454微生物分析.doc

454高通量测序方法取适量污泥发酵混合液在10000rpm条件下离心5min， 然后使用OMEGA 公司 E.Z.N.A Soil DNA试剂盒抽提基因组DNA，1%琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组DNA合格后，利用引物27F (5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3)和533R(5-TTACCGCGGCTGCTGGCAC-3) 对细菌的16S rRNA的V1-V3区域扩增。PCR 采用TransGen AP221-02：TransStart Fastpfu DNA Polymerase，20l反应体系包括：4 mL 5 FastPfu Buffer, 2.0 mL 2.5 mM dNTPs, 0.4 mL 前引物, 0.4 mL 反向引物，10.0 ng DNA 模板以及0.4 mL FastPfu Polymerase (TransStart FastPfu DNA Polymerase,TransGen). PCR扩增程序如下：先在95反应2min，然后进入扩增循环，每一次扩增循环分别在95，55 和72温度下保持30s，共进行循环25次，最后在72保持5min，最后在10条件下5min褪火结束反应。每个样品3个重复，将同一样品混合后用2%琼脂糖凝胶电泳，使用AXYGEN 公司的AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒切胶回收PCR产物，Tris_HCL洗脱；将已构建好的PCR产物文库参照电泳初步定量结果，借助Promega公司的QuantiFluor -ST荧光定量系统，用PicoGreen dsDNA 定量试剂盒(PicoGreen dsDNA Quantitation Reagent) 进行检测；获得标准曲线并对PCR产物文库定量，然后按每个样品的测序量比例混合，并使用Roche 指定的 （Roche emPCRAmp-Lib_L Kit）制备EmPCR产物，在Roche Genome Sequencer FLX + 进行上机测序。最后对数据进行分析优化，丢弃长度短于200bp、模糊碱基数大于0、序列平均质量低于25的序列，获得优化序列数据。使用Furthest neighbor 方法（/wiki/Cluster）聚类生成OTU(按相似度97%)并进行生物信息统计分析。 数据分析结果如下：表1. 不同发酵系统中高通量测序数据有效性总结Sample ID = 0.03 = 0.05ReadsOTUsACEaChao1ShannonOTUsACEChao1ShannonControl760329091739888697.1224421059663256.85nZVI809826021362770946.7422041029056916.47Chao：是用chao1算法估计样品中所含OTU数目的指数，chao1在生态学中常用来估计物种总数，Ace：用来估计群落中OTU数目的指数，由Chao提出，是生态学中估计物种总数的常用指数之一，Shannon：用来估算样品中微生物多样性指数之一。它与Simpson多样性指数常用于反映alpha多样性指数。Shannon值越大，说明群落多样性越高。微生物结果分析：图1. 空白和nZVI反应器中微生物文氏图 (97%相似度)目前，454高通量测序方法作为一种分析微生物种群结构优选方法已广泛应用于环境样品中，如污泥和土壤样品。本课题采用454高通量测序方法研究nZVI的加入对厌氧发酵产酸系统中的微生物种群结构和丰度进行深入分析。实验结果表明nZVI加入改变了发酵系统中的微生物种类和丰度，与空白反应器相比仅有748个OTUs（占总OTUs的13.5%）相同（图1），充分说明厌氧发酵系统的微生物结构已经发生变化。图2（A）heatmap图显示了加入nZVI和空白反应中，微生物在门类水平的分布情况，由图可以看出每个反应中都有21个门的微生物种类被检出，而主要的微生物门类包括Proteobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes, Chloroflexi 和 Actinobacteria, 分别占总数的的88.2% （空白反应器）和88.8% (nZVI反应器) 。这些门类的微生物在厌氧发酵过程中的有机物的降解以及短链脂肪酸的形成起着重大作用。如Firmicutes 门类的细菌是厌氧第1 阶段的主要菌群，能够在水解酸化过程中产生纤维素酶、蛋白酶和各种胞外水解酶，并通过新陈代谢来降解纤维素、蛋白、多糖和氨基酸等有机物，是纤维素等复杂大分子的主要降解菌；Bacteroidetes 门类的细菌是污泥中温消化的主要降解菌，能够降解多糖等有机物，同时还能够产生氢气、二氧化碳、纤维二糖、葡萄糖和乙酸；Proteobacteria 门类的细菌也是污泥水解和产酸的主要菌。图2（B）进一步在纲类水平揭示了微生物结构在两个反应器（空白和加入nZVI）的变化情况，反应器中的微生物总共分为45个纲。空白反应中的微生物主要有Beta-, Alpha-, Gamma-, Delata-proteobacteria, Sphingobacteriia和Clostridia组成，而加入nZVI的反应器中主要由Beta-, Alpha- Gamma-, Delata-proteobacteria, Bacteroidia, Sphingobacteriia, Clostridia, Caldilineae 及 Actinobacteria构成。 其中Bacteroidia 和 Clostridia两类与有机物降解以及有机酸的生产密切相关的微生物的比例在nZVI的反应中得到大幅提高，这与厌氧发酵过程中nZVI加入加快污泥的溶解和水解速度，提高短链脂肪酸的浓度结果一致。 (A)(B)(C)图2. 空白和nZVI反应器中微生物种类与丰度变化(A) 门类（Phylum level）水平； (B) 纲类（Class level）水平； (C) 属类（Genus level）水平。 微生物的相对丰度：一种微生物序列数占样本中总序列数的比例(%)，others包括其相对丰度在系统中小于1%的微生物。从微生物属类水平能更加直观的说明nZVI对发酵系统中水解和产酸微生物的影响。图2（C）所示，nZVI反应中的主要微生物有发酵相关的微生物组成，包括： Tissierella, Parabacteroide, Fusibacter, Paludibacter, Caldilinea，Petrimonas, Tetrasphaera and Oscillibacter,其相对丰度分别为 3.3%, 3.1%, 2.4%, 1.8%, 1.5%, 1.4%, 1.1% 和 0.8%，占总比例的15.4%。 而相应的，这些微生物在空白反应中的相对分度仅仅为0.0%, 0.2%, 1.0%, 0.8%, 0.7%, 0.1%, 0.3% 和 0.0%，仅占总量的3.1%。 nZVI发酵系统中的功能微生物明显大于空白，说明NZVI的加入有利于发酵产酸微生物的增长。在这些微生物中Parabacteroide 和 Tetrasphaera 是能有效产生和分泌水解酶（如蛋白酶和葡萄糖苷酶），加速污泥厌氧发酵产酸过程中的蛋白质和糖类等有机物的溶解和水解过程，从而加入整个发酵过程，这与实验结果一致。而对于Zoogloea 和Haliscomenobacter,虽然它们在空白反应器中的相对丰度大于nZVI反应中(Zoogloea, nZVI 1.1% versus Control 6.1%; Haliscomenobacter, nZVI 0.1% versus Control 0.3%)，但是它们将使污泥颗粒聚集，抑制污泥的溶解和水解过程，因此nZVI能改善了厌氧过程中限速步骤:溶解和水解过程。 另外，Parabacteroide和Paludibacter作为两种产丙酸的微生物，在nZVI反应中的丰度显著大于空白反应器中，导致厌氧发酵过程中丙酸浓度的大大提高。总而言之，nZVI的加入明显改善了污泥厌氧发酵系统中微生物结构和数量，更有利于水解和酸化细菌的生长，从而大幅度提高短链脂肪酸的产生量。参考文献1.Zheng, X.; Su, Y. 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