发育生物学实验教案.doc

发育生物学实验教案实验一 植物生长调节剂对果实发育的影响一、实验目的1. 了解2,4-D、萘乙酸对无籽果实形成的诱导作用。2. 了解乙烯对果实的催熟作用。二、实验原理植物生长调节剂2,4-D、萘乙酸（NAA）等，在适当的浓度下能诱导无籽果实形成。适当浓度的乙烯利能促进果实成熟。三、试剂与材料1. 实验试剂20mg/L2,4-D（用少许1 mmol/L NaOH溶解2,4-D，再用蒸馏水定容），500mg/L NAA（用热水或少量95%乙醇溶解NAA，再用蒸馏水定容），40%乙烯利2. 实验材料盆栽番茄、辣椒幼苗，香蕉（或大蕉、柿子、芒果等）四、实验步骤1. 无籽果实的诱导形成（1）2,4-D诱导无籽果实 在番茄开花授粉前用2-3滴20mg/L 2,4-D溶液涂在花上，以水处理作对照。果实成熟时，观察果实内籽粒的有无。（2）NAA诱导无籽果实在辣椒开花初期，用2-3滴500mg/L NAA溶液滴在花朵上（或喷花），以水处理作对照。果实成熟时，检查是否有籽。2. 乙烯利对果实的催熟作用将采收后的香蕉（或大蕉、柿子、芒果等）用500mg/L乙烯利溶液浸泡5s，以蒸馏水浸泡作对照，取出果实分别放在箩筐或纸箱内，室温保存。5-10d之内，观察结果。比较果皮的颜色和果实的成熟度五、注意事项1. 用植物生长调节剂处理材料的时期一定要把握好。2. 可尝试使用不同的激素浓度，筛选出激素的最适作用浓度。六、实验作业拍照记录实验结果（包括对照）并进行分析。实验二 人工诱发多倍体植物一、实验目的1. 了解人工诱发多倍体植物的原理、方法及其在植物育种上的意义。2. 观察多倍体植物，鉴别植物染色体数目的变化及引起植物其它器官的变异。二、实验原理自然界各种生物的染色体数目是相当恒定的，这是物种的重要特征。例如玉米体细胞染色体有20个，配成10对。遗传学上把一个配子的染色体数，称为染色体组（或称基因组）用）用n表示。如玉米染色体组内包含10个染色体，它的基数n=10。一个染色体组内每个染色体的形态和功能各不相同，但又互相协调，共同控制生物的生长和发育、遗传和变异。由于各种生物的来源不同，细胞核内可能具有一个或一个以上的染色体组，凡是细胞核中含有一套完整染色体组的就叫做单倍体，也用n表示。具有两套染色体纽的生物体称为二倍体，以2n表示。细胞内多于两套染色体组的生物体称为多倍体。例如三倍体（3n），四倍体（4n）、六倍体（6n）等，这类染色体数的变化是以染色体组为单位的增减，所以称作整倍体。在整倍体中，又可按染色体组的来源，区分为同源多倍体和异源多倍体。凡增加的染色体组来自问物种或者是原来的染色体组加倍的结果，称为同源多倍体。如果增加的染色体组来自不同的物种，则称为异源多倍体。多倍体普遍存在于植物界，目前已知道被子植物中有1/3或更多的物种是多倍体，如小麦属（Triticum）染色体基数是7，属二倍体的有一粒小麦，四倍体的有二粒小麦，六倍体的有普通小麦。除了自然界存在的多倍体物种之外，又可采用高温、低温、X射线照射、嫁接和切断等物理方法人工诱发多倍体植物。在诱发多倍体方法中，以应用化学药剂更为有效。如秋水仙素、萘嵌戊烷、异生长素、富民农等，都可诱发多倍体，其中以秋水仙素效果最好，使用最为广泛。秋水仙素是由百合科植物秋种番红花秋水仙（Colchicum autumnale）的种子及器官中提炼出来的一种生物碱。化学分子式为C22H25NO6+1.5H20。具有麻醉作用，对植物种子、幼芽、花蕾、花粉、嫩枝等可产生诱变作用。它的主要作用是抑制细胞分裂时纺锤体的形成，使染色体不走向两极而被阻止在分裂中期，这样细胞不能继续分裂，从而产生染色体数目加倍的核。若染色体加倍的细胞继续分裂，就形成多倍性的组织，由多倍性组织分化产生的性细胞，所产生的配子是多倍性的，因而也可通过有性繁殖方法把多倍体繁殖下去。多倍体己成功地应用于植物育种，用人工方法诱导的多倍体，可以得到一般二倍体所没有的优良经济性状，如粒大，穗长、抗病性强等。三倍体西瓜、三倍体甜菜，八倍体小黑麦已在生产上应用。三、试剂与材料1. 实验试剂0.1%和0.025%秋水仙素溶液，1mol/L HCl溶液，改良石碳酸品红溶液，碘化钾溶液2. 实验材料玉米（2n=20），或大麦（2n=18），水稻（2n=24）的种子人工诱发的四倍体玉米和二倍体玉米叶片四、实验步骤1. 把玉米2n=20种子浸在0.1%秋水仙素溶液中24小时。2. 用自来水冲洗2-3次。3. 将萌发种子移到盛有0.025%秋水仙素溶液润湿了吸水纸的培养皿里。4. 置入20培养箱，培养发芽。5. 48小时后取出幼苗。6. 用自来水缓缓冲洗幼苗。7. 把处理后的幼苗栽种在大田或盆钵内。8. 同期播种未经处理的玉米种子作为对照。9. 田间给以良好管理。 10. 鉴定多倍体植物（1）制作四倍体玉米、二倍体玉米根尖细胞压片，检查染色体数目。（2）观察四倍体玉米、二倍体玉米表皮细胞气孔的大小。 在四倍体玉米叶的背面中部划一切口，用尖头镊子夹住切口部分，撕下一薄层下表皮，放在载玻片的水滴里，铺平，盖上盖玻片，制成表皮装片。 按上述同样方法制作张二倍体玉米的表皮装片，作为对照。 镜检比较四倍体与二倍体气孔和保卫细胞的大小，微尺测量记载其大小。五、实验作业1. 描绘四倍体玉米中期染色体图。（注意染色体数目的变化）2. 将镜检观察结果（20个）列成一表，并分析记载结果。实验三 花粉活力的测定实验目的熟悉测定花粉活力的几种方法。通过花粉活力的测定，可以了解花粉的可育性，并掌握不育花粉的形态、生理特征。I I-KI染色测定法实验原理禾谷类植物花粉成熟时积累淀粉较多，通常可用I-KI染成蓝色。发育不良的花粉常呈畸形，不积累淀粉，用I-KI染色，不呈蓝色，而呈黄褐色。试剂与材料1. 实验试剂I-KI溶液2. 实验材料充分成熟将要开花的花朵实验步骤1. 取充分成熟将要开花的花朵。2. 取一花药置载玻片上，加1滴蒸馏水，用镊子充分捣碎后，再加1-2滴I-KI溶液，盖上盖玻片，置低倍镜下观察。II 过氧化物酶测定法实验原理具有生活力的花粉含有活跃的过氧化物酶。此酶能利用过氧化氢使各种多酚及芳香族胺发生氧化而产生颜色，依据颜色可知花粉的活性强弱。过氧化物酶H2O2 H2O + O联苯胺 2-萘酚 2 O 对二萘氧基联苯胺（紫红色） 2 H2O试剂与材料1. 实验试剂0.5%联苯胺，0.5%-萘酚，0.25%碳酸钠，实验前将上述三种溶液各取10mL混合均匀成试剂I，0.3%过氧化氢2. 实验材料花粉实验步骤1. 在干洁载玻片上放少量花粉，然后加试剂I和0.3%过氧化氢各1滴，搅匀后盖上盖玻片。30下经10min后在低倍显微镜下观察。如花粉粒为红色，则表示有过氧化物酶存在，花粉有活力，能发芽；如无色或黄色，则表示已失去活力，不能发芽。2. 观察2-3个制片，每片取5个视野，统计100粒，并计算其发芽率。III 氯化三苯基四氮唑法(TTC法)实验原理凡是有生命活力的花粉，在呼吸作用过程中都有氧化还原反应，而无生命活力的花粉则无此反应。当TTC渗入花粉的活细胞内，并作为氢受体被脱氢辅酶（NADH2或NADPH2）上的氢还原时，便由无色TTC变为红色的TTF。2HTTCCl TTF （红色） HCl试剂与材料1. 实验试剂0.5%TTC溶液2. 实验材料花粉实验步骤1. 取少数花粉于载玻片上，加1-2滴TTC溶液，盖上盖玻片。2. 将制片于35恒温箱中放置15min，然后置于低倍镜下观察。凡被染为红色的活力强，淡红的次之，无色者为没有活力的花粉或不育花粉。3. 观察2-3个制片，每片取5个视野，统计100粒，然后计算花粉的活力百分率。注意事项需将花粉完全浸于药液之中。实验作业试比较3种方法，同一花粉的发芽率是否相同，分析其原因。实验四 花粉管生长的测定一、实验目的熟悉测定花粉管生长的方法及影响生长的主要因素。二、实验原理成熟花粉具有较强的生活力，在适宜的培养条件下便能萌发和生长。花粉的萌发和生长情况与植物种类、花粉成熟度、气候和培养条件等有关。实验中通过改变培养条件，利用正交实验法测定花粉管长度，可以找出促进花粉管生长的最佳培养条件。三、试剂与材料1. 实验试剂培养基（内含琼脂0.5%，硼酸、蔗糖浓度按表2-1进行）附 培养基的配制在配制培养基时，琼脂浓度不变，硼酸、蔗糖的浓度改变，pH和培养温度也改变，用以观察何种组合更适于花粉萌发和生长。若培养基不是当天使用，则需要高压灭菌。（1） 确定硼酸、蔗糖、温度、pH 4种因子的水平值。实验中对每种因子选择低、中、高3种水平（以l，2，3表示，见表2-1）。（2） 按表2-2配制培养基。表2-1 因子水平表因子水平A蔗糖含量/ %B硼酸浓度/ （g/mL）C温度/ DpH123510151025502328336.06.57.0表2-2 培养基配制方案实验组号A蔗糖含量/ %B硼酸浓度/ （g/mL）C温度/ DpH1234567895（1）5（1）5（1）10（2）10（2）10（2）15（3）15（3）15（3）10（1）25（2）50（3）10（1）25（2）50（3）10（1）25（2）50（3）23（1）28（2）33（3）28（2）33（3）23（1）33（3）23（1）28（2）6.0（1）6.5（2）7.0（3）7.0（3）6.0（1）6.5（2）6.5（2）7.0（3）6.0（1）注：括号内数字表示因子水平2. 实验材料刚开放或将要开放的成熟花朵四、实验步骤1. 采取刚开放或将要开放的成熟花朵（取自丝瓜、南瓜、烟草、风仙花、金莲、白花三叶草及葫芦科的其他植物。酷热天气中午前后不能采，最好现采现用）。2. 制备培养小室在干洁的载玻片上放一只直径15mm，高5mm的玻璃环，环口需用金刚砂磨平，外面涂少许凡士林（或石蜡）使之固定和防止水分蒸发，环内放2滴水。3. 在干洁盖玻片中央滴1滴培养基溶液，然后将花粉粒少许散放于培养基上。4. 将盖玻片放于培养室的玻璃环口上，有花粉粒的一面朝下（必要时在玻璃环口上涂少许凡士林，以防水分蒸发和盖玻片移动）。5. 在培养45-60min后，即用0.1 mol/L NaOH（含0.4mol/L蔗糖）终止生长，置于低倍显微镜下观测，并用测微尺计算花粉管长度。每种处理观测50个花粉管长度，然后求其平均值，将结果记入表2-3，并进行统计分析。表2-3 实验结果与统计分析实验组号ABCD结果蔗糖因子水平硼酸因子水平温度因子水平pH因子水平50粒花粉管的平均长度/（m/粒）123456789IIIIIIR111222333123123123123231312123312231IIII：指因子水平13的三组实验结果的平均值，反映同一因子各水平的作用大小。R：级差，指平均值最高与最低之间的差值，反映因子的重要性，级差越大越重要。五、注意事项花粉应均匀地散于培养基上，以免影响以后观察。六、实验作业1. 从结果统计分析中找出适于花粉萌发和生长的最优组合。2. 从级差分析结果中判断各因子的重要性。实验五 两栖类变态过程的观察一、实验目的了解两栖类动物变态过程中的形态变化。二、实验原理在多种动物中，胚胎发育经历一个幼虫期，幼虫具有与成体非常不同的特点，在发育中其形态和构造经历明显的阶段性变化，其中有一些器官退化消失，有些得到改造，有些新生出来，从而结束幼虫期，建成成体结构，这种现象统称为变态。三、试剂与材料1. 实验试剂何尔夫列他溶液（氧化钠0.35g，氯化钾0.005g，二氯化钙0.01g，碳酸氢钠0.02g，蒸馏水100mL）2. 实验材料蛙的蝌蚪四、实验步骤人工饲养青蛙，观察其变态过程中的形态变化。五、实验作业记录蛙变态过程中的形态学变化。 附 蛙的饲养方法卵和蝌蚪的培养最好用洁净的自来水，并加上稀释5-6倍的何尔夫列他液（氧化钠0.35g，氯化钾0.005g，二氯化钙0.01g，碳酸氢钠0.02g，蒸馏水100mL），这样可以增加胚胎和蝌蚪发育所必需的钠、钙、钾离子。培养水要多而清洁，否则会因缺氧而致死。蝌蚪主要吃植物性饲料，如水藻等。煮过的菠菜和莴苣是最适宜的食物，但投喂时不宜煮得太熟，并注意除去纤维。初次投食量要小，以后可不断增加。每天定时定量投喂，不宜过多，以防残渣腐败，造成水体污染。若用缸、盆培养，或水体较小，一般3-5d换一次水较好。当蝌蚪发育成带有短尾的幼体开始用肺呼吸时，若用池塘培养，水中必须放些水草，或小木条，以供其登陆用。若为缸、盆培养，水里可放一些泡沫塑料。成体主要吃昆虫之类的动物性食物，以直翅目、鞘翅目、膜翅目、蜻蜓目为最多，其次为双翅目、脉翅目、半翅目等昆虫。有时也食蛛形动物、蚯蚓，甚至也以谷粒、鱼苗或蝌蚪及小蛙为食。实验六 精子形态观察及体外获能实验一、实验目的1. 熟悉哺乳类精子的形态结构。2. 了解精子体外获能的方法。二、实验原理哺乳动物的精子离开精巢后并没有受精能力，必须要经过成熟和获能才能使卵子受精。精子在附睾中成熟。成熟过程中，在附睾中多种物质的作用下，精子质膜的脂类、糖蛋白、唾液酸、吸收抗原、表面ATP酶等许多成分发生变化，负电荷增加，与凝集素的结合力也发生改变。精子射出后，经阴道和子宫到达输卵管，在壶腹部与卵子结合，完成受精。张明觉、Austin 1951年发现兔子和大白鼠直接排出的精子不能使卵受精，必须在生殖道中停留一段时间后才具备受精能力，这一现象称为精子的获能。后来研究发现，精子在体外也能完成获能，卵泡液、输卵管分泌物、血清、房水等多种液体都可使精子获能，pH、Ca2+浓度等环境条件对获能也有影响。精子在获能过程中发生一系列的形态及生理生化的变化，呼吸明显加强，运动形态和速度也发生很大变化，由直线前进变为曲线运动。体外获能一般分为两步：一是精子的洗涤，经1次或多次离心后除去杂质、死精子、低活力精子、冻精保护液及稀释液等；二是精子的获能处理，主要是使用高离子强度液（His）、钙离子载体、肝素等，以促进钙离子进入精子顶体并刺激精子内部pH升高，从而诱发精子获能。三、试剂与材料1. 实验试剂IVF液（NaCl 5.803g/L，KCl 0.201g/L，NaHCO3 2.106g/L，CaCl22H2O 0.264g/L，丙酮酸钠0.055g/L，60%乳酸钠3.5mL，葡萄糖1.000g/L，青霉素G钾或钠盐0.063g/L，硫酸链霉素0.050g/L，酚红0.010g/L，Na2HPO412H2O 0.056g/L，MgCl26H2O 0.102g/L），牛血清白蛋白（BSA）2. 实验材料雄性小鼠四、实验步骤1. 断颈处死雄性小鼠。2. 打开腹腔，剪取附睾尾（尽可能除去脂肪），将每个附睾尾放入已在37、5%CO2培养箱预平衡2h的2ml IVF液（加30mg/ml BSA）中。3. 将附睾尾剪成几段，用镊子轻轻挤压之，使精子挤入培养液中，去掉附睾尾。4. 吸打均匀后，1800 r/min离心5min，弃上清，以2ml IVF液重悬。5. 将精子在37、5%CO2培养箱中培养1.5h，使之获能。6. 镜检，观察获能精子的运动。五、实验作业观察比较精子在获能前后运动形态和速度的变化。实验七、八 鸟类胚胎发育的观察一、实验目的熟悉鸟类胚胎发育的过程。二、实验原理鸟类胚胎发育是典型的体外发育，利用人工孵化的家禽，可以方便观察其发育过程。鸡胚胎发育可分为两个阶段：成蛋阶段和成雏阶段。（1）胚胎在卵形成过程中的发育即母体内的发育，也即是成蛋阶段的发育。这个阶段的发育过程是，受精卵+卵裂+囊胚期+原肠期。当胚胎发育到原肠期时，已分化形成上胚层和下胚层，从外观上看形如一个圆盘状体即为胚盘，当卵排出体外，因温度下降，胚胎生长发育随即停止。（2）胚胎在孵化过程中的发育卵排出体外后，保存在18以下的环境中，胚胎发育基本处于静止状态。当人孵后，胚胎即开始发育。胚胎在孵化过程中发育的时期称孵化期。鸡的孵化期为21天。种蛋人孵后，胚胎在原肠期形成的同时，上胚层像个碟状圆盘，在其末端，细胞不断地向中线集中，形成一条细胞带，称原条。原条细胞通过原沟的底部逐渐转人上胚层与下胚层之间，并分别向两侧扩展，这些迁移至上下胚层之间的细胞称为中胚层。原条细胞也逐渐转人上胚层与内胚层之间，并分别向前伸展，伸展的结构称为头突，后发育成脊索。脊索是胚胎期的纵轴支持器官，最终为脊柱所代替，随着胚胎的不断发育，由外、中、内三个胚层逐渐形成各种腺体、器官、骨骼、肌肉、皮肤、羽毛和喙，最后形成新的机体雏鸡。三、试剂与材料鸡的种蛋四、实验步骤1. 观察比较种蛋（受精）与非种蛋（未受精）内部结构的差异。2. 观看教学片，熟悉鸡的胚胎发育过程。2. 人工孵化种蛋，记录鸡的孵化进程及特征。五、实验作业拍照记录鸡孵化进程中的特征变化。附 1. 鸡胚发育进程及特征1胚龄：蛋黄表面有一颗颜色稍深，四周稍亮的圆点，俗称“鱼眼珠”或白光珠。2胚龄：可看到卵黄囊血管区，其形状很象樱桃形，故俗称为为“樱桃珠”。3胚龄：卵黄囊血管的形状象静止的蚊子，俗称“蚊虫珠”。卵黄颜色稍深的下部似月牙状，俗称“月牙”。4胚龄：蛋转动时，卵黄不易跟随着转动，俗称为“钉壳”。5胚龄：明显看到黑色的眼点，谷称“起珠”、“单珠”、“起眼”（若为5天整，还可见到些羊水）。6胚龄：胚胎形似“电话筒”，一端是头部，另一端为弯增大的躯干部，俗称“双珠”。可以看到羊毛。7胚龄：白茫茫的羊水增多，胚胎活动尚不强，胚胎在羊水中不易看清，似沉在羊水中，俗称“沉”。正面已布满扩大的卵黄和血管。8胚龄：胚胎较易看到，象在羊水中浮游一样，俗称“浮”。从背面看，卵黄已扩大到背面，蛋转动时二边卵黄不易晃动，俗称为“边口发硬”。9胚龄：蛋转动时，二边卵黄容易晃动，背面尿囊血管迅速伸展越出卵黄，故俗称为“发边”。10胚龄：尿囊血管继续伸展，在蛋的小头合拢，整个蛋除气室外都布满了血管，俗称为“合拢”、“长足”。11胚龄：血管开始加粗，血管颜色开始加深，解剖背部出现绒毛，腺胃明显可辨。12胚龄：血管加粗、颜色逐渐加深。解剖身躯覆盖绒毛。13胚龄：主要观察小头发亮的部分随着胚龄的增长而逐日缩小。头部和身体大部分覆盖绒毛，跖、趾出现角质鳞片原基。14胚龄：小头发亮的部分随着胚龄增长而逐日缩小，蛋内黑影部分随着胚龄增长而加大，胚胎全身覆盖绒毛，头向气室，胚胎开始改变横着的位置，逐渐与蛋长轴平行。15胚龄：蛋内黑影部分增大。解剖观察，翅已完全成形，跖、趾的鳞片开始形成，眼脸闭合。体内外的器官大体上部形成了。16胚龄：黑影继续燕大，解剖冠和肉髯明显，绝大部分蛋自己进入羊膜腔。17胚龄：以小头对准光源，再看不到发亮的部分，俗称“封门”。躯干增大，脚、翅、颈变大、眼、头日益显小，两腿紧抢头部。喙向气室。18胚龄：气室向一方倾斜，这是胚胎转身的缘故，俗称为“斜口”、“转身”。解剖头弯曲在右翼下，眼开始睁开。19胚龄：喙进气室，开始呼吸，颈、翅突入气室，头埋右翼下，两腿弯曲朝头部，呈抢头姿势，以便于破壳时挣扎。雏胚开始啄壳，可闻雏鸣叫。照蛋时，可见气室有翅膀、喙、颈部的黑影闪动，俗称“闪毛”。20胚龄：起初是胚胎喙部穿破壳膜，伸入气室内，称为“起嘴”；接着开始啄壳，称“见嘌”、“啄壳”。20.5-21胚龄：出壳。2. 鸡的人工孵化鸡属鸟类，鸟类与哺乳动物胚胎发育不同，受精卵（种蛋）排出母体后完全依赖外界环境条件继续发育。第1-4天为内部器官发育阶段；5-14天为外部器官形成阶段；15-19天为胚胎生长阶段；20-21天为出壳阶段。在整个孵化过程中，温度，湿度，通风换气与翻蛋等外界条件将是保证胚胎正常发育，并使孵化获得成功的关键因素。（1）温度：温度是孵化过程的首要条件，发育中的鸡胚对温度最敏感，只有在适宜的温度下，才能保证鸡胚的正常生长发育和物质代谢。所以正确地掌握孵化温度是提高孵化率的