（微生物学专业论文）杜氏盐藻生物学特性研究.pdf

摘要 本文系统研究了营养因子对杜氏盐藻生长的影响 每一类营养因子内4 种促长效 果最好的营养因子对盐藻生长的综合影响 以及如何利用化学诱变剂e m s 处理盐藻 获得a c t 抗性突变株 利用本实验室分离纯化得到的无菌藻株a 1 研究影响杜氏盐藻生长的营养因子 如激素碱基 氨基酸 维生素 金属微量元素和动植物抽提液等 实验采用的6 种激 素2 4 d 6 b a g a i b a n a a 和i a a 在适宜的浓度下对盐藻生长都有不同程度 的促进作用 在这6 种激素中 每种激素的最适浓度如i b a 0 5 m g l 0 1 2 4 1 0 5 r a g l j 6 b a 1 0 m g l 1 和g a 0 1 m g l 1 对盐藻生长的促进作用要比 n a a 5 0 m g l 和i a a 0 5 m g l 1 对盐藻生长的促进效果好 选取这4 种激素做正交 实验 得到最优组合2 4 d 0 1 m g l 1 i b a i 0 m g l 6 b a 0 5 m g l 1 g a 0 5 m g l 5 种碱基a t c g 和u 在适宜的浓度时对盐藻生长有促进作用 在这5 种 碱基中 a 0 5 m g l 1 c 1 0 m g l 1 u 1 0 m g l 1 和t 1 0 m g l 1 对盐藻生长的促进作 用比o o 5 m g l 好 选取这4 种碱基做正交实验 得到最优组合为c o 5 r a g l 1 a 1 0 m g l t 1 5 m g l 1 u 0 0 m g l 1 3 种氨基酸色氨酸 赖氨酸 脯氨酸 缬氨酸 甘氨酸 谷氨酸 精氨酸 组 氨酸 丝氨酸 半胱氨酸 苯丙氨酸 甲硫氨酸和苏氨酸在适宜的浓度下对盐藻生长 都有不同程度的促进作用 在这1 3 种氨基酸中 适宜浓度的脯氨酸 甘氨酸 精氨 酸和苯丙氨酸比其他多种氨基酸在适宜浓度下对盐藻生长的促进效果好 选取这4 种氨基酸做正交实验 最优组合为苯丙氨酸 2 5 m g l 1 精氨酸 1 5 m g l 脯氨酸 2 0 r a g l 甘氨酸 1 5 m g l 6 种维生素v b l v b 6 v b l 2 v h v c 和叶酸 在实验设置的浓度下v h 和叶 酸对盐藻的生长有抑制作用 并且浓度越高抑制作用越强 v b l v b 6 v b l 2 和v c 在适宜浓度下都对盐藻生长有不同程度的促进作用 这4 种维生素进行正交实验 得 到最优组合v b l 9 0 1 a g l 1 v b 6 4 0 9 9 l 1 v bn 2 1 0 p g l 1 v e 1 6 0 1 1 9 l 1 实验中采用的微量元素种类与盐藻培养基中微量元素种类一致 通过改变培养基 中微量元素的含量来研究微量元素对盐藻生长的影响 6 种微量元素分别是c u z 1 1 m u c o m n 和b 实验结果表明高浓度和低浓度的微量元素对盐藻的生长都不利 在低浓度时盐藻生长缓慢 高浓度对盐藻有毒害作用 c u z n m u c o m n 和b 的最适浓度分别为6 p g l 一 1 0 l a g l 3 8 i t g l 2 5 5 i t g l 8 2 l a g l 一 6 1 t l g l 一 5 种有机复合营养因子土豆汁 豆芽汁 蛋白胨 酵母和鱼汤对盐藻的生长都有 很明显的促进作用 这5 种复合有机营养因子的最适浓度分别为1 0 6 4 9 l 2 9 l 1 和8 e m s 是一种化学诱变剂 常用于高等和低等生物的诱变育种 用e m s 处理盐 藻 盐藻9 5 致死率剂量为6 出发藻株对a c t 的抗性为0 0 5 r a g l 一 经过筛选驯 化得到对a c t 抗性为0 4 r a g l 1 的藻株 关键词 杜氏盐藻 e m s 营养因子 诱变 正交实验 a c t a b s t r a c t i nt h i st h e s i s n u t r i e n tf a c t o r st h a ta f f e c tt h eg r o w t ho fds a l i n aw e r es t u d i e d s y s t e m a t i c a l l yf o rt h ep u r p o s eo fi n c r e a s i n gt h eb i o m a s s o fs t r a i na 1i nl i q u i dc u l t u r e t h e c o r r e l a t i o na m o n gf o u rb e s tn u t r i e n tf a c t o r so fe v e r yn u t r i e n tf a c t o r sw e r ec o n s i d e r e d a n d h o wt og e ta c tr e s i s t a n tm u t a n to f d s a l i n ab yt h ee m s w a sa l s os t u d i e d e f f e c t so f n u t r i e n tf a c t o r so nt h eg r o w t ho f s t r a i na 1w e r eo f h o r m o n e s b a s e s a m i n o a c i d s v i t a m i n s t r a c ee l e m e n t sa n d p r o p a g a t i o n e x t r a c t i v ef l u i d n l er e s u l t ss h o w e dt h es i x h o r m o n e s 2 4 d 6 b a g a i b a n a aa n di a aw i t hs u i t a b l ec o n c e n t r a t i o n sc o u l d a c c e l e r a t et h eg r o w t ho fs t r o j na 1a td i f f e r e n td e g r e e s i nt h e s es i xh o r m o n e s i b a 0 5 m g l 1 2 4 d 0 5 m g l j 6 b a 1 0 m g l i a n dg a 0 1 m g l 1 h a dc o m p a r a t i v e l y d i s t i n e ti m p r o v e m e n t o r t h o g o n a lt e s tw i t ht h e s ef o u rh o r m o n e si n d i c a t e dt h a ti b a 2 4 d 6 b aa n dg ah a d s i g n i f i c a n t e f f e c t so nb i o m a s sa t9 5 l e v e l a n dt h eo p t i m u m c o m b i n a t i o no fh o r m o n e sw a s2 4 d 0 i m g l i b a i 0 m g l 6 b a 0 5 m g l 1 g a 0 5 m g l 1 1 1 em o s ts u i t a b l ec o n c e n t r a t i o n so f f i v eb a s e sa c u ta n dgw e r e0 5m g l 一 1 0 r a g l 一 1 0 m g l 1 0 m g l 1 a n do 5 m g l 1 r e s p e c t i v e l y a n da c ua n dth a d c o m p a r a t i v e l y d i s t i n c t i m p r o v e m e n te f f e c t s o r t h o g o n a l t e s tw i mt h e s ef o u rb a s e s i n d i c a r t e dt h a ta c ua n dth a ds i g n i f i c a n te f f e c t so nb i o m a s sa t9 5 l e v e l a n dt h e o p t i m u m c o m b i n a t i o no f b a s e sw a s c o 5 m g l 1 a 1 0 m g l 1 t 1 5 m g l 1 u 1 0 m g l 1 t h i r t e e na m i n oa c i d sw e r e v a l l y s p r o t r p g l y g i n a r g h i s p h e s e r m e t c y sa n d 1 1 1 r t h ee f f e c t so f t h es u i t a b l ec o n c e n t r a t i o n s o f p r o g l y a r g a n dp h ew e r e m o r eb e t t e rt h a nt h a to f t h eo t h e ra m i n oa c i d s o r t h o g o n a lt e s t i t l lt h e s ef o u ra m i n oa c i d s i n d i c a t e dt h a tp r o g l y a r ga n dp h eh a d s i g n i f i c a n te f f e c t so n b i o m a s sa t9 5 l e v e l a n d t h eo p t i m u mc o m b i n a t i o no fa m i u oa c i d sw a sp h e 2 5 m g l 一 a r g 1 5 m g l p r o 2 0 m g l 1 a n dg l y 1 5 m g l 1 v ha n df o l a c i ni n h i b i t e dt h eg r o w t ho fns a l i n aa tt h es e tc o n c e n t r a t i o n a n dt h e h i g b e r c o n c e n t r a t i o nt h es t r e n g t h e ri n h i b i t i o n t h es u i t a b l ec o n c e n t r a t i o n so f v b l v b l 2 v b 6a n dv cc o u l da d v a n c et h eg r o w t ho fn s a l i n ar e s p e c t i v e l y o r t h o g o n a lt e s tw i 廿l t h e s ef o u rv i t a m i n si n d i c a t e dt h a tv b l v b l 2 v ca n dv b 6h a ds i g n i f i c a n te f f e c t so n b i o m a s sa t 9 5 l e v e l a n d t h e o p t i m u m c o m b i n a t i o no fv i t a m i n sw a s v b l 9 0 p g l v b 6 4 0 9 9 l 1 v b l 2 1 0 肛g l 1 v c 1 6 0 p g l 1 t h ek i n d so ft r a c ee l e m e n t si ne x p e r i m e n t sw e r es a m ea st h o s eo ft h e o h n s o n h i m e d i u m a n dt h ee f f e c t so f t h ei r a c ee l e m e n t st ot h eg r o w t ho f ns a l i n aw e r es t u d i e d n e s i xt r a c ee l e m e n t sw e r ec u z n m u m na n db i7 j 始r e s u l t ss h o w e dt h a tt h eb o t hh i g h e r a n dl o w e rc o n c e n t r a t i o nt h a nt h a to fj o h n s o nm e d i t t mc o u l dp r e v e mt h eg r o w t ho fn s a l i n a t h es u i t a b l ec o n c e n t r a t i o n so f t h ec u z n m u m na n dbw e r e 6 弘g l 1 0 p g l 一 3 8 p g l 2 5 5 g l i 8 2 p g l 1a n d6 1 i t g l r e s p e c t i v e l y f i v eo r g a n i cc o m p l e xn u t r i e n tf a c t o r sp o t a t oe x t r a c t b e a n s p r o u te x t r a c t p e p t o n e y e a s t a n dd a s h ia d v a n c e d d i s t i n c t i v e l y t h e g r o w t ho ft h eds a l i n a n l es u i t a b l e c o n c e n t r a t i o no ft h i sf i v en u t r i e n tf a c t o r sw e l e1 0 6 4g l 2 9 l 1a n d8 r e s p e c t i v e l y e m si sac h e m i s t r ym u t a n t w h i c hw a su s e dt om u t a n tb r e e d i n gf o rt h eb i o l o g y n 圮 9 5 l e t h a t a ld o s ew a s6 o fe m sa n dt h ed o s ew a ss u i t a b l ef o rt h ei s o l a t i o no fm u t a n to f ns a l i n a t h er e s i s t a n c et ot h ea c to f t h eo r i g i n a l i t yd s 四加口w 船o 0 5 m g l t h em u t a n t s t r a i nc o u l dr e s i s t a n ta c ta tt h ed o s eo f 0 4 m g l 1 k e y w o r d s d u n a l i e l l as a l i n an u t r i t i o nf a c t o r s e m sm u t a n t o r t h o g o n a l t e s t a c t 缩略词 英文全名 e r y t h r o m y c i n c h l o r a m p h e r t i e o l a e t i d i o n e i n d o l eb u t y r i ca c i d h e t e r o a u x i n g 6 b e n z y la m i n o p u r i n e g i b b e r e l l i n d i c h l o r o p h e n o x y a c e t i c a c i d n a p h t h a l e n e a c e t i ca c i d v i t a m i n eb 6 v i t a m i n eb 1 2 v i t a m i n ec v i t a m i n eh e t h y lm e t h y ls u l p h o n a t e c o n t r o l d a y a d e n i n e g u a n i n e t h y m i n e c y t o s i n e u r a c i l 中文名 红霉素 氯霉素 放线菌酮 吲哚丁酸 吲哚乙酸 6 苄氨基嘌呤 赤霉素 2 4 二氯苯氧乙酸 萘乙酸 维生素b 6 维生素b 1 2 维生素c 生物素 甲基磺酸乙酯 对照 天 腺嘌呤 鸟嘌呤 胸腺嘧啶 胞嘧啶 尿嘧啶 躺跏 觚姒 姒 姒 郴 k 詈强 d a g t c u 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果 尽我所知 除了文中特别加以标注和致谢的地方外 论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果 也不包含为获得安徽农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意 研究生签名 时间 2 0 0 5 年6 月1 0 日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解安徽农业大学有关保留 使用学位论文的规定 即 学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘 允许论文被查阅和借阅 可以采用影印 缩印或扫描等复 制手段保存 汇编学位论文 同意安徽农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表 传播学位论文的全部或部分内容 保密的学位论文在解密后应遵守此协议 时间 2 0 0 5 年6 月1 0 日 时间 2 0 0 5 年6 月1 0 日 综述 1 盐藻简介 盐藻即杜氏盐藻 d u n a l i e l l a s a l i n a 是一种广泛分布于海洋 盐湖等盐度较高地 区的绿藻 1 8 3 7 年 它首次为法国人d u n a l 发现于地中海沿岸的盐池中 其分类学 地位是绿藻门 绿藻纲 团藻目 杜氏藻科 杜氏藻属 l 杜氏藻属约有3 0 个种 其中以杜氏盐藻 d s a l i n a 最有代表性和应用最为广泛 杜氏盐藻为单细胞藻类 形态 和衣藻 c h l a m yd o m o n a s 十分相似 但盐藻无细胞壁 原生质膜外有一层糖蛋白质纤 维组成的薄而富有弹性的外被 2 1 个体通常呈卵圆形 当外界渗透压发生改变时 其 形状可变为球形至纺锤形 具2 条等长的鞭毛 可自由游动 藻体内有一杯状叶绿体 内含一淀粉核 藻体前端有一红色眼点 盐藻的繁殖方式有营养繁殖和有性生殖两种 营养繁殖为纵裂 在一定条件下可形成群胶体 在不利条件下 可形成不动孢子 有 性生殖为同配生殖 形成接合子 合子经减数分裂萌发形成3 2 个子细胞 从母细胞 中释放出来 2 盐藻生理学的研究 2 1 耐盐性及其机制的相关研究 盐藻具有广泛的盐适应度 能耐受生存环境中0 0 6 5 5 m o l l 1 的n a c i 盐浓度 3 l b e n a m o t z 及b e l m a n s 等分别对盐藻的渗透压调节机理研究结果表明 其细胞内能进 行渗透调节的物质是甘油 3 磷酸甘油脱氢酶 g p d 是甘油代谢过程中的关键酶 能 控制细胞内甘油的产生和积累 4 卯 当盐藻生境中盐浓度升高后 其细胞内即开始进 行甘油的合成 盐浓度降低则促进甘油的转化 使细胞快速适应新的环境 卵l 陈志 等也研究表明盐藻是通过甘油的合成与转化来调节渗透压 恢复其原来的形状和大小 的 埘 甘油的转化是发生在甘油与淀粉之间 当外界低渗时 细胞内的甘油转化为淀 粉 所需能量由正常呼吸链和交替氧化酶提供 当外界高渗时 淀粉则降解为甘油 光照下能量由光合电子提供 黑暗中则由正常呼吸链提供 9 1 黄益群等认为在甘油代 谢途径中 二羟丙酮还原酶催化甘油与二羟丙酮之间的转化 为甘油合成或转化的一 个关键酶i j g e e 等通过改变培养条件 从杜氏盐藻细胞中分离到了三种g p d 同功 酶 其中一种起渗透调节作用 称为 调渗型 同功彰l l 白含林等研究发现在外界渗 透压骤增时 该同功酶酶活有显著增加 并据此认为渗透压调节功能的启动 很可能 与酶蛋白原的激活有关 珏 s a d a k a 等研究表明盐藻对高盐的适应与细胞内某些蛋白 表达量有判u 并于1 9 9 1 年鉴定了与盐适应相关的1 5 0 k d 蛋白 发现该蛋白位于细 胞表面 与高盐下细胞分裂生长有关 1 4 1 m o r l y 等发现并鉴定与盐适应相关的另一种 6 0 k d 蛋白 f i s h e r 等对e d n a 序列的分析表明1 5 0 k d 蛋白是一种转铁蛋白 1 6 6 0 k d 蛋白是一种碳酸酐酶 位于细胞膜上 与离子的运输有关i l 徐坤等研究亦证 明这些蛋白含量变化可能和杜氏盐藻的盐适应有一定的联系 l 从整个渗透调节过程 来看 渗透骤变后离子效应和其它生理活动也是杜氏盐藻渗透调节的重要组成部分 忙j 陈思学等认为渗透震扰信号可通过蛋白质磷酸化进一步放大 而2 4 k d 蛋白是杜 氏盐藻细胞内蛋白激酶最有潜力的底物 9 1 2 2 光 温 p n 等生态因予的研究 盐藻营自养生活 必须依靠光合作用来合成有机物质 因此 光照对于杜氏盐藻 的生长发育至关重要 盐藻能耐强光照 对自然光的利用率可达3 l l 高于一般高 等植物 这可能与大细胞藻类的细胞生理机制有关 2 0 l 彭建新等研究杜氏盐藻光合特 性时指出盐藻具有正常的光系统结构 并且藻细胞可诱导可逆的光状态转换 2 s c h r e i b e r 等也指出盐藻具有如高等植物叶绿体光系统口相近的结构和功能阎 陈敏等 认为光系统口中的捕光复合物d l h c d 由4 种2 7 3 1 k d 多肽构成 2 3 江月玲等研 究蛋白修饰剂对盐藻光合速率及吸收光谱特性的影响后指出具有多酶体系和复杂蛋 白结构的完整细胞的蛋白构象与光合功能存在一定的关联 2 4 夏丽等研究低温条件下 光抑制作用 结果发现低温提高盐藻对光抑制的敏感是由于低温抑制了光合放氧 是 光系统口反应中心多余的激发能增加以及光系统口修复循环受到阻碍的结剥2 5 1 彭长 连等研究指出在1 0 d 3 5 口的条件下 盐藻的光饱和点2 2 0 1 u n o l m 2 s 1 闭 夏丽等应 用叶绿素荧光技术检测盐藻产生非荧光淬灭的条件和鉴别非光化学荧光淬灭的组分 后 结果表明通过增加能量耗散可以避免光破坏光合器官的保护机制 2 7 彭长连等通 过研究强光下s 0 3 和h c 0 3 对杜氏盐藻叶绿素荧光的影响指出低s 0 3 2 浓度下强光的 光抑制在随后的低光条件下放置2 h 后能完全恢复 高浓度引起的光抑制不能完全逆 转 低光下h c o a 能促进光抑制的恢复 勰 林植芳等研究单细胞盐藻在强光前后 5 0 5 r i m 的光 暗差示吸收变化后 结果表明d a 5 0 5 可作为强光下植物光保护机制运行 状况的检测指标 2 9 此外 杨震等比较海洋单细胞藻对紫外吸收差异后发现盐藻的吸 收峰最大 3 0 h e m a n a n n 等认为盐藻的光化学效率在全模拟太阳光下比在滤除u v b 的情况下显著下降 在适宜的温度条件下 盐藻分裂旺盛 生长快速 古玉环等实验研究表明杜氏盐 藻的温度范围在5 3 5 口 最适生长温度为2 5 3 0 d 低于5 口藻生长缓慢 细胞几乎 不增殖 当温度超过3 5 d 后 藻细胞会逐渐死亡 3 2 1 盐藻能抵御碱性环境 其细胞内的酸性液泡是一个大容量的胺缓冲系统 可以防 止细胞质碱化和光合过程解偶联的 卫士 研究表明杜氏盐藻的最适生长p h 为9 0 左右哪j 影响和制约杜氏盐藻生长发育的气体主要有c 0 2 培养液中如果缺乏c 0 2 则会限制藻细胞的生长 2 3 营养条件的研究 盐藻生长发育所必需的矿质元素有 c h o n p k c a m g s f e 等 l o 余种 除此之外 还需要一些如b i z n w 等微量元素 盐藻是一种光合自养生物 需要无机碳作为其碳源 无机碳的溶解量与培养液中 的盐度和温度有关 对于高盐环境下生长的柱氏盐藻而言 无机碳的供给可能是其生 长的最大限制因素 2 5 d 2 5 盐浓度 p h 9 0 的条件下 9 9 9 0 0 的无机碳是以c 0 3 的形式存在 其次是h c 0 3 几乎无c 0 2 的存在 3 4 1 盐藻细胞表面存在碳酸酐酶 3 5 j 们 并具耐盐性 可使杜氏盐藻在高盐条件下能很好地吸收c 0 2 杨雪梅等认为盐藻若 以n a h c 0 3 为碳源 其浓度为l g l 1 若以c 0 2 为碳源 其培养液的p h 值应在7 9 p 在盐藻的培养中 硝酸盐是最常用的氮源 m i l k o 和g r a n t 等认为n a n 0 3 是杜氏 盐藻最好的氮源0 9 4 0 1 但盐藻对硝酸盐和亚硝酸盐的吸收利用是需要光照的 铵态氮 一般不能被盐藻吸收利用1 4 1 有机碳源如尿素 谷氨酰胺一般不如无机氮有效m 4 3 李建宏等实验发现使用低浓度腮比硝酸盐对盐藻的生长更有效1 4 4 1 王富平等认为在盐 藻培养中投入0 2 m m o i l 1 1 0 r e t o o l l 1 的尿素 可以得到适宜的细胞生长速率和较 高的类胡萝h 素含量 4 5 陈晗华等认为k n 0 3 k h 2 p 0 4 作为盐藻氮源 磷源的最适 浓度分别为1 0 m m o l g l 1 和0 3 m m o l l o 4 6 姜建国等实验发现 n 1 p 1 比值在2 5 3 0 时盐藻细胞生长速率最高1 4 7 在海水环境中有足够的离子可供盐藻生长所需 盐藻生长所需的最适浓度c a 2 m 9 2 分别是1 m m o l l 1 和0 1 m m o l l 1 问 而最适f e 离子浓度为1 2 5 3 7 5m g l 1 c l s q 4 2 有利于生长的最佳比值3 2 有利于胡萝卜索积累的比值则是8 6 阳l 微量元素和生长因子的相关研究尚未见报道 3 盐藻细胞生物学研究 3 1 细胞壁的电镜观察 c h a r d a r d 通过细胞切片和电镜观察发现d b i o c u l a t a 藻无完整的细胞壁 但细胞 膜外有一层薄而柔软的糖蛋白纤维外被 2 刘广发等通过电镜观察发现d p e i r c e i 细 胞外被由不同类型的糖蛋白纤维构成 一类长约5 0 一2 0 0 n m 的柔软纤维 均匀地布满 细胞的外周 另一类为长约6 0 n m 簇状分布的纤维 呈有规则的分散排列 且这两类 纤维通常不同时出现在同一细胞上 5 0 3 2 原生质膜组成的研究 盐藻对盐的适应是一个信号传导过程 而其原生质膜很可能是信号传导的第一 站 己分离提纯的1 5 0 k d 和6 0 k d 均位于细胞或细胞膜上 这两种蛋白均是盐诱导 蛋白 有关于它们的功能尚在进一步的研究之中 k a t z 等认为质膜上的h a t p a s e n a 脯泵也在一定程度上参与渗透调节 5 q 甚至有研究者认为旷 a t p a s e 是渗透调节 的触发器 8 5 2 5 3 3 3 原生质膜通透性的研究 盐藻缺乏细胞壁 是一个进行膜研究的良好材料 甘油是一种易透过细胞膜的物 质瞰 细胞中最终的甘油浓度是由细胞合成甘油与排出甘油达到平衡时所决定的 但 在盐藻细胞内外甘油浓度之比可高达1 0 4 1 1 5 5 1 盐藻细胞膜对水的通透性与其它膜 无差异 但对甘油的通透性却比脂质囊泡和猪红血细胞要低得多 矧 然而当温度达到 5 0 3 时 其通透性会发生改变 甘油流出细胞 细胞开始死亡 陈思学等研究盐藻细 胞质膜还原系统后发现其具有氧化n a d p h 还原f e c n 6 3 和0 2 的还原系统 5 7 l 3 4 其它重要细胞器的研究 刘广发等研究d p e i r e e i 超微结构后发现其鞭毛和基体分别为 9 2 和 9 o 型 中心粒由9 个三联体组成 高尔基体1 2 个 由二排椭圆形小球构成的眼点位于细胞 质中 内质网丰富 线粒体形状多样 在 杯形 叶绿体中发现雏形的基粒及 杯 侧上 的小孔 叶绿体前端凹凸不平 后端具一大型淀粉核 细胞核位于 杯形 叶绿体的凹 窝中垆 黄晓航等研究d v i r i d i s 被膜泡囊的超微结构后表明藻体细胞的高尔基体和 细胞膜附近有许多大小不等的被膜泡囊 这些被膜泡囊由泡囊及其表面的网状结构构 成 并观察到被膜泡囊的形成过程 5 8 l 3 5 生殖方式及细胞周期的研究 盐藻通常以细胞纵裂方式进行无性增殖 5 9 1 刘广发等研究d p e i r c e i 细胞纵裂过 程中的一些重要变化后发现眼点的复制严重滞后 原眼点保留于一个子细胞中 另一 个子细胞在分裂后的数小时内无眼点 6 0 l b o l d 认为子细胞的分裂发生在末端 5 9 1 刘 广发等实验发现几乎所有的子细胞都是在距后端约三分之一处最后分开的 沈锡琪 等采用光暗交替法诱导盐藻细胞同步化培养 并测定同步化后的细胞周期 结果发现 合成期比未经处理的大大增加 g 2 期和分裂期大大缩短 6 游兰英等发现经明暗周 期处理过的藻生长曲线不再是典型的 s 型 而呈现受光周期调控的 z 型f 6 2 1 4 盐藻分子遗传学的研究 4 1 系统学研究 游兰英等对d p e i r c e i d p a r v a d b i o c u l a t a d m i n u t a 进行核型分析 首 次从染色体着手对杜氏藻进行分类 6 2 1 张会永等利用随机扩增多态性d n a r a p d 技术对7 株杜氏藻 即d s a l i n a d b a r d a w i l d p r i m o l e c t a d p e i r c e i d p a r v a d b i o c u l a t a 和d m i n u t a 进行遗传多态性分析 结果表明7 株杜氏藻分为两个种比 较合适 6 3 1 4 2 分子遗传学研究 鉴于杜氏藻作为遗传研究材料的独特优点 国内外研究者广泛地开展了基因克隆 和遗传研究 周冀明等采用k e m b l 3 和x g t l o 载体构建杜氏盐藻基因组文库和e d n a 文库 并从基因组文库和e d n a 文库中分别获得了3 个和3 6 个3 磷酸甘油脱氯酶 4 基因的阳性克斛 6 5 与盐藻盐适应有关高盐诱导的碳酸酐酶基因和转铁蛋白基因已 被克隆 1 6 6 6 杨志勇等构建基因组文库 并从文库中也克隆出碳酸酐酶基因 肌动蛋 白基因和硝酸还原酶基因 6 7 张晓宁等克隆了盐胁迫条件下盐藻特异表达基因片段 帕s j 这些工作为进一步研究耐盐机制奠定了基础 此外 也有其它的一些基因被克隆 l o n g 等从构建的e d n a 文库中克隆出主要叶绿素结合蛋白 c a b 基因嗍 k o 等克隆 了位于基体的钙牵蛋白基因 7 0 谈诤等克隆了盐藻肌动蛋白基因及5 端上游片段 7 l 原生质体是生理研究和遗传育种的良好材料 盐藻细胞膜外仅有一层糖蛋白外 被 容易制备原生质体 制备藻类原生质体的方法有机械法 微生物酶法和酶法 c h a r d a r d 利用蛋白酶b 制备了d b i o c u l a t a 的原生质体 2 1 刘广发等采用链霉蛋白酶 制备了d p e i r c e i 的原生质体 并利用p e g 将原生质体与带选择性标记c a t 基因的 大肠杆菌进行融合 获得了融合体 结果证明融合体提高了氯霉素抗性 但未能从融 合子中提取到质粒 而且融合子对c m 的抗性随着传代也逐渐降低 7 2 7 3 何咏雷利用 蛋白酶k 制得杜氏盐藻 d s a l i n a 的原生质体 并采用p e g 化学法将其与带c a t 基 因的大肠杆菌d h 5 a 进行融合 获得的融合子具有较高的c m 抗性 但并未从平板上 检测到这个结果 通过液体培养的后代抗c m 能力大大降低 此外 l e e 等利用p e g 法进行杜氏藻和紫球藻的细胞融合和遗传重组工作 结果得到一些形态像紫球藻而又 耐盐的重组体 7 4 然而 这些研究工作虽取得了很大的进步 但终究未能解决原生质 体的平板再生和融合子的稳定遗传 近年来 藻类分子遗传学的发展 不仅为光合 固氮 渗透调节等基本生命现象 和生理的机理过程研究提供了有利手段 也为藻类的基因工程奠定了基础 二十世纪 八十年代初 海洋蓝藻首先取得遗传转化的成功 开创海洋基因工程的新世纪 此后 逐渐形成了两个并行发展的领域 海洋蓝藻基因工程和海洋真核藻类基因工程 海洋 真核藻类基因工程首先是从莱茵衣藻 c h l a m y d o m o n a sr e i n h a r d i i 的遗传转化开始的 其后 莱茵衣藻广泛应用于分子遗传学和基因工程的研究 目前已成为唯一的染色体 叶绿体 线粒体三套基因组均能遗传转化的模式生物 7 5 1 载体的构建是藻类基因工程 的一个关键所在 是影响外源基因表达稳定性和表达效果的重要因素 至今国内外已 对2 0 余种红藻进行过研究 在其中的1 4 种中发现有质粒 秦松等在一些经济藻类如 钝顶螺旋藻 真江蓠中也发现了质粒 6 7 7 7 8 目前 利用已经发现的或改造的质粒构 建了各种穿梭载体 由于穿梭载体构建的成功 藻类的基因转化取得了突飞猛进的发 展 t a k e y a m a 等采用电激法将构建的穿梭载体p u s y 0 2 转化蓝藻 n k b g 0 4 2 9 0 2 y g l l l 6 藻株 在c a 2 和1 5 甘油处理下获得高频转化子1 7 9 1 h a l l 等 采用玻璃珠研磨法将含n p t 口和n o s 启动子的p g a 4 8 2 转化莱茵衣藻硝酸还原酶突 变株 用双标记筛选 硝酸盐筛选的转化子中5 2 对卡那霉素具有抗性 8 0 j a r v i s 等 进行了萤火虫荧光素酶基因在绿藻椭圆小球藻 c h l o r e l l ae l l i p o s i d e a 中的瞬间表达实 验 结果检测到荧光酶素的合成 2 4 h 时活性最高 4 d 后逐渐丧失捧 秦松等采用基 因枪转化海带 裙带菜等海藻 获得 m s 基因的瞬间表达 嘲 相反 杜氏盐藻的遗 传转化研究进展较慢 李庆顺等通过测定杜氏藻的d n a 酶活性发现杜氏盐藻的d n a 酶活性较低 适合于作为外源d n a 转化受体的较好候选者i 蚓 何咏雷等采用基因枪 将带有3 5 s 启动子的含c a t 基因的p b l 2 2 1 质粒转化杜氏盐藻细胞 但获得的结果并 不理想 耿德贵等实验筛选杜氏盐藻基因工程选择标记 结果表明氯霉素适合作为杜 氏盐藻基因工程的筛选抗生素 6 0 p g l d 是其致死浓度 阱 并采用电激法将g u s 基 因转化盐藻 获得瞬间表达 其中以u b i l q 启动子的转化效率最高 8 卯 5 诱变育种的研究 变异是选择优良品系的基础 因为自发突变的频率较低 因此人工诱发突变在育 种中有重要作用 e m s 作为一种强烈的化学诱交剂在藻类诱变育种中经常使用 早 在8 0 年代r i e c r o d i 等就利用e m s 处理螺旋藻获得了抗氨基酸类似物的突变株 髓 9 0 年代张学成等利用e m s 处理螺旋藻选出了两株耐低温的突变株 8 7 崔海瑞等研究发 现 经过e m s 处理的钝顶螺旋藻在生长和形态方面等受到了很大影响 8 8 汪志平等 采用0 6 的e m s 和2 4 k o y 的6 0c o r 射线处理钝顶螺旋藻 并在7 0 k g y 左右的r 射线为筛选压力 得到了4 株高多糖含量突变株删 由此可见e m s 用于螺旋藻诱变 育种方面的报道较多 也有人利用e m s 和u v 相结合的方法 筛选到一株雨生红球 藻突变株 突变株的虾青素含量是出发株的2 1 l 倍 达到细胞干重的2 4 9 1 9 1 0 1 在 藻类的诱变育种中 有关盐藻诱变育种的报道并不多见 盐藻诱变采用的诱变剂一般 都是紫外线 姜建国等通过紫外线诱变盐藻也获得一株突变株 突变株的胡萝h 素含 量提高6 9 9 l l 刘光发等通过紫外线诱变获得一株突变株 突变株的胡萝卜含量为 原种的6 2 1 5 5 倍嘲 但利用紫外线诱变获得突变株的几率比较小 而e m s 作为一 种强烈的化学诱变荆具有产生突变株几率大 且突变株的性状能够稳定传代的特点 因此 有些盐藻研究者开始采用进行诱变育种 e o n s e o n 等利用e m s 处理盐藻获得 了高玉米黄素突变株 突变株的玉米黄素含量是出发藻株的3 0 倍 且藻细胞的生长 没有受到影响1 9 利用e m s 处理盐藻用于筛选盐藻抗性标记 还未见报道 6 第一章引言 1 1 研究价值和意义 盐藻是一种在食品 医药保健 化工和养殖业中有独特经济价值的微藻 在一定 的生长条件下 藻体细胞内能合成并积累b 胡萝卜素 其含量最高可达干重的1 4 0 4 1 在饱和的盐水中 盐藻细胞内甘油积累可达其干重的8 0 以上 甘油是优质的化妆品 原料 同时也是化工和医药工业中广泛应用的有机化合物 盐藻还是一些动物的优质 饵料 盐藻细胞是单细胞 没有细胞壁 且比较容易培养 较易对其进行遗传改造 在理论研究上具有很多优点 不管从经济价值考虑还是从研究价值出发 盐藻都有非 常大的价值 本文拟从影响杜氏盐藻生长的营养因子出发 研究营养因子如维生素 激素和有 机复合营养等对杜氏盐藻生长的影响 探讨杜氏盐藻生理生化特性 为进一步开展盐 藻分子遗传研究奠定基础 为混养培养时增加生物量提供参考 另一方面 利用e m s 诱变盐藻 试图获得a c t 抗性突变体 为深入开展盐藻遗传学方面的研究提供材料 1 2 国内外研究现状 目前 国内外相当多的研究小组在盐藻生理学 耐盐机制和遗传转化等方面开展 了卓有成效的研究工作 生理学研究大多集中于无机营养特别是n p 等方面的研究 而涉及有机营养对盐藻生长影响的研究却相当少 特别是混养条件下盐藻的生理生化 特性研究更是鲜见报道 盐藻遗传方面的研究主要是筛选一些突变体和开展原生质体融合 基因克隆与遗 传转化 然而在盐藻的诱交育种中基本都是采用紫外线进行诱变 紫外线诱变获得突 变株的几率很小 且费时费工 1 3 本研究拟解决的问题 针对目前国内外研究存在的主要闯题 本研究拟利用杜氏盐藻无菌藻株a l 开展 生理学和遗传学相关研究 探讨营养因子对盐藻生长的影响及e m s 处理盐藻获得a c t 抗性突变株最佳条件 7 第二章材料与方法 2 1 实验材料 2 1 1 试验藻种 杜氏盐藻 d u n a l i e l l a s a l i n a q 0 2 0 7 由中国科学院青岛海洋研究所提供 经本室无 菌纯化 2 1 2 培养基 2 12 1 盐藻培养液 改良的j o h n s o n s 培养基 g l m g c l 2 7 h 2 0 1 5 m g s 0 4 7 h 2 0 0 5 k n 0 3 o 5 k c l 0 2 n a h c 0 3 0 1 5 1 k h 2 p 0 4 o 0 4 3 c a c l 2 o 0 3 5 n a c i 3 0 铁盐母液 l o 微量元素溶液 1 0m h 1 m t r i s h c l p h 8 o 1 0m l 蒸馏水 9 7 0m l 铁盐母液 g l n a 2 e d l a 2 h 2 0 o 2 0 9 f e c l 3 6 h 2 0 o 2 4 4 蒸馏水 1 0 0 0 m l 微量元素母液 m g l h 3 8 0 3 6 1 o n h 4 6 m 0 7 0 2 4 4 h 2 0 3 8 o z n c h 4 1 c u s 0 4 5 i 1 2 0 6 o c o c l 2 6 h z o 5 1 m n c h 4 h 2 0 4 1 蒸馏水 1 0 0 0 m l 固体培养基加1 o 琼脂粉 1 2 1 口灭菌2 0 分钟 2 1 3 仪器与试剂 2 1 3 1 常用仪器 p y x 2 5 0 g a 型光照培养箱 s b j c i a 型超净工作台 回转振荡培养箱 t u 1 8 0 0 s p c 紫外可见分光光度计 s c 3 2 6 型冷藏柜 t g l 1 8 r 台式高速冷冻离心机 l s 5 0 1 立式圆形高压蒸汽灭菌锅 电热恒温培养箱 酸度计 p b 2 0 3 n 电子天平 双筒解剖镜 血球计数板 微量移液器吸管 平皿 2 1 3 2 主要试剂 s 7 2 2 0 型光栅分光光度计 7 2l 型光栅分光光度计 o 二 p u sc 0 11 相差显微镜 m d f u 5 4 1 0 型医用低温保存箱 e m 5 0 1s 型微波炉 普通离心机 1 0 1 型电子鼓风干燥箱 分析天平 w h 3 微型旋涡混合仪 托盘天平 通风橱 离心管 三角烧瓶 n a c l k n 0 3 m g s 0 4 m g c l 2 k c l e d t a 2 n a f e c l 3 6 h 2 0 t r i s h c l h 3 8 0 3 n h 4 6 m o t 0 2 4 4 i 1 2 0 c u s 0 4 5 h 2 0 苄基腺嘌呤 红霉素 氯霉素 c o c l 2 6 h 2 0 z r l c l 2 m n c l 2 4 h 2 0 腺嘌呤 鸟嘌呤 尿嘧啶 胸腺嘧啶 胞嘧啶 色氨酸 赖氨酸 脯氨酸 放线菌酮 甲基磺酸乙酯 胰蛋白胨 2 2 实验方法 2 2 1 抗生素配制方法 缬氨酸 甘氨酸 谷氨酸 精氨酸 组氨酸 丝氨酸 半胱氨酸 甲硫氨酸 苏氨酸 苯丙氨酸 维生素b 簇 酵母提取物 鱼汤 土豆汁 维生素c 叶酸 生物索 泛酸钙 萘乙酸 6 苄基嘌呤 赤霉素 2 4 二氯苯氧乙酸 吲哚丁酸 吲哚乙酸 萘乙酸 豆芽汁 囊2 1 不i q 拣生蠢的配一 塾 生 墅e 型 垒 g g 塑生型 鲤 鲤 抗生索配制方法 贮存条件 2 2 2 土豆汁 豆芽汁等天然营养成分贮备液的配制方法 土豆汁的配制 取新鲜成熟土豆去皮 蒸馏水洗净 切成块后 称3 5 0 9 放入不 锈钢容器内 加入4 0 0 m l 蒸馏水 加热煮沸半小时 煮沸过程中