（植物学专业论文）利用多基因转化技术培育重金属超富集植物的研究.pdf

摘要 摘要 植物耐受和积累重金属的细胞学基础是植物细胞内存在一些能够络合和区 隔化金属离子的机制 细胞中络合重金属离子最重要的小肽分子是谷胱甘肽 g s h 和植物络合素 p c s 而y c fi 基因编码的a b c t y p e 液泡膜转运蛋白负 责将重金属离子及其与上述小肽形成的复合物转运进入细胞液泡中 即将重金 属离子区隔化 植物细胞中合成g s h 和p c s 的关键酶分别是y 一谷氨酰氨半 胱氨酸合成酶 g s hi 和植物络合素合酶 p c s 他们的编码基因分别为g s hi 和p c s 此外定位于细胞质中的小囊泡上且对二价阳离子的吸收和转运有重要 作用的s m f 2 蛋白可能也参与重金属离子的区隔化过程 为了改良植物使之能够应用于清除土壤中的重金属污染 本研究基于植物 耐受和积累重金属的细胞学机制 分别将酿酒酵母来源的g s h i y c fi 和 s m f 2 基因 以及g s hi y c f 基因分别与镉抗性植物大蒜来源的a s p c si 基因构建为不同的基因组合表达载体 转化模式植物拟南芥 对不同组合转基 因拟南芥的功能分析表明 1 酵母来源的基因g h si y c f1 分别在拟南芥中异源超表达可以在一 定程度上提高转基因拟南芥耐受 积累重金属的能力 其中g s h 基因在拟南 芥超表达可以提高转基因拟南芥合成g s h 的能力 转基因拟南芥细胞中g s h 浓度比野生型增加 2 将g s h 基因和来自大蒜的么妒c si 基因同时在拟南芥中超表达能够 显著提高转基因拟南芥耐受和积累重金属的能力 且积累和耐受能力显著高于 分别转g s h 或a s p c si 的单价转基因株系 将y c fi 基因和a s p c s 基因同 时在拟南芥中超表达也能够显著提高转基因拟南芥耐受和积累重金属的能力 且积累和耐受能力显著高于分别转y c fi 或4 妒c si 的单价转基因株系 两种 双价转基因株系g s h a s p c s 和y c fi a s p c si 在积累和耐受不同重金 属胁迫方面没有明显差别 3 将s m f 2 基因在拟南芥中异源表达 研究了植物中囊泡转运是否参与了 重金属离子的吸收和区隔化过程 研究结果表明 超表达s m f 2 基因的拟南芥 尽管耐受重金属胁迫的能力与野生型没有明显差异 但其积累重金属的能力显 著提高 这为证明植物中小囊泡转运参与重金属转运提供了间接证据 i 郭江波博士论文 利用多基因转化技术获取重金属超富集植物的研究 综上所述 同时将多个参与植物对重金属络合 转运和区隔化作用的关键 基因在转基因植物中表达可以提高植物耐受和积累重金属的能力 是培育可用 于植物修复的新型工程植物的值得探索的途径 本论文所设计和构建的双价基 因组合及其对目标植物的转化 在环境重金属污染的清除中有潜在的应用价值 关键词 重金属 镉 砷 植物络合素合酶 y c fi p c s i g s h i s m f 2 a b s t r a c t e l e v a t e dh e a v ym e t a lt o l e r a n c ea n d a c c u m u l a t i o ni nt r a n s g e n i cp l a n t so v e r e x p r e s s i n g m u l t i p l eg e n e s j i a n g b og u o d i r e c t e db yp r o f e s o rm im a p l a n t sc e l l sh a v ea l li n t e g r a t e dm e c h a n i s mt ot o l e r a t ea n da c c u m u l a t eh e a v y m e t a l sb yc h e l a t i o na n dc o m p a r t m e n t a t i o n p h y t o c h e l a t i n s p c s a n dr e d u c e d g l u t a t h i o n e g s h a r et h em a i nb i n d i n gp e p t i d e st oc h e l a t eh e a v ym e t a li o n s w h i l e y c fi a na b c t y p ef a m i l yt r a n s p o r t e rl o c a t e di nb a k e d sy e a s tt o n o p l a s t i si n c h a r g eo fs e q u e s t r a t i n gh e a v ym e t a li o n sa n dt h e i r sc o m p l e xw i t hb i n d i n gp e p t i d e s i n t ov a c u o l e s t h el i m i t i n gk e ys t e pe n z y m e so fs y n t h e s i so fp c sa n dg s ha r e p h y t o c h e l a t i ns y n t h a s ea n d 丫一g l u t a m y l c y s t e i ns y n t h e t a s e e n c o d e db yp c s a n dg s h r e s p e c t i v e l y s m f 2i sam e m b e ro ft h en r a m pf a m i l yo fm e t a lt r a n s p o r tp r o t e i n s i ns a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e s m f 2l o c a t e di n c y t o p l a s m i cm e m b r a n e b o u n d v e s i c l e i sad i v a l e n tm e t a li o nt r a n s p o r t e r a n dp e r h a p sp a r t i c i p a t e s i n t h e c o m p a r t m e n t a t i o no fh e a v ym e t a li o n si ny e a s t c e l l i nt h ep a s tt h o u g hm a n yr e s e a r c h e r si m p r o v e dt h et a r g e tp l a n t sb yt r a n s g e n i c m a n i p u l a t i o nt oo b t a i ne n g i n e e r i n gp l a n t sf o rp h y t o r e m e d i a t i o n a n dl i t t l ea d v a n c e i np r a c t i c ew e r eg o t w ea t t e m p t e dt ot r a n s f o r ms e v e r a lg e n e si n t oa r a b i d o p s i s t h a l i a n a w h i c ha r er e l a t e dt h ep r o c e s so fc e l l u l a rm e c h a n i s md e t o x i c a t i n gh e a v y m e t a l si np l a n ta n d y e a s t i nt h i st h e s i s s i xb i n a r yv e c t o r sc a r r y i n gf o r e i g ng e n e s w e r ec o n s t r u c t e d g s hi y c fi a s p c si g s hi a s p c s1 y c f a s p c s 1a n ds m f 2r e s p e c t i v e l y t h eg e n e ss m f 2 y c fla n dg s h1a r ed e r i v e df r o m s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a es t r a i n 2 8 8 c a n da s p c sl a r ef r o m g a r l i c a l l i u m s a t i v u ml f u r t h e r m o r e t h eh e a v ym e t a lt o l e r a n c ea n da c c u m u l a t i o no fs i n g l ea n d d o u b l eg e n e st r a n s g e n i ca r a b i d o p s i sw e r ee v a l u a t e d t h er e s u l t sa r ea sf o l l o w s 1 i 2 o v e r e x p r e s s i n gg e n e s o fg s h a n da s p c sj s i m u i t 姐e o u s i ym 爿加6 脚括c 蛆d r a m a t i c a l l yh y p e r a c c u m u l a t em o r eh e 哪m e t a l s 跹d h 鲥e m o t o l e r a n c et oh e a v ym e t a l s t r e s s e st h a n w i l dt y p ea n ds i n g l et r a n s g e m c s o v e r e x p r e s s i n gg e n e so fy c f a n d a s p c s s i m u l t a n e o u s l yi n 胁6 螂捃脚 m es i m i l a ra b i l i t yt 0 也e 仃a n s f o r m a n t s o v e r e x p r e s s i n g g s h a n d 么s p c sj s i m u l t a n e o u s l ye x p o s e d t os e v e r a lh e a v ym e t a l s 3 t h eo v e 哗s s i o no f s m f 2i na r a b i d o p s i su n d e r 铆o e n h a n c e r s p r o m 嘶o n sw 弱阳髓衄e di n o r d e rt oe x p l o r ew h e t h e rt h ev e s i c l e s t r a n s p 嘣 p a n i c i p a t ei n 出ed e t o x i c a t i o no fh e a v y m e t a l si nc y t o p l a s m t h er e s u n ss h o w s 也a t 4 阳6 舶声括o v e r e x p r e s s i n gs m f 2c a na c c u m u l a t em o r eh e a v y m 纯a l i o n sl nt h e l r c e l l st h a ni nw i l dt y p e s t h o u g ht h e i rr o o te l o n g a t i o na n d s h o o tf r e s hw e l 曲t sh a v e n oo b v i o u sd i 鼢e n c ew i t hw i l dt y p e su n d e rh e a v ym e t a ls t r e s s e s o e x p e f i m e n t s o 肫ri n d i r e c t e v i d e n c et h a tp e r h a p sv e s i c l e st r a n s p o r t i sa n o t h e rp a t h w a y t 0 s e q u e s t r a t eh e a v ym e t a li o n si np l a n t c y t o p l a s m 一 i nc 0 1 1 c l u s i o n m u l t i p l et r a n s f o r m a t i o n s o fg e n e sr e l a t e dt ot h ep r o c e s s o f c h e l a t i o n 仃a n s p o 删o n a n dc o m p a r t r n e n t a t i o n o fh e a v y m e t a l si o n sc a n 蛐a t i c a l l yi n c r e a s et h ea b i l i t yo ft o l e r a n c ea n d a c c u m u l a t i o ni n 坟a n s g e m cp l a n t c e l l s k e yw o r d s h e a v ym e t a l s c a d m i u m a r s e n i c p h y t c h e l a t i ns y n t h a s e 卿 p 卜g s hk s m f 2 i v 缩略词英汉对照 缩略词英汉对照 a m pa m p i e i l l i n a s a r s e n i c b pb a s e p a i r c dc a d m i u m c d n a c o m p l e m e n t a r yd n a c y se y s t e i n e d e p c d i e t h y lp y r o c a r b o n a t e d n a d e o x y r i b o s en u c l e i ca c i d d t n b5 5 d i t h i o b i s 2 e be t h d i u n lb r o m i d e e d t ad i d o d i u me t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t a t e g f p g r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n g s h g l u t a t h i o n e g u s 1 3 g l u c u r o n i d a s e h y gh y g r o m y c i n i p t g i s o p r o p y l b d t h i og a l a c t o s i d e k bk i l o b a s e k a n k a n a m y c i n n p t n o n p r o t e i ns u l t h y d r y l o d o p t i c a ld e n s i t y p c r p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n p c s p h y t o c h e l a t i ns y n t h a s e p c s p h y t o c h e l a t i n s r n a o x y r i b o s en u c l e i ca c i d r t p c r r e v e r s et r a n s c r i p tp c r r p m r e v o l u t i o np e rm i n u t e s d ss o d i u md o d e c y ls u l f a t e 氨苄青霉素 砷 碱基对 镉 互补d n a 半胱氨酸 焦碳酸二乙酯 脱氧核糖核酸 5 5 二硫硝基苯甲酸 溴化乙啶 乙二胺四乙酸 绿色荧光蛋白 谷胱甘肽 p 一葡萄糖苷酸酶 潮霉素 异丙基一1 3 一d 一硫代半乳糖苷 千碱基对 卡那霉素 非蛋白巯基 光密度 聚合酶链式反应 植物络合素合酶 植物络合素 核糖核酸 反转录聚合酶链式反应 每分钟转速 十二烷基磺酸钠 郭江波博士论文 利用多基因转化技术获取重金属超富集植物的研究 t h s t r i s h y d r o x y m e t h y l a m i n o m e t l m a n e 三羟基甲基氨基甲烷 x g a l 5 b r o m o 4 c h l o r o 一3 i n d o l y l p d g a l a c t o s i d e5 一溴 4 一氯一3 吲哚 d d 半乳糖苷 关于学位论文使用授权的说明 本人完全了解中国科学院睦濑7 研究所有关保留 使用学位论文的规定 即 植 物研究所有权保留送交论文的复印件 允许论文被查阅和借阅 学校可以提供目录 检索以及公布论文的全部或部分内容 可以采用影印 缩印或其他复制手段保存论 文 1 学位论文原创性声明 本人郑重声明 所呈交的学位论文 是本人在导师指导下 进行研究 工作所取得的成果 除文中已经注明引用的内容外 本学位论文的研究成 果不包含任何他人创作的 已公开发表或者没有公开发表的作品的内容 对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集体 均已在文中以明 确方式标明 本学位论文原创性声明的法律责任由本人承担 学位论文作者签名 第一章文献综述 第一章文献综述 1 1 重金属的化学和物理特性及其对植物细胞的毒害 1 1 1 重金属的化学和物理特性 金属在自然界中以氧化的形式存在 而且许多金属是地球生态系统的必要 组成成分 金属中密度超过4 5g e r a 3 以上的称为重金属 例如铜 锌 钻 镍 钨 钼 锑 铋 铅 锡 镉 c a d m i u m c d 汞等大概有5 3 种 s c h u t z e n d u b e l e ta 1 2 0 0 2 其中1 7 种重金属在生理状态下是可溶的 可能是生物维持生命需 要的 铁 钼 锰是重要的微量元素 而锌 镍 铜 钒 钴 钨和铬在痕量 水平会对生物产生或高或低的毒害 虽然最近发现镉是一种硅藻的碳酸酐酶的 辅基 l a n ee la 1 2 0 0 5 但人们通常认为镉和砷 汞 银 铅非但不是植物营养 元素 而且还对植物的生长发育有或大或小的毒害作用m i e s1 9 9 9 s c h u t z e n d u b e le ta 1 2 0 0 2 陆地生态系统中的重金属主要来源于大气沉降和环 境中物质的降解 土壤中重金属离子的浓度依赖于岩石的淋溶和大气中金属离 子的沉降 在正常条件下 自然界中重金属的离子浓度一般很低 如c d 在土 壤 空气 水和生物系统中以微量存在 地壳中c d 的平均含量为0 1 5 0 2 0 m g c k g 空气中为0 0 0 2 0 0 5m g m 3 d it o p p ie ta 1 1 9 9 9 由于人类活动 如采 矿 燃烧化石燃料 金属工业 含磷化肥的使用等等 特别是在工业革命之后 导致地球生态系统中的重金属的量急剧增加 m a c k e n z i e1 9 7 9 d it o p p ie ta 1 1 9 9 8 a z i m ie ta 1 2 0 0 3 y a n ge ta 1 2 0 0 5 使得土壤 水体中的重金属含量远远 超过生物所能承受的范围 而且在某些地区严重危害了当地居民的身心健康 吴 燕玉等1 9 8 9 n i e s1 9 9 9 i k ee ta 1 2 0 0 6 土壤中由于重金属离子和有机 无机 土壤复合物及有机质结合 因此游离的和非游离的重金属离子的可移动性是不 同的 土壤类型不同 对金属离子的吸附 解吸附 以及形成复合物的过程有 影响 进而影响金属离子在土壤中的可溶性和可移动性 1 1 2 重金属对植物细胞毒害的机理 重金属对植物的作用 特别是其对植物的毒害作用 依赖于植物根际复杂 的反应 植物根际反应不仅包括土壤和植物之间的交换过程 还包括菌根真菌 郭江波博士论文 利用多基因转化技术获取重金属超富集植物的研究 等根际微生物的活动 只有在植物根尖周围的几毫米范围内重金属离子能够进 入植物根中 然后在植物皮层中通过非质体途径 以其在植物中的浓度梯度为 动力被运送到植物的其他部分或是积累在植物细胞壁中 a r d u i n ie ta l1 9 9 5 最 后金属离子接触细胞膜结构后开始产生毒害作用 重金属离子主要通过两种途 径进入植物细胞 1 浓度梯度提供动力的植物细胞被动吸收 2 耗能的 可诱 导的 底物特异的主动吸收m i e s1 9 9 9 w i l l i a m se ta 1 2 0 0 0 c l e m e n s2 0 0 1 现 在利用酵母功能互补等手段在植物中发现了很多重金属离子跨膜转运相关的转 运蛋白 c l e m e n s2 0 0 1 重金属离子对活细胞产生毒害与其化学特点有关 大多数的重金属是过渡 金属 在生理条件下 由于它们的6 轨道未被完全填充而形成阳离子 有氧细 胞细胞内的生理电位介于一4 2 0 n l v 8 0 0 m v m a t s u u r ae t a l 1 9 7 8 因此重金 属在生理条件下可以分为两大类 氧化还原活性活泼和惰性金属 氧化还原活 性活泼的重金属离子可以和比其氧化还原电位低的生物分子发生氧化反应 例 如f e 2 c u 是细胞内0 2 一产生的催化剂 而且可以通过f e n t o n 反应和0 2 一反 应生成h 2 0 2 和h o 这些自由基分子就会对细胞的膜结构和生物大分子如d n a 产生攻击 使细胞受到伤害 s t o h se ta 1 1 9 9 5 q i a n1 9 9 6 b e c a n ae ta 1 1 9 9 8 因 此 f e 2 和c u 等重金属离子通过自氧化和f e n t o n 反应产生自由基是对活细胞 产生毒害的一条重要途径 某些重金属离子还可以和氧 氮 硫原子强烈结合 使某些生化过程中的酶失活 c d 2 可以和酶蛋白中的半胱氨酸上的毓基结合 打破细胞内的毓基平衡 并使酶的活性下降或消失 进而对活细胞产生毒害作 用 c a n e s ie ta 1 1 9 9 8 c a r o le ta 1 2 0 0 0 重金属还可以通过替换细胞内酶的活性 中心的金属离子使酶钝化进而使细胞死亡 许多酶的活性中心都需要金属离子 辅基的参与才能有功能 二价阳离子如c 0 2 n i 2 z n 2 等可以将核酮糖l 5 一二磷酸羧化酶 力 氧酶的活性中心的m g 替换掉 导致酶的活性丧失 c l i j s t e r s e ta 1 1 9 8 5 v a na s s c h ee ta 1 1 9 8 6 c d 2 还可以将钙调蛋白中的c a 2 十替换调 使 细胞内依赖c a 2 的信号转导途径受到抑止 使细胞内的生理生化反应出现混 乱 最后导致细胞死亡 c h a oe ta l1 9 8 4 r a i n t e a ue ta 1 1 9 8 9 g u p t ae ta l1 9 9 0 k a n e k oe ta 1 2 0 0 6 综上所述 重金属离子主要是通过三条途径对植物细胞产生毒害 1 通过 自氧化和f e n t o n 反应产生氧自由基分子 2 阻断生物大分子中必需的酶活性中 心 3 替代生物大分子中必需的金属离子 2 第一章文献综述 1 1 3 重金属离子在植物中的分布 一般情况下 重金属在植物植物组织 器官内中的分布是 根 叶 茎 花 果 籽粒 但超富集植物 h y p e r a c c u m u l a t o r s 是一类能够在地上部分富 集重金属的植物 b a k e re ta 1 2 0 0 2 现在已经报道有大约4 5 种 f r e e m a ne ta 1 2 0 0 4 l i u 及其同事通过电子能量损失谱 e l e c t r o ne n e r g yl o s ss p e c t r o s c o p y e e l s 和电子能量损失谱成像技术 e l e c t r o ns p e c t r o s c o p i ci m a g i n g e s i 研究洋 葱 a l l i u mc e p a 发现 在l o o 山v ic r n i 处理条件下 这两种重金属主要分布在 植物细胞的细胞壁和液泡q b l i ue ta 1 2 0 0 3 f r i t i o f f 等人 f r i t i o f f e ta 2 0 0 6 在 研究水生植物浮叶眼子菜 p n a t a n s 的不同组织对z n c u c d 和p b 的吸收和 转运发现 大约2 4 到5 9 的重金属结合在植物细胞壁上 而且发现除p b 外 其他金属在茎杆细胞细胞壁的积累要低于在叶肉细胞细胞壁中的积累 除c d 以外 研究人员没有观察到其他的重金属离子在不同的植物组织之间迁移 其 他的研究者 v a r g ae ta 1 2 0 0 2 利用全反射x 射线荧光光谱法 t o t a lr e f l e c t i o n x r a yf l u o r e s c e n c es p e c t r o m e t r y 研究c d n i p b 和f e 在黄瓜根 叶的细胞质和 细胞壁中的分布发现 在根中绝大部分p b 分布在细胞壁中 而c d 和n i 主要 分布在细胞质中 在叶中 约5 0 6 0 的p b 和几乎全部的c d 分布在细胞质中 约3 0 4 0 的己迁移的n i 残留在叶的细胞壁中 显然 不同重金属的吸收和 转运 以及在植物组织 细胞内的分布与植物耐受和积累该重金属的机制有关 1 2 植物耐受 积累重金属的机制 植物虽然不能像动物那样迁移避开对自己不利的环境 但是它们还是在千 百万年的进化过程中发展出很多适应环境变化的机制来应对生存条件的改变 在整体植株水平和细胞水平上 不同植物耐受不同重金属胁迫的方式不尽相同 根据现有的文献资料 植物耐受重金属的机制可以分为细胞质耐受机制和细胞 质膜及细胞壁外排机锘1 t a y l o r1 9 9 1 k o c h i a n1 9 9 5 外排机制可以阻止重金属 离子进入细胞质中 典型的作用方式就是将金属离子沉降在植物细胞壁中 例 如火山叶藓 j u n g e r m a n n i av u l c a n i c o l a 就可以将h g 沉淀在细胞壁中固定 s a t a k e e ta 1 1 9 9 0 洋葱可以将p b 沉淀在细胞壁上降低其对自身的毒害 w i e r z b i c k a 1 9 9 8 植物还可以分泌有机酸 如草酸 苹果酸 柠檬酸络合重金属以后将其 排出细胞质膜外 降低细胞对这些重金离子的吸收 p e l l e te ta 1 1 9 9 5 g y a ne ta l 3 郭江波博士论文 利用多基因转化技术获取重金属超富集植物的研究 1 9 9 5 m ae la 1 1 9 9 8 z h e n ge la 1 9 9 8 植物细胞质耐受重金属胁迫的机制建立在植物细胞络合 c h e l a t i o n 区隔 化 c o m p a r t m e n t a t i o n 重金属离子的能力之上 而且植物能够超富集重金属 是以植物细胞能够耐受重金属胁迫为前提的 虽然植物耐受和超富集重金属是 植物两个独立的特征 植物细胞内有很多小肽能够络合重金属离子 其中比较 重要的就是谷胱苷肽 g l u t a t h i o n e g s h 和植物络合素 p h y t o c h e l a t i n s p c s 重 金属离子被小肽络合后就会被转运到植物细胞的液泡中与细胞内的膜系统隔 离 这一过程就是区隔化 c o m p a r t m e n t a t i o n 植物受到重金属毒害以后 植 物的抗氧化酶系 a n t i o x i d a t i v es y s t e m 可以立即做出应答 因此植物的抗氧化酶 系在植物耐受重金属胁迫中有重要的作用 1 2 1 植物细胞内络合重金属的小肽 1 2 1 1 谷胱苷肽 g l u t a t h i o n e g s h 植物细胞内有数量众多的游离的 低分子量的巯基 一般情况下 这些巯 基得主要构成成份是g s h g s h y g l u c y s g l y 是一种细胞保护剂和信号分 子 也是植物细胞中的主要的非蛋白还原硫的储存形式 n o c t o r e l a 1 9 9 8 g s h 的保护作用主要体现在三个方面 1 还原型的g s h 是一个关键的抗氧化物 2 g s h 可以在谷胱苷肽 s 转移酶的作用下与其他分子发生亲电结合反应使进入 细胞的外源异生物脱毒 m a r r s1 9 9 6 e d w a r d se ta 1 2 0 0 0 f o y e re ta 1 2 0 0 5 3 g s h 还可以和重金属离子络合使这些离子能够更容易被转运到植物细胞的液 泡内隔离以降低它们对细胞膜系统的损伤 z e n k1 9 9 6 s c h a f e re ta 1 1 9 9 7 s i r i p o m a d u l s i le la 1 2 0 0 2 b o v e te la 2 0 0 5 拟南芥突变体r m l l 缺失了g s h 合 成途径中的第一个关键酶基因根部细胞不能正常分裂 原因在于细胞由g 1 期 转向s 期需要g s h 的参与 v e r n o u xe la 1 2 0 0 0 因此g s h 是植物细胞正常发 育必需的 o g a w a2 0 0 5 1 g s h 的合成及调控 植物 动物和微生物中谷胱苷肽的合成都是由依赖a t p 的y 谷氨酰氨半 胱氨酸合成酶 y e c s 谷胱苷肽合成酶 g s a s e 催化反应完成的 见图1 1 g s h 中连接谷氨酸和半胱氨酸的n 端肽键是通过y 位而非q 位的羧基 植物中 y e c s 和g s a s e 的活性很低 它们的两步催化反应可以发生在叶绿体和非叶绿 体的细胞区间 而且在光合和非光合组织中都存在 f o y e re la 2 0 0 1 曲 y e c s 4 第一章文献综述 的编码基因g s h 最早是从拟南芥中利用大肠杆菌突变体功能互补克隆f 1 0 m a y e ta 1 1 9 9 4 但是将该基因在酵母突变体中异源表达只恢复了野生型酵母l o 的g s h 水平 进一步的功能互补实验证实这个蛋白具有y e c s 的活性 m a ye t a 1 1 9 9 8 a 同样利用大肠杆菌突变体功能互补实验 r a w l i n s 等从拟南芥中克 隆了编码g s a s e 的基因g s hi i r a w l i n se ta 1 1 9 9 5 依据g s h 合成酶系在豆科 植物根瘤中的分布 有的学者推测y e c s 主要分布在质体中 g s a s e 在细胞 质和线粒体中都有分布 b e c a n a e ta 1 2 0 0 0 对动物细胞 特别是癌细胞的研究发现 蛋白因子和编码序列上游保守的 抗氧化反应元件可以调控y e c s 的转录 f o y e r e ta 1 2 0 0 1 a 相对来说 现在对 g s hi 和g s h 刀协同表达的调控了解很少 虽然现在已经清楚g s h g s s g 和 h 2 0 2 对转录本质上的影响微乎其微 x i a a g e ta 1 1 9 9 8 c d 2 能够诱导印度芥菜 b r a s s i c a u n c e a 中g s hi 和g s h 肼专录本丰度增加 s c h a f e re t a l 1 9 9 8 拟南 芥中g s hi ng s h1 1 转录也可以受c d 2 和c u 2 诱 导 x i a n ge ta 1 1 9 9 8 茉莉酸 j a s m o n i ca c i d j a 可以调控g s hi 和g s h 口转录本丰度 说明j a 与重金属 离子对g s hi 和g s h 口转录调控的信号转导途径可能相似 x i a n ge la 1 1 9 9 8 虽 然j a 和重金属离子可以调控转录 但是蛋白质的翻译却受氧化胁迫的调控 暗示可能存在转录后水平的调控 而且h 2 0 2 和g s h g s s g 比例影响m r n a 翻 译的去抑止化作用 g s h 基因5 非转录区 5 u t r 可以与抑止因子结合蛋 白作用 外加h 2 0 2 或改变细胞内g s h g s s g 比例可以释放该蛋白 这暗示存 在一个可以与5 u t r 结合的氧化还原作用敏感的复合体调控y e c sm r n a 翻 译 n o c t o re ta 1 2 0 0 2 在植物和动物细胞中 产物抑止是y e c s 转录后调控最重要的因素 y e c s 是g s h 合成的限速酶 而并非g s a s e 将g s a s e 编码基因g s h 口在植物细 胞质 叶绿体中超表达 虽然能够检测到g s a s e 酶活性增加 但都不能提高转基 因植物叶片中g s h 浓度 外加y e c 后 这些转基因植物叶片中g s h 浓度显 著增n s t r o h me ta 1 1 9 9 5 而g e c s 编码基因g s h 转化植物就可以大幅度提 高植物细胞内g s h 浓度 n o c t o re ta 1 1 9 9 6 2 g s h 代谢的细胞内区隔化 5 郭江波博士论文 利用多基因转化技术获取重金属超富集植物的研究 吲 图i1 植物细胞内o s h 合成 利用及降解 0 1 自f o y e r e l a l2 0 0 1 b g s h 是由定位在细胞质和叶绿体中的v 一备鲺酰氪半胱氯酸合成酶 y e c s 和符胱苷肚合成酶 g s a s e 的 构体催化合成的 研究裘蜊 并非所有的植物细胞具有相同的g s h 台成容最 因此需要本地和系统 整株 转运g s h 做为一种抗氧化荆 还原型g s h 会被氧化为氧化 型g s h g s s g 但是在g s h 库中贮存的主要是还原璀的g s h 这可 能是由于在细胞质 线粒体和叶绿体中部有g s h 还原酶 g r 存在的 原冈 虽然植物中g s h 降解厘结合反应还未完金阐明 但有三种可能 的途径 1 在液泡c p a s e 作用下去处g s h 或g s x 上的g l y 2 r q s t m e 催化的转肚反应 将g s h 上的g l u 转移到其他 肽上参加谷氨酰氨循 环 浚逢衽还未在植物中发现 3 r g t a s e 催化的转肚反应的产物 c y s g l y 在d p a s e 催化下分解进入氪基酸代谢 不同细胞 不同组织中g s h 浓度是g s h 合成 降解 使用和转运问平衡 的结果 不同细胞器间g s h 浓度和氧化还原态的差异可能在信号转导中起关键 6 第一章文献综述 作用 早在2 0 世纪7 0 年代 研究者就知道菠菜叶绿体中的g s h 浓度很高 而 且光合自养烟草可以比异养的更快往培养基中转运g s h n o c t o re ta 2 0 0 2 后来的研究证实g s h 在叶肉细胞叶绿体和细胞质中合成后转运到韧皮部中 h e r s c h b a c he ta 1 2 0 0 0 最近免疫细胞化学研究揭示 拟南芥y e c s 蛋白定位 在叶绿体中 而g s a s e 蛋白在叶绿体和细胞质中都有分布 w a c h t e r e ta 1 2 0 0 5 因此g s h 的合成是在不同的细胞器见完成的 这可能为细胞内氧化还原信号转 导提供了一个平台 植物和动物降解g s h g s x 的途径可能不一样 在动物细胞中 g s h 和 g s x 的降解是由y 谷氨酰氨转肽酶 y g p a s e 催化完成的 这个酶可以催化 g s h g s x 和g s s gn 端氨基键水解 并把水解下来的谷氨酸残基转到新的 受体分子 如其他氨基酸上 见图1 1 而半胱氨酸和甘氨酸二肽接着会被细 胞外二肽酶水解 虽然有报道证实植物细胞膜表面有二肽酶存在 但是迄今为 止该降解过程在植物细胞中还没有直接证据 植物中存在一种液泡羧基肽酶可 以将g s h 或g s x 上的g l y 去掉 开始g s h 和g s x 降解的第一步 w o l f e t a 1 9 9 6 g s h 在不同的细胞器中合成 降解 有效的转运系统是必需的 是维持细 胞内高还原势和氧化还原平衡缓冲液的必要条件 3 g s h 稳态 h o m e o s t a s i s 浓度与氧化还原态 r e d o xs t a t e 氧化还原 稳态 r e d o xh o m e o s t a s i s 的关系 动物细胞内有严格的稳态 h o m e o s t a s i s 概念 但在植物细胞不能完全与 外界多变的环境隔绝 因此相对动物细胞而言植物细胞的稳态更有弹性和冗余 g s h 库有两个明显的特征 即g s h 浓度和氧化还原态 植物叶中g s h 浓度有 季节 日波动 受植物营养 特别是硫的可用性影响很大 早期的证据表明 韧皮部硫与g s h 的比例是调节g s h 稳态的关键 g s h 在叶片中合成以后被转 运到韧皮部并对根中硫吸收产生调节 h e r s c h b a c he ta 1 2 0 0 0 相对于g s h 浓度 而言 g s h 库的氧化还原态的稳态作为维持细胞内氧化还原平衡的一部分 受 到更严格的控制 至少在叶片细胞中 除了受到相对持续的胁迫使得叶细胞 g s h 库还原态下降超过9 0 外 g s h 氧化还原态是明显不变的 高还原g s h 库的中心地位对光合代谢非常重要 以致细胞可以感受到高还原态的变化而启 动适应性变化的基因表达 植物细胞为了维持细胞质内的高还原巯基 需要浓 度达到m m 数量级的g s h 库 因此g s h 浓度是维持g s h 库的氧化还原态的 7 郭江波博士论文 利用多基因转化技术获取重金属超富集植物的研究 前提 植物细胞中其他的抗氧化物质 如抗坏血酸 维生素e 等在维持细胞氧 化还原稳态中起着非常重要的作用 f o y e re ta 1 2 0 0 5 4 g s h 与信号转导 g s h g s s g 在指示细胞内巯基平衡 对细胞代谢和基因表达产生影响的作 用研究的比较透彻 g s h g s s g 调节基因表达的作用可能是别的还原性化合物 不能替代的 或是已报道的影响可能反映的是细胞氧化还原态变化的共同特征 而这些影响在真核和原核生物中都可以调节基因的表达 g s h 库是植物细胞一 个重要的氧化还原组件 内源g s h 变化可以对细胞产生重要的后果 例如外源 施加g s h 可以改变烟草和松树细胞内细胞质c u z n 超氧化物歧化酶 s o d h e r o u a r te t 以1 9 9 3 和g r 的基因表达 w i n g s l ee ta 1 9 9 6 g r 基因可能有一 个结合g s s g 的位点 g s s g 可以调控g r 基因的表达 c r e i s s e ne ta 1 1 9 9 2 g s s g 还是参与细胞内蛋白巯基化的重要物质 巯基化可能是植物种子发育过 程中一个重要的现象 干种子比其他的组织含有更高浓度的氧化型g s h b u t te t a 1 1 9 9 1 t o m m a s ie ta 1 2 0 0 1 干种子中蛋白的巯基化有三个功能 1 如果蛋白 关键的c y s 残基被氧化 这个蛋白就会被降解 而巯基化可以保护g s h 和蛋 白被降解 2 可以通过与蛋白的c y s 残基相互作用影响蛋白的功能 3 可能与 细胞分裂静止期g o 的信号转导有关 g s h 还参与植物细胞分裂的调控 m a y e ta 1 1 9 9 8 a 是细胞进入g l 期的必 要条件 g 1 期是细胞周期的有丝分裂前期 在这一时期细胞能够感知外界刺激 从而决定细胞是进入s 期还是进入休止期 也就是细胞是参与分化还是进入程 序化死亡 5 g s h 与重金属胁迫 植物细胞中区隔化重金属离子的主要途径与富含半胱氨酸的小肽即植物络 合素 p c s 的形成有关 在生物细胞中p c s 合成的前体是g s h g r i l le ta 1 1 9 8 9 c d 2 胁迫可以诱导培养的细胞和植物根中的g s h 耗竭 r a u s e re ta 1 1 9 9 1 d e v o se ta 1 1 9 9 2 r u e g s e g g e re ta 1 1 9 9 2 而且在培养基中添加能特异抑止y e c s 酶活性的抑止剂b s o b u t h i o n i n es u l p h o x i m i n e 可以抑止细胞中p c s 合成 g r i l l e t a l 1 9 8 7 在培养的番茄细胞中提高y e c s 酶活性可以相应的提高对c d 2 的 抗性 c h e ne ta 1 1 9 9 4 反之就降低植物细胞对c d 2 的抗性 x i a n ge ta 1 2 0 0 1 1 2 1 2 植物络合素 p h y t o c h e l a t i n s p c s 8 第一章文献综述 1 植物络合素的结构及功能 植物络合素通常由三种氨基酸组成 g l u c y s g l y 其一级结构通常是 由重复的y g l u c y s 结构加上一个末端的g l y 组成 y g l u c y s n g l y n 一 般介于2 到5 最高可达到1 1 p c s 最早在蛇根木中发现 g r i l l1 9 8