转录组测序技术原理及应用.ppt

RNA测序技术原理及应用 遗传的中心法则 基因组 转录组 表观遗传组 蛋白组层次 什么是转录组 RNA是解读基因组的关键 RNA Protein Phenotype Genotype DNA RNA测序技术 WorkflowofRNA Seq 样品检测文库制备ClusterStationIlluminaSequencing生物信息分析 TotalRNA样品检测 Agilent2200检测OD260 280 1 8 2 2RNA28S 18S 1 0 RIN 7 新型安捷伦2200TapeStation系统是新一代测序 NGS 生物微阵列芯片分析和qPCR工作流程以及蛋白质纯化和抗体生产过程中对生物样品进行质量控制 QC 的理想解决方案 可扩展的通量 16联或96孔微量滴定板 快速得到结果 平均每个样品只需一分钟便可获得结果 使用简单 可直接使用的ScreenTape预制胶条简化了工作流程 样品用量少 每次运行仅需要不到2ul样品 检测报告 合格样品 棉铃虫 果蝇 检测报告 不合格样品 WorkflowofRNA Seq 样品检测文库制备ClusterStationIlluminaSequencing生物信息分析 真核mRNA的纯化 mRNA的纯化主要通过的磁珠与生物素吸附原理从而分离纯化Oligo dT 25磁珠纯化原理主要是mRNA的3 的polyA与磁珠在bindingbuffer的作用下相结合 磁珠通过MPC 磁分离器 从溶液中分离出来 mRNA与磁珠结合后 再用Tris HCL在加热条件下解离洗脱到溶液中 链霉亲合素包被磁珠 生物素标记Oligo dT 25 poly A 原核mRNA的纯化 AmbionMICROExpressKit LNA扣锁型探针 mRNA反转录 fragment RT 纯化过的mRNA样品加入1 l的fragmentbuffer70 作用1 5min 加入1 l的stopbuffer终止反应 加入沉淀剂 NaAc糖原无水乙醇 沉淀产物 RTdscDNA 末端修复 防止自连 cDNA3 末端加AAdapter连接 第一天 消化DNA mRNA的分离 mRNA的打断 cDNA的合成 第二天 末端修复 加接头 胶回收 3 端加A 第三天 PCR PCR胶回收 文库制备 文库质量检测 Aligent2100 片段大小 纯度 浓度qPCR 片段大小 浓度手工检测 跑胶验证 WorkflowofRNA Seq 样品检测文库制备ClusterStationIlluminaSequencing生物信息分析 HiSeq2500 ApplicationsofRNA Seq 17 RNA Seq Transcriptome WorkflowofRNA Seq Transcriptome 生物信息学分析 RNA Seq Transcriptome Characterizethetranscriptomeinunparalleleddetail Technique2 20 RNA Seq Denovotranscriptomeassembly RNA Seq Transcriptomeresequencing RNA Seq Denovotranscriptomeassembly 文库构建 测序 组装 Denovoassembleatranscriptome组装流程 数据产出统计及测序数据的成分和质量评估组装结果分析 Contig长度分布 Scaffold长度分布 Unigene长度分布 Unigene transcript 功能注释Unigene的GO分类Unigene代谢通路分析预测编码蛋白框 CDS Unigene表达差异分析 两个或两个以上样品 Unigene在样品间的差异GO分类 需两个或两个以上样品 和Pathway富集性分析 Denovoassemblytranscriptome信息分析主要内容 Denovoassemblytranscriptome信息分析流程 Unigenes的GO注释 Pathway分析 RNA Seq Transcriptomeresequencing cDNA文库构建 测序 比对到参考序列 Transcriptomeresequencing比对流程 比对统计基因表达注释基因差异表达分析基因结构优化可变剪接分析预测新转录本cSNP分析 Transcriptomeresequencing信息分析主要内容 Transcriptomeresequencing信息分析流程 应用 优化转录组注释信息 基因结构优化可变剪接鉴定基因融合鉴定RNA水平SNP分析 Genomicintergenicregion Readscluster PairedReadsdistribution 优化基因结构鉴定新的转录本 Paired End PE Reads Reads比对到参考序列基因间区域 鉴定可变剪接 AlternativeSplicing exon1 exon2 exon3 exon1 exon2 exon3 exon1 exon3 commonreads junctionreads mRNA 鉴定基因融合 分析RNA水平SNP 转录组重测序比对软件 SOAPDenovo转录组测序 组装软件 SoapDenovo比对软件 SoapSNP 36 转录组研究技术横向比较 转录组测序的优势 RNA测序与芯片检测基因数比较 RNA测序与芯片检测基因的表达量分布 GenomeRes2010 Case 实验材料收集 叶片 花序 果实 根时间点 0 4 8 12 16 20和24h将每个时间点采集的样品均匀混合测序策略 Illumina测序 1Gdata 1 Highlight2 Heat3 Cold4 Salt5 Drought 抗逆相关可变剪接 外包膜蛋白16 AT2G28900 Intron retention Control LowTemperatureResistance 低温胁迫相关的AS 低温胁迫下这个内含子和对照相比被保留了下来 揭示了可变剪接有重要功能 AS调节机制 CCA1 生物钟相关基因 例如调节气孔的开关等 RNA Seq单端测序 Quantification 等同于数字表达谱 DGE WorkflowofRNA Seq单端测序 Quantification 生物信息学分析 RNA Seq单端测序 Quantification 生物信息分析内容 测序数据评估筛选差异表达基因表达模式聚类分析GO功能富集分析Pathway富集分析蛋白互作网络分析 RNA Seq单端测序 Quantification 信息分析流程 RNA Seq与基因芯片优缺点比较 case PlantPhysiology2010 取样 选取在成熟季节开花后5 10 和15个星期葡萄分别代表葡萄果实成熟中的三个时期 postsetting ve raison和ripening 数据量 超过59Mreads数据 长度在36 44bp之间 运用RNA Seq技术对葡萄果实发育过程中复杂转录特征的研究 表二reads在基因组上的分布情况 表一测序数据 葡萄RNA Seq单端测序 浆果发育三个阶段共有 特有基因表达分布图 基因表达量分布 表达簇的分类分布情况 差异表达的基因GO功能注释 分成了19个功能类群 按照基因在三个不同时期的表达趋势进行分类 分成8个clust