端粒酶活性检测方法.doc

端粒酶活性检测方法1. 端粒重复序列延伸法端粒酶在体外可以以其自身RNA的模板区为模板，在适宜的寡核苷酸链的末端添加6个碱基的重复序列，用聚丙烯酰胺(PAGE)凝胶电泳可显示6个碱基差异的梯带。1994年Kim建立了基于PCR基础上的端粒重复序列扩增法(Telomeric Repeat Amplification Protoc01TRAP)。首先合成一个18nt的TS做上游引物，端粒酶结合TS末端的GTT并合成AGGGTrAG，然后每经过一次转位合成一个GGTTAG的6碱基重复序列，端粒酶灭活后，加入一个24nt的CX做下游引物，经过多次变性-退火-延伸，扩增端粒酶延伸产物。1994年Kim创建了该方法，它与DNA聚合酶分析方法相似，如；把核酸提取物、代表脊椎动物端粒重复序列的单链DNA前体(T1AGGG)4和放射标记的磷酸脱氧核糖一起孵育，然后通过放射自显影检测凝胶上新添加的DNA重复序列。此方法是最早建立的方法，它稳定性好。其缺点是，需要样本量大，敏感性差，检测时间长，不适合临床标本的大量检测，检测时需同位素量较大。此法已基本被淘汰2. TRAP法及其改进（关键是我们有没有PCR扩增机、电泳 自显影及图像分析）其基本原理是利用CHAPS去污剂提取端粒酶后，将反应体系中下游引物CX(5-(CCATTA)3CCCTAA-3用石蜡层与其他反应隔开，在石蜡层上利用端粒酶的逆转录酶活性在非端粒核酸TS(5AACCGTCGAGCAGAGTT-3)引物3末端合成端粒重复序列，然后将反应产物进行PCR扩增，石蜡层在高温时溶化，CX(引物加入到反应体系中，反应体系中含有(a-32P)dGTP或（a-32P）CTP。由于端粒酶每合成一个TTAGGG就需要RNA模板重新定位，因此，反应产物在聚丙烯酰胺凝胶电泳上显示为相隔6bp的梯状条带，TRAP法由于利用PcR技术对端粒酶合成的端粒DNA进行扩增，因此能从104个正常细胞中检出混杂在其中的一个肿瘤细胞，这大大提高了检测的敏感性、速度和效果。此方法较可靠，目前应用最多。但TRAP方法的缺点在于：电泳结果与端粒酶活性程度呈非线性相关，使得测定端粒酶相对活性较困难；8h至两天，时间太长改进法一：TRAP银染法们利用银离子与DNA结合的原理， 把TrAP反应物在聚丙烯酰胺凝胶电泳后进行银染显示梯状条带，此方法的结果与同位素TRAP方法一样可靠、灵敏。法二：接近闪烁分析法为了解决聚丙烯酰胺凝胶电泳操作繁琐等问题，有人利用接近闪烁分析技术，在96孔板上进行TRAP操作，使大规模筛选临床标本成为可能，其基本原理是将CX引物5端用生物紊标记，2iMe-3HTTP取代a一32PdGTP，PcR扩增31个循环，吸取反应物与链霉抗生素蛋白包被的液态微球相混合，由于生物素3H标记的反应产物与微球相结合，因此当其接近反应发生器时，能激发含有3H的核酸液闪，从而产生信号，并由液闪计数仪计数，未结合3H标记的游离核酸其能量被吸收在分析缓冲液中，不能激发液闪，故不会干扰实验结果。法三：TRAPELISA法（TRAPELISA试剂盒）先扩增，引物TS含生物素，扩增产物与包被有亲和素的微孔板结合，并与含地高辛标记的探针杂交，酶标记抗地高辛抗体与之结合而显色，酶标仪测定结果，根据颜色的深浅进行半定量分析。TrAP的几种方法的具体步骤我也有，但比较复杂，不好写出来，字母混乱很难复制