长度来调整凝胶浓度，一般1.5左右，也不一定。2、 紫外灯下没见带，不一定没有出孔，而是量少看不到，可以测一下浓度看一下，或直接试跑一下PCR。3、 最好加一个marker孔，尤其你第一次跑胶时。4、 电泳时间可能过长，一般75v30min左右，但是具体看溴酚蓝的离孔距离和目的条带离孔距离。影晌电泳分离的主要因素由电泳迁移率的公式可以看出，影响电泳分离的因素很多，下面简单讨论一些主要的影响因素：1. 待分离生物大分子的性质待分离生物大分子所带的电荷、分子大小和性质都会对电泳有明显影响。一般来说，分子带的电荷量越大、直径越小、形状越接近球形，则其电泳迁移速度越快。2. 缓冲液的性质缓冲液的pH值会影响待分离生物大分子的解离程度，从而对其带电性质产生影响，溶液pH值距离其等电点愈远，其所带净电荷量就越大，电泳的速度也就越大，尤其对于蛋白质等两性分子，缓冲液pH还会影响到其电泳方向，当缓冲液pH大于蛋白质分子的等电点，蛋白质分子带负电荷，其电泳的方向是指向正极。为了保持电泳过程中待分离生物大分子的电荷以及缓冲液pH值的稳定性，缓冲液通常要保持一定的离子强度，一般在0.020.2，离子强度过低，则缓冲能力差，但如果离子强度过高，会在待分离分子周围形成较强的带相反电荷的离子扩散层（即离子氛），由于离子氛与待分离分子的移动方向相反，它们之间产生了静电引力，因而引起电泳速度降低。另外缓冲液的粘度也会对电泳速度产生影响。3. 电场强度电场强度（V/cm）是每厘米的电位降，也称电位梯度。电场强度越大，电泳速度越快。但增大电场强度会引起通过介质的电流强度增大，而造成电泳过程产生的热量增大。电流在介质中所做的功（W）为： W=I2.R.t上式中：I为电流强度，R为电阻，t为电泳时间。电流所作的功绝大部分都转换为热，因而引起介质温度升高，这会造成很多影响：样品和缓冲离子扩散速度增加，引起样品分离带的加宽；产生对流，引起待分离物的混合；如果样品对热敏感，会引起蛋白变性；引起介质粘度降低、电阻下降等等。电泳中产生的热通常是由中心向外周散发的，所以介质中心温度一般要高于外周，尤其是管状电泳，由此引起中央部分介质相对于外周部分粘度下降，摩擦系数减小，电泳迁移速度增大，由于中央部分的电泳速度比边缘快，所以电泳分离带通常呈弓型。降低电流强度，可以减小生热，但会延长电泳时间，引起待分离生物大分子扩散的增加而影响分离效果。所以电泳实验中要选择适当的电场强度，同时可以适当冷却降低温度以获得较好的分离效果。4. 电渗液体在电场中，对于固体支持介质的相对移动，称为电渗现象。由于支持介质表面可能会存在一些带电基团，如滤纸表面通常有一些羧基，琼脂可能会含有一些硫酸基，而玻璃表面通常有Si-OH基团等等。这些基团电离后会使支持介质表面带电，吸附一些带相反电荷的离子，在电场的作用下向电极方向移动，形成介质表面溶液的流动，这种现象就是电渗。在pH值高于3时，玻璃表面带负电，吸附溶液中的正电离子，引起玻璃表面附近溶液层带正电，在电场的作用下，向负极迁移，带动电极液产生向负极的电渗流。如果电渗方向与待分离分子电泳方向相同，则加快电泳速度；如果相反，则降低电泳速度。5. 支持介质的筛孔支持介质的筛孔大小对待分离生物大分子的电泳迁移速度有明显的影响。在筛孔大的介质中泳动速度快，反之，则泳动速度慢。准备干净的配胶板和电泳槽 注意 DNA 酶污染的仪器可能会降解 DNA ，造成条带信号弱、模糊甚至缺失的现象 选择电泳方法 一般的核酸检测只需要琼脂糖凝胶电泳就可以；如果需要分辨率高的电泳，特别是只有几个 bp 的差别应该选择聚丙烯酰胺凝胶电泳；用普通电泳不合适的巨大 DNA 链应该使用脉冲凝胶电泳。注意巨大的 DNA 链用普通电泳可能跑不出胶孔导致缺带。 正确选择凝胶浓度 对于琼脂糖凝胶电泳，浓度通常在 0.5 2 之间，低浓度的用来进行大片段核酸的电泳，高浓度的用来进行小片段分析。低浓度胶易碎，小心操作和使用质量好的琼脂糖是解决办法。注意高浓度的胶可能使分子大小相近的 DNA 带不易分辨，造成条带缺失现象。 适合的电泳缓冲液 常用的缓冲液有 TAE 和 TBE ，而 TBE 比 TAE 有着更好的缓冲能力。电泳时使用新制的缓冲液可以明显提高电泳效果。注意电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低， PH 值上升，缓冲性能下降，可能使 DNA 电泳产生条带模糊和不规则的 DNA 带迁移的现象。 电泳的合适电压和温度 电泳时电压不应该超过 20V/cm ，电泳温度应该低于 30 ，对于巨大的 DNA 电泳，温度应该低于 15 。注意如果电泳时电压和温度过高，可能导致出现条带模糊和不规则的 DNA 带迁移的现象。特别是电压太大可能导致小片段跑出胶而出现缺带现象 DNA 样品的纯度和状态 注意样品中含盐量太高和含杂质蛋白均可以产生条带模糊和条带缺失的现象。乙醇沉淀可以去除多余的盐，用酚可以去除蛋白。注意变性的 DNA 样品可能导致条带模糊和缺失，也可能出现不规则的 DNA 条带迁移。在上样前不要对 DNA 样品加热，用 20mM NaCl 缓冲液稀释可以防止 DNA 变性。 DNA 的上样 正确的 DNA 上样量是条带清晰的保证。注意太多的 DNA 上样量可能导致 DNA 带型模糊，而太小的 DNA 上样量则导致带信号弱甚至缺失。 TIANGEN 公司 DNA 分子量标准每次上样 6ul 即可得到清晰均匀的条带。 Marker 的选择 DNA 电泳一定要使用 DNA Marker 或已知大小的正对照 DNA 来估计 DNA 片段大小。 Marker 应该选择在目标片段大小附近 ladder 较密的，这样对目标片段大小的估计才比较准确。 TIANGEN 公司的 DNA Marker 条带清晰，亮度均匀，质量稳定，是您实验的首选。需要注意的是 Marker 的电泳同样也要符合 DNA 电泳的操作标准。如果选择 DNA/HindIII 或者 DNA/EcoRI 的酶切 Marker ，需要预先 65 加热 5min ，冰上冷却后使用。从而避免 HindIII 或 EcoRI 酶切造成的粘性接头导致的片段连接不规则或条带信号弱等现象。 凝胶的染色和观察 实验室常用的核酸染色剂是溴化乙啶（ EB ），染色效果好，操作方便，但是稳定性差，具有毒性。而其他系列例如 SYBR Green ， GelRed ，虽然毒性小，但价格昂贵。 TIANGEN 公司的 GeneGreen 相比则是性价比高的低毒替代染料，其灵敏度比传统 EB 染料高 10 倍以上。注意观察凝胶时应根据染料不同使用合适的光源和激发波长，如果激发波长不对，条带则不易观察，出现条带模糊的现象。关于琼脂糖凝胶电泳中问题的分析讨论 在分子生物学的实验中琼脂糖凝胶电泳是一经常的实验操作，因此关于琼脂糖凝胶电泳的实验技巧和方法也是不胜其多。在这里将着重就琼脂糖凝胶电泳的加样的几点注意事项加以说明：1.）加样时枪头不要碰坏凝胶壁，否则DNA的带型将不会整齐，加样前要用枪头吸打凝胶孔中的溶液，以赶走样品空中的气泡。2.）每孔最大DNA上样量决定于DNA样品片段的大小、数目及样品孔形状与容量。3.）应注意每孔最大上样容量及样品孔体积，以免加样时样品流入附近样品孔造成交叉污染，影响结果分析。4.）在实验加样中不一定每一个样品都换一个枪头，可在阳极槽中反复吸打电泳缓冲液以清洗。（对于Southern印迹转移和需要回收DNA片段的电泳，则应该每一个样品用一个枪头加样，避免样品交叉污染。） 此外在琼脂糖凝胶电泳中其它的几点注意事项还有：1.）凝胶中加入EB进行电泳，便于紫外线下观察电泳状态，但EB会导致线形DNA迁移率下降，这在酶切质粒与空白对照质粒一起电泳时应值得注意。.）电泳过程中，溴化乙锭向负极移动，与DNA泳动的方向相反，较长时间的电泳会造成靠正极方向的凝胶中溴化乙锭含量低，会对含量较少的小分子DNA片段检测困难。处理方法是：将凝胶在0.5ug/ml的EB溶液中染色3045分钟。.）判断正负极的另一方法是负极气泡（H2）比正极气泡（O2）多一倍1、要跑琼脂糖凝胶电泳，5ng就能很清楚的跑出来，是这样吗？能够照相的清楚的条带，至少需要多少量呢？参考见解：5ng已经可以了，但是或许20ng200ng效果好，在此范围内呈线性。2、把210bp的PCR产物进行酶切，得到190+20bp的两个片段，请问能用琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果吗？用多大浓度的胶和多大的电压呢？参考见解：可以用琼脂糖凝胶电泳分开，电压不变，可用1.5%到2%的胶，20bp得片断不一定能看得到，所以应用未酶切的PCR片断作对照。丙烯