树突细胞对免疫活性细胞抑癌效应的非限制性增强作用.doc

树突细胞对免疫活性细胞抑癌效应的非限制性增强作用 刘宝瑞 钱晓萍 邹征云 王立峰 葛少华南京大学医学院附属鼓楼医院肿瘤科，江苏 南京 210008摘要 目的 研究抗原负载的树突细胞对免疫活性细胞抑癌的增强作用。方法 在建立树突细胞体外扩增的基础上，将抗原负载的树突细胞作用于单个核细胞及高聚金葡素活化的单个核细胞，观察其对人肺癌GLC-82和A549细胞的体外和裸鼠体内抑癌效果。结果 抗原负载的树突细胞能显著增强单个核细胞及高聚金葡素活化的单个核细胞对GLC-82和A549细胞的抑制作用，该作用不受主要组织相容性复合物基因（major histocompatibility complex, MHC）限制。结论 抗原负载的树突细胞对免疫活性细胞的抑癌作用有MHC非限制性增强效果。关键词 树突细胞/免疫学； 肿瘤； 免疫细胞；免疫活性中图分类号 Enhancement of non-MHC restricted anti-tumor effect of immunocytes by dendritic cells LIU Bao-rui, QIAN Xiao-ping, ZHOU Zeng-yun, et al. Department of Oncology ,Drum Tower Hospital, Faculty of medicine, Nanjing University, Nanjing 210008,ChinaAbstract: Objective To study the effect of antigen-pulsed dendritic cells on tumor inhibition induced by immunocytes. Method On the bases of in vitro expansion and identification of dendritic cells, the antigen-imposed dendritic cells were mixed with either mononuclear cells or highly agglutinative staphylococcin activated mononuclear cells, and their anti-tumor effects were studied in vitro and in vivo respectively on the inhibition of human lung cancer cell lines GLC-82 and A549. Result Antigen-pulsed dendritic cells significantly enhanced the inhibition of human lung cancer cell lines GLC-82 and A549 induced by mononuclear cells without MHC restriction. Conclusion Antigen-pulsed dendritic cells play a role in enhance of anti-tumor effect of immunocytes in non-MHC restricted way.Key words: dendritic cells/immunology; neoplasms; immunity,cellular; immunocompetence树突细胞对免疫活性细胞抑癌效应的非限制性增强作用 树突细胞（dendritic cell, DC）是已知最强的专职抗原提呈细胞，在抗原摄取、加工、提呈以及诱导特异性免疫应答方面发挥着关键性作用。本文作者在成功地建立树突细胞体外扩增技术并用于肿瘤特异性免疫治疗的同时，意外地发现树突细胞对免疫活性细胞的抗肿瘤效应还具有MHC非限制性增强作用。1材料与方法1.1 主要试剂白细胞介素-4（IL-4）、肿瘤坏死因子（TNF-）和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CGF）购自Promega公司，高聚金葡素（HAS）为沈阳协和集团产品，前列腺环素（PGI2）购自Sigma公司。CD1a-FITC、CD83-FITC为Ancell公司产品，HLA-I、II及羊抗鼠-FITC购自北京帮定公司。1.2 肿瘤可溶性抗原的提取肺癌GLC-82细胞在含5%小牛血清的RPMI1640培养液中呈对数生长时，收集并离心洗涤细胞，低渗反复冻融4次，5000r/min离心30min，取上清测定蛋白含量，过滤后于-20贮存。1.3 树突细胞培养与鉴定常规分离健康献血员外周血单个核细胞（PBMC），用含1mmol/L EDTA的PBS洗弃血小板，细胞悬浮于含10%小牛血清的RPMI1640中，以每孔5106个细胞加入6孔细胞培养板，贴壁2h，再用预温的培养液轻轻洗出非贴壁细胞。贴壁细胞在完全培养液中培养，含GM-CSF100ng/ml和IL-4 1000IU/ml诱导DC分化，培养至第4日加入肿瘤抗原10ug/ml，第6日加入TNF-1000IU/ml、PGI2 10nmol/ml促进DC成熟。DC的鉴定采用形态学及直接或间接免疫荧光染色，流式细胞仪分析。1.4 体外细胞毒活性测定将DC细胞分别与HAS-PBMC、PBMC混合培养4h，称为DC-HAS-PBMC和DC-PBMC，作为细胞毒测定的效应细胞。靶细胞选择两株人肺癌GLC-82和A549细胞。在96孔细胞培养板中，每个试验孔含效应细胞105个，靶细胞104个，效靶比为10:1。另设效应细胞105/孔、靶细胞104/孔等对照。每孔设3个复孔，置37、5%CO2环境中培养16h, MTT显色，测490nm吸光度值（A值）。抑制率计算公式如下： 抑制率=1-（试验孔A值-效应细胞孔A值）/靶细胞孔A值 100%1.5 裸鼠抑瘤实验向3-4周龄、体重18-22克的裸鼠皮下注射GLC-82细胞5105个，并随机分为3组：（1）生理盐水对照组，分别于注射肿瘤细胞后的第4、10、15日向肿瘤局部注射生理盐水0.2ml；（2）DC-HAS-PBMC组，分别于注射肿瘤细胞后的第4、10、15日向肿瘤局部注射1107/0.2ml个DC-HAS-PBMC细胞；（3）DC-PBMC组，分别与上述相同时间注射1107/0.2ml 个DC-PBMC细胞，观察并记录肿瘤生长情况。2. 结果2.1 DC培养与鉴定DC培养7日在相差显微镜下可见到大量毛刺状突起，呈典型的DC形态。细胞经流式细胞仪分析，CD1a阳性率71%，CD83阳性率50%，高表达HLA-I、HLA-II和CD45分子，CD14阳性率低于10%。2.2 体外细胞毒活性体外实验表明：1）HAS刺激后的PBMC显示出对GLC-82和A549细胞的非特异性细胞毒作用；2）PBMC经过GLC-82抗原负载的DC刺激后对GLC-82和A549细胞的细胞毒作用均明显增强；3）HAS-PBMC经过GLC-82抗原负载的DC刺激后对GLC-82和A549的抑制作用也明显增强（图1）。2.3 体内抑瘤实验生理盐水对照组裸鼠在接种GLC-82细胞后第4日即开始出现肉眼可见的肿瘤生长，第20日时肿瘤体积可达300mm3。DC-HAS-PBMC和DC-PBMC可显著抑制肿瘤的生长，其中以前者的抑瘤效果尤佳（图2）。3. 讨论在抗原诱发抗肿瘤特异性免疫排斥反映过程中，以树突细胞为代表的抗原提呈细胞发挥了重要作用。大量研究证实肿瘤细胞自身不表达B7分子，不具备将抗原信息直接提呈给效应细胞的能力。肿瘤抗原首先需被抗原提呈细胞摄取、加工，再提呈给CD4+和CD8+T淋巴细胞并使之激活，CD4+T细胞活化后又可通过释放细胞因子促进CD8+T细胞的进一步激活，转变为细胞毒T淋巴细胞，发挥抗肿瘤免疫效应。这一途径是当今认为肿瘤特异性免疫应答的最主要途径1,2。最近几年，随着树突细胞体外培养技术的日臻完善，有关树突细胞肿瘤疫苗的研究与应用引起了广泛关注，在国外用于治疗淋巴瘤、黑色素瘤、肾细胞癌等恶性肿瘤已初见成效3。目前，北京医科大学已率先在国内将树突细胞瘤苗常规用于清除肿瘤微小残余病灶的治疗之中。在本项实验设计中，DC细胞和T细胞均来自同一健康献血员，MHC相配，故肿瘤抗原经DC摄取、加工后可以提呈给T细胞，但是由于GLC-82、A549细胞均为已建株的人肺癌细胞，不可能与献血员T细胞的MHC相配，无法完成对肺癌细胞的特异性杀伤作用。因此本项实验中DC促进效应细胞对两种肿瘤细胞的抑制作用应是通过MHC非限制性途径完成的。PBMC含有多种细胞成分，主要有淋巴细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞（NK）等，PBMC接受料HAS等物质的刺激后，NK细胞的数量和活性均明显增加，NK细胞对靶细胞的抑制不受MHC限制，对不同来源的肿瘤细胞均有抑制作用。gT细胞是新近发现的具有抗肿瘤细胞毒活性的T细胞，作用与NK细胞有相似之处，对肿瘤细胞的抑制效应也不受MHC限制4,5。本文发现了抗原负载的DC细胞有MHC非限制性增强免疫活性细胞抑制肿瘤生长的作用，但是对其确切的作用机理尚未阐明，推测是由于DC细胞对NK、gT细胞活性产生了直接或间接促进作用的结果，不排除有尚未知晓的其它机制的参与。参考文献1. Armstrong TD,Pulaski BA,and Ostrand-Rosenberg S. Tumor antigen presentation: changing the roleJ. Cancer Immunol Immunother 1998;46(2):70742. Greten TF and Jaffee EM. Cancer VaccinesJ J Clin Oncol 1999;17(3):104710603. Gilboa E,Nair SK,and Lyerly HK. Immunotherapy of cancer with dridritic cell based vaccinesJ. Cancer Immunol Immunother 1998;46:82874. Kaufmann SHE. r and other unconventional T lymphocytes:what do they se and what do they doJ? Proc Natl Acad Sci USA 1996;9